一种用于体液鉴定的蛋白质标志物筛选方法

1.本发明涉及一套用于体液鉴定的蛋白质标志物筛选方法，涵括质谱基于dda、dia进行样本采集，结合hpa项目筛选及mrm/prm验证整套流程，可应用于犯罪现场对循环血液、月经血、尿液、唾液、精液等体液的鉴定。


背景技术：

2.法医血清学指对犯罪现场相关的人体体液(血液、精液、唾液、阴道液、经血等)的区分，重要的是实现体液类型区分而非来源者的识别(forensic sci.internat.,2019,297,350)，对于刑事事件的判定十分重要。传统的体液鉴定方法包括有基于信使rna转录物(forensic sci.internat.，2015,5,e441)、microrna表达谱(methods mol.biol.2013,1024,221)、差异表观遗传修饰(pyrosequencing methods protocols 2015,1315,397)、拉曼光谱模式(biophotonics 2014,7,59)等，这些方法各有优缺点，如灵敏度性、特异性、使用性方面都存在严重的局限性。
3.蛋白质组学因其可在一次测定中鉴别多达几千个蛋白质标志物(mol.systems biol.2011,7,548)，增加了生物法医学分析所需的准确度和特异性，被广泛应用于法医学鉴定。vansteem构建了通过非靶向蛋白质组学的方法获得不同生物体液的蛋白质列表，再筛特定的生物标记物靶向检测蛋白来实现体液区分(int.j.legal med.,2013,127,287)的策略；legg筛选了23种生物标志物，在50个个体中检测了循环血、阴道/月经液、精液、尿液和唾液中标志物的检出情况(electrophoresis 2017,38,833)，对于精液、尿液和唾液可有特定标志物，但对于循环血、阴道/月经液这种性质相近的体液尚未能实现稳定区分，主要原因在于样品蛋白质覆盖深度及样品间重现性仍有待提高。
4.因此，实现体液标志物的筛选，需要更特异性、高深度、高重现性的蛋白质组学策略，筛选可分基于理论和实践两部分进行。第一部分通过人类蛋白质图谱项目(protein sci 2018 01；271)筛选组织特异性蛋白作为候选生物标志物。hpa通过免疫组织化学和免疫细胞化学绘制了蛋白质在人体组织和细胞中定位和表达，可查看器官、细胞器等结构的蛋白质列表或根据表达水平对蛋白质进行分类。因此，通过hpa网站可查询到与相关体液产生或途径相关的组织，根据注释的生物功能辅助筛选体液中特异表达蛋白质作为候选标志物。第二部分，通过实际样品筛选差异表达蛋白作为候选生物标志物。常用样品采集方法有dda、或dia/swath，后者由于将所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂，从而可以获得完整的肽段信息，相比dda实现了更大的动态范围、更高的鉴定再现性和更高的定量灵敏度和准确性(nat commun,2020,02,07,11)。虽然dia存在更多优势，但由于其谱图复杂，数据解析更为困难，常见方法有使用基于dda建立蛋白谱图库解析以及基于序列数据库检索，但基于蛋白库解析比基于序列数据库检索具有更高的鉴定和定量重现性，变异系数平均下降30％以上，缺失值减少35％以上(j proteome res 2020,07,198)。目前已开发众多dia算法，如msplit-dia(nat methods,2015,12,1212),dia-nn(nat methods,2020,01,171)等，以实现更好的dia数据解析。通过两部分组合筛选，可获得可信度更高、更具特异性
的体液鉴定标志物列表，进而使用靶向监测标志物在样品中的出现情况，获得能稳定区分体液的标志物组合。


