新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗体检测试剂的制作方法

新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体检测试剂
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型冠状病毒(sars-cov-2)igm/igg抗体检测试剂。


背景技术：

2.载脂蛋白apoa i(apolipoproteinai)由243个氨基酸残基组成，分子质量为28.3kd，主要在肝脏中合成，是高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，hdl)的重要组分，也是hdl功能的主要执行者。apoa i在胆固醇的转运和代谢、抗动脉粥样硬化、抗内毒素、抗炎、抗病毒及抑制急性相炎症反应造成的组织损伤中起重要作用。
3.新型冠状病毒(sars-cov-2)是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征(sars)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，它的传播途径有直接传播、气溶胶传播、接触传播，传染性极强，因此对于新型冠状病毒的确诊变得非常重要。
4.对该病毒的检测主要采用荧光定量pcr的方法进行核酸检测，实际工作中由于标本类型、采集方式间差异易导致核酸检测的阳性率降低；同时核酸检测的时间长，对实验室生物安全等级要求高，不便于各基层医院普遍开展。病毒感染人体后，其igm抗体约在5～7天产生，而igg抗体可在10～15天产生。因此，检测人体血清中sars-cov-2的igg和igm含量对于新型肺炎的普查及确诊具有重要的意义。
5.目前市面上已有许多的新冠igg/igm快速检测试剂盒，大多数采用的是间接法检测，但由于该方法学自身的缺陷以及抗原存在非特异性的吸附，导致普遍存在背景值高，灵敏度差的缺陷。因此，探索一种降低igg/igm检测背景信号，提高试剂灵敏度的技术具有重要的应用价值。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于解决现有的新冠检抗体测试剂中本底高导致检测灵敏度低，检测结果不准确的问题。本发明发现在检测试剂中添加多聚apoaⅰ能够有效的降低新冠检测试剂的背景信号，提高检测试剂的灵敏度。
8.apoaⅰ是血浆脂蛋白中的蛋白质部分，能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用的蛋白质。apoaⅰ是由243个氨基酸残基组成，是单一多肽链，分子量为28.3kd。
9.多聚apoaⅰ指的是apoaⅰ的聚合形式，多聚apoaⅰ的分子量大于76.6kd。
10.多聚apoaⅰ可通过物理或者化学方法使得apoaⅰ单体聚合形成多聚体的形式。例如可以通过加热处理apoaⅰ得到其多聚体，可通过辐射照射apoaⅰ得到其多聚体，可添加蛋白变性剂得到apoaⅰ多聚体。
11.出乎意料的是，现已发现，在检测新冠的抗体试剂中添加多聚apoaⅰ可以明显的减少检测背景信号，提高检测灵敏度。
12.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
13.本发明提供了多聚apoaⅰ在制备新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体检测试剂中的用途。
14.本发明提供了添加多聚apoaⅰ在制备新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体检测试剂中的用途，可以降低检测中本底的干扰，降低噪音提高检测灵敏度。
15.本发明的一些实施例中，多聚apoaⅰ可以添加在新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体检测试剂中的样品稀释液中，也可以添加在标记液中。
16.本发明的一些实施例中，多聚apoaⅰ的工作浓度是0.01mg/ml-2mg/ml，在一些实施例中多聚apoaⅰ的工作浓度是0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml；在另一些实施例中，多聚apoaⅰ的工作浓度是0.1mg/ml-1.5mg/ml，在一些实施例中多聚apoaⅰ的工作浓度是、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、1.5mg/ml、1.4mg/ml、1.3mg/ml；在另一些实施例中，多聚apoaⅰ的工作浓度是0.4mg/ml-1.2mg/ml，在一些实验中多聚apoaⅰ的工作浓度是0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/mll、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml。