技术实现要素：

5.本发明涉及一套用于体液鉴定的蛋白质标志物筛选方法，涵括质谱基于dda、dia/swath进行样本采集，结合hpa项目筛选及mrm/prm验证整套流程，可应用于犯罪现场对循环血液、月经血、尿液、唾液、精液等体液的鉴定。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.1、体液样品按每毫克蛋白加100-200mm二硫苏糖醇，30-100℃反应1.0-2.0h,以实现蛋白质的还原；再按每毫克蛋白加入100-400mm碘乙酰胺，避光条件下反应30-60min，以实现蛋白质的烷基化；按照酶/蛋白比例为1:30至1:50(w/w)加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜得到肽段。
8.2、取所有体液样品的部分酶解肽段混合，利用碱性条件下的反相色谱、强阳离子交换色谱、强阴离子交换色谱、体积排阻色谱或毛细管电色谱中的一种进行第一维分离，收集分离的馏分。
9.3、将收集的馏分分别进行lc-ms分析，采用dda模式采集：按照母离子选取丰度排名前二十、二十一、二十二、二十三、二十四、二十五的其中一种，或三秒一次循环的扫描方式，对母离子进行hcd或cid模式高能碎裂，分别检测其产生的子离子信息，并通过数据库检索得到相应的蛋白结果。使用蛋白质组数据检索软件将所有馏分合并搜库，获得所有馏分合并的dda建库蛋白质列表。
10.4、将样品分别进行dia/swath分析：dia/swath分析前，先用所有样品混样进行常规dda质谱采集，根据结果中峰宽及肽段分布分别优化dia/swath的二级采集窗口及循环时间；设好dia/swath的采集参数后，将样品分别进行液质联用分析。
11.5、将获得的dia/swath数据用可进行数据非依赖性采集分析的蛋白质组数据检索软件如peakview、msplit-dia、dia-nn、spectronaut等，与建立的体液蛋白质文库比对相应保留时间或根据特征谱图提峰，得到相应的每个体液样品的蛋白列表。
12.6、筛选可分两部分进行，第一部分通过卡dia/swath蛋白结果中
13.p-value小于0.05，且样品间强度比值大于2的蛋白质作为候选生物标志物；第二部分结合hpa筛选，首先进入the human protein atlas网站，选择与相应体液产生相关的组织图谱(tissue atlas)，并选择组织上调蛋白质。筛选两部分共有的蛋白质，作为可区分不同体液的候选生物标志物。
14.7、将获得的标志物列表进一步用mrm/prm验证，使用skyline软件获得候选标志物蛋白质的母离子或母离子－子离子对，在质谱方法中设置仅扫描给定目标蛋白质信号。统计候选标志物在所有样品间的出现情况，选择仅在一种体液中出现且检出概率较大的蛋白组合，共同作为体液鉴定的标志物。
15.本发明具有如下优点：
16.1、由于dia/swath二级全扫描的特征，可对高低丰度肽段进行无偏差检测，从而样品不去除高丰度蛋白即可实现深度覆盖，减少样品前处理时间，更经济快捷。
17.2、使用dda建库对比基于数据库检索，可帮助dia/swath结果分析，进一步减少样
品间变异系数，减少缺失值。
18.3、结合hpa项目中组织特异蛋白，和样品结果差异表达蛋白共同筛选，从理论和实际两方面保障了筛选所得蛋白标志物的特异性及可信度。
19.4、本发明具有普适性，可实现对循环血液、月经血、尿液、唾液、精液等体液的鉴定。
附图说明
20.图1工作流程图。
21.图2实施例1结合hpa网站筛选流程。
22.图3实施例1样dda采集tic图。
23.图4实施例1样品swath采集tic图。
具体实施方式
24.实施例1
25.1.蛋白质变性还原烷基化，酶解
26.体液样品为循环血、月经血，首先使用8m尿素进行蛋白变性，样品分别按每毫克蛋白加100mm二硫苏糖醇，65℃反应1.0h,以实现蛋白质的还原；再按每毫克蛋白加入200mm碘乙酰胺，避光条件下反应20min，以实现蛋白质的烷基化；按照酶/蛋白比例为1:30(w/w)加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜得到肽段。
27.2.dda建库
28.将酶解肽段混合后先进行第一维色谱分离：流动相a相为体积浓度为2％乙腈溶液以及体积浓度为0.1％甲酸的水溶液，流动相b相为体积浓度为98％乙腈溶液以及体积浓度为0.1％甲酸的水溶液。色谱条件设置流速为1μl/min，梯度设置为0到10min使用100％的a相，10min到11min100％的a至95％a，11min到111min从95％a到75％a线性梯度分离100min，111min到126min再从75％a相到65％a相线性梯度分离15min。
29.色谱分离完成后进行lc-ms分析，使用eksigent m5微升液相偶联ab sciex 5600质谱。质谱采集使用dda数据采集模式，一级选择质量范围为300-1800m/z的肽段离子；二级质谱选择一级质谱信号最强的40个离子进行二次碎裂，碎裂模式为cid(碰撞诱导解离)。所有样品重复测定3次。