17.本发明还提供一种新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体检测试剂，包括样品稀释液和标记液，其中样品稀释液和/或标记液中含有多聚apoaⅰ。
18.本发明提供的新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体检测试剂中，多聚apoaⅰ的工作浓度是0.01mg/ml-2mg/ml，在一些实施例中多聚apoaⅰ的工作浓度是0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml；在另一些实施例中，多聚apoaⅰ的工作浓度是0.1mg/ml-1.5mg/ml，在一些实施例中多聚apoaⅰ的工作浓度是、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、1.5mg/ml、1.4mg/ml、1.3mg/ml；在另一些实施例中，多聚apoaⅰ的工作浓度是0.4mg/ml-1.2mg/ml，在一些实验中多聚apoaⅰ的工作浓度是0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/mll、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml。
19.本文中使用的术语“工作浓度”指的是实际检测中用的浓度。
20.本发明还提供一种侧向免疫层析检测sars-cov-2抗体的检测试剂盒，试剂盒包括侧向免疫层析卡和样品稀释液，样品稀释液中含有多聚apoaⅰ。
21.本发明还提供一种检测新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体的免疫检测试剂盒，试剂盒中的样本稀释液中含有多聚apoaⅰ。
22.本发明还提供一种检测新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体的免疫检测试剂盒，试剂盒中的标记液中含有多聚apoaⅰ。
具体实施方式
23.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
24.除非特殊说明，本发明实施例所用的化学试剂，均为分析纯，购自sigma-aldrich公司。所用的化学发光检测仪为中国北京滨松光子技术股份有限公司滨松bhp9507化学发光检测仪。
25.实施例1多聚apoaⅰ的制备：
26.1.收集50l血清，加250ml 10％多阴离子和2mol/l氯化钙2500ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，收集上层液。
27.2.上层液添加盐酸胍到6mol/l，37℃保温3小时，离心使载脂蛋白分离出来，用生理盐水透析除去盐酸胍，用kbr调节密度到1.21g/cm3，再次离心，收集离心管下三分之一段的溶液，用生理盐水透析除去kbr,再用6mol/l尿素透析。
28.3.用deae-sepharosecl6b柱梯度层析，收集主峰即为apoaⅰ纯品，透析去除尿素，用岛津-uv2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，总计apoaⅰ含量约25g，调节apoaⅰ浓度至10g/ml。
29.4.将10g/ml的apoaⅰ在37℃水浴锅中孵育10h，用sepharose g-25柱梯度层析，收集主峰即为多聚体apoaⅰ。
30.实施例2多聚apoaⅰ在化学发光新型冠状病毒(sars-cov-2)igg抗体检测中的测试：
31.1.采用本领域技术人员已知的常规的制备方法，制备一组样品稀释液中含有多聚apoaⅰ的化学发光试剂盒一组不含多聚apoaⅰ的常规化学发光试剂盒。
32.组分成分/用途r1样本稀释液(实验组含0.5mg/ml多聚apoaⅰ)r2磁珠包被的新冠n或s抗原r3碱性磷酸酶标记的抗人igg抗体化学发光底物amppd清洗浓缩液用于配置清洗液(pbst)质控品交联了人源抗体的羊多抗
33.r1可采用常规配方，含有磷酸盐缓冲对、无机盐、表面活性剂、防腐剂。
34.2.通过以下步骤进行检测：
35.(1)在反应杯中加入10ul血清样本或者10ul质控品，50ul r1和50ul r2；
36.(2)37℃孵育5min，清洗四遍后添加100ul的r3；
37.(3)37℃孵育5min，清洗四遍后添加化学发光底物读数。
38.3.检测结果：
[0039][0040]
从上述结果可以看出添加多聚apoai组阴性血清的背景信号值降低了40％-50％，信噪比(p/n)提高了90％以上，显著提高试剂灵敏度。
[0041]
实施例3多聚apoaⅰ在化学发光新型冠状病毒(sars-cov-2)igm抗体检测中的测
试：
[0042]
1.采用本领域技术人员已知的常规的制备方法，制备一组样品稀释液中含有多聚apoaⅰ的化学发光试剂盒一组不含多聚apoaⅰ的常规化学发光试剂盒。
[0043][0044][0045]
r1可采用常规配方，含有tris缓冲对、无机盐、表面活性剂、防腐剂。
[0046]
2.通过以下步骤进行检测：
[0047]
(1)在反应杯中加入10ul血清样本或者10ul质控品，50ul r1和50ul r2；
[0048]
(2)37℃孵育5min，清洗四遍后添加100ul的r3；
[0049]
(3)37℃孵育5min，清洗四遍后添加化学发光底物读数。
[0050]
3.检测结果：
[0051][0052]
从上述结果可以看出添加多聚apoai组阴性血清的背景信号和质控信号都有显著降低，阴性血清样本下降了77％-78％，信噪比提高了43％-55％，显著提高试剂灵敏度。
[0053]
实施例4不同浓度多聚apoai在化学发光新型冠状病毒(sars-cov-2)igg或igm抗体检测中的测试：
[0054]
按上述实施例3或者实施例4的方法，制备含不同浓度的多聚apoai的稀释液，在化学发光新型冠状病毒(sars-cov-2)igg或igm抗体检测中测试，结果如下：
[0055]
igm检测结果信噪比(p/n)：
[0056][0057]
在igm检测中，样品稀释液中添加0.01mg/ml-2.0mg/ml的多聚apoai都能够降低阴性血清和质控品的发光值，并且与未添加多聚apoai相比，信噪比都有所提高，增强了检测试剂的灵敏度。
[0058]
igg检测结果信噪比(p/n)：
[0059][0060][0061]
在igg检测中，样品稀释液中添加0.01mg/ml-2.0mg/ml的多聚apoai能够降低阴性血清的发光值和提高质控品的发光值，并且与未添加多聚apoai相比，信噪比都有所提高，增强了检测试剂的灵敏度。
[0062]
实施例5多聚apoai应用在侧向免疫层析检测新型冠状病毒(sars-cov-2)抗体的检测试剂中
[0063]
购买市场上已有的新型冠状病毒(2019-ncov)igm/igg抗体检测试剂盒(胶体金法)试剂盒(a厂家)，取试剂盒中的样品稀释液分成2份，一份添加多聚apoai至1mg/ml，一份不做任何处理。检测300人份核酸检测为阴性的血清，结果如下：
[0064] 阴性结果阳性结果准确率对照2851595％多聚apoai297399％
[0065]
从上述结果可以看到在样品稀释液中添加有多聚apoai，可以提高胶体金检测新型冠状病毒(2019-ncov)igm/igg的准确率，有效减少假阳性的结果。
[0066]
实施例六在标记液中添加多聚apoai检测新型冠状病毒(sars-cov-2)igg抗体检测中的测试。
[0067]
1.采用本领域技术人员已知的常规的制备方法，制备一组标记液(r3)中含有多聚apoaⅰ的化学发光试剂盒一组不含多聚apoaⅰ的常规化学发光试剂盒。
[0068][0069]
r1可采用常规配方，含有碳酸盐缓冲对、无机盐、表面活性剂、防腐剂。
[0070]
2.通过以下步骤进行检测：
[0071]
(1)在反应杯中加入10ul血清样本或者10ul质控品，50ul r1和50ul r2；
[0072]
(2)37℃孵育5min，清洗四遍后添加100ul的r3；
[0073]
(3)37℃孵育5min，清洗四遍后添加化学发光底物读数。
[0074]
3.检测结果：
[0075][0076]
从上述结果可以看出添加多聚apoai组阴性血清的背景信号值降低了40％-50％，信噪比(p/n)提高了95％以上，显著提高试剂灵敏度。
[0077]
实施例七在标记液中添加多聚apoai检测新型冠状病毒(sars-cov-2)igm抗体检测中的测试
[0078]
1.采用本领域技术人员已知的常规的制备方法，制备一组标记液(r3)中含有多聚apoaⅰ的化学发光试剂盒一组不含多聚apoaⅰ的常规化学发光试剂盒。
[0079][0080][0081]
r1可采用常规配方，含有磷酸盐缓冲对、无机盐、表面活性剂、防腐剂。
[0082]
2.通过以下步骤进行检测：
[0083]
(1)在反应杯中加入10ul血清样本或者10ul质控品，50ul r1和50ul r2；
[0084]
(2)37℃孵育5min，清洗四遍后添加100ul的r3；
[0085]
(3)37℃孵育5min，清洗四遍后添加化学发光底物读数。
[0086]
3.检测结果：
[0087][0088]
从上述结果可以看出添加多聚apoai组阴性血清的背景信号和质控信号都有显著降低，阴性血清样本背景值下降了70％以上，信噪比提高了43％-55％，显著提高试剂灵敏度。
[0089]
通过上述不同方法学的检测结果可以看到，添加多聚apoai在样品稀释液中或标记液中都可以提高抗体的检测灵敏度或准确性而不受检测方法学的影响。
[0090]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。