30.质谱数据采集完成后，使用protein pilot进行数据库搜索，参数设置：使用数据库为uniprot人库，蛋白质酶为胰蛋白酶，蛋白和肽段的fdr值小于0.1％。将所有馏分共同搜库，所得1423个蛋白即为dda建立的蛋白库。
31.3.swath分析
32.先用所有体液混合样本走一针质谱dda分析，液相、质谱参数与建库所用参数相同。根据dda一级母离子质量分布，优化swath质量采集窗口，共80个窗口，3秒一次循环，每个样品使用swath方法重复测定3次。
33.所得swath数据使用peakview软件处理，根据保留时间提取特定肽段获得其强度信息，对应不同蛋白强度信息，结果每个样品能定量到1325个蛋白。
34.4.候选标志物筛选
35.筛选分两部分进行，第一部分通过卡swath蛋白结果中p-value小于0.05，且样品间强度比值大于2的蛋白质作为候选生物标志物，如p09466，p54108，q9bqr3等；第二部分结合hpa筛选，首先进入the human protein atlas网站，选择与子宫内膜的组织图谱，并选择组织上调蛋白质如p09466，p54108等；外周血未筛选出组织特异性蛋白。筛选两部分共有的蛋白质如p09466，p54108，作为可区分月经血和循环血的候选生物标志物。
36.5.mrmhr验证
37.分别取体液样本进行mrmhr验证，使用skyline软件获得候选标志物蛋白质的母离子或母离子－子离子对，在质谱方法中设置仅扫描给定目标蛋白质信号。统计候选标志物在所有样品间的出现情况，选择仅在一种体液中出现且检出概率较大的蛋白组合，如蛋白p09466，p54108的组合仅在经血中出现，外周血中不出现，可作为区分月经血和循环血的标志物。
38.实施例2
39.1.蛋白质变性还原烷基化，酶解
40.体液样品为唾液、精液，首先使用8m尿素进行蛋白变性，样品分别按每毫克蛋白加100mm二硫苏糖醇，65℃反应1.0h,以实现蛋白质的还原；再按每毫克蛋白加入200mm碘乙酰胺，避光条件下反应20min，以实现蛋白质的烷基化；按照酶/蛋白比例为1:30(w/w)加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜得到肽段。
41.2.dda建库
42.将酶解肽段混合后先进行第一维色谱分离：流动相a相为体积浓度为2％乙腈溶液以及体积浓度为0.1％甲酸的水溶液，流动相b相为体积浓度为98％乙腈溶液以及体积浓度为0.1％甲酸的水溶液。色谱条件设置流速为1μl/min，梯度设置为0到10min使用100％的a相，10min到11min100％的a至95％a，11min到111min从95％a到75％a线性梯度分离100min，111min到126min再从75％a相到65％a相线性梯度分离15min。
43.色谱分离完成后进行lc-ms分析，使用eksigent m5微升液相偶联ab sciex 5600质谱。质谱采集使用dda数据采集模式，一级选择质量范围为300-1800m/z的肽段离子；二级质谱选择一级质谱信号最强的40个离子进行二次碎裂，碎裂模式为cid(碰撞诱导解离)。所有样品重复测定3次。
44.质谱数据采集完成后，使用protein pilot进行数据库搜索，参数设置：使用数据库为uniprot人库，蛋白质酶为胰蛋白酶，蛋白和肽段的fdr值小于0.1％。将所有馏分共同搜库，所得结果即为dda建立的蛋白库。
45.3.swath分析
46.先用所有体液混合样本走一针质谱dda分析，液相、质谱参数与建库所用参数相同。根据dda一级母离子质量分布，优化swath质量采集窗口，共80个窗口，3秒一次循环，每个样品使用swath方法重复测定3次。
47.所得swath数据使用peakview软件处理，根据保留时间提取特定肽段获得其强度信息，对应不同蛋白强度信息，结果每个样品能定量到995个蛋白。
48.4.候选标志物筛选
49.筛选分两部分进行，第一部分结合hpa筛选，首先进入the human protein atlas网站，选择组织图谱(tissue atlas)，并选择与精液产生相关的组织如睾丸，选择上调基因
对应的蛋白质，如q9y5r6、q8iv76；与唾液产生相关的组织如唾液腺，选择上调基因对应的蛋白质，如q96dr8。第二部分通过卡dia/swath蛋白结果中p-value小于0.05，且样品间强度比值大于2的蛋白质共同作为候选生物标志物，如精液中上调蛋白q9y5r6，唾液中上调蛋白p02814。筛选两部分共有的蛋白质如q9y5r6、p02814，作为可区分精液与唾液的候选标志物。
50.5.mrmhr验证
51.分别取体液样本进行mrmhr验证，使用skyline软件获得候选标志物蛋白质的母离子或母离子－子离子对，在质谱方法中设置仅扫描给定目标蛋白质信号。统计候选标志物在所有样品间的出现情况，如q9y5r6仅在精液中出现，p02814仅在唾液中出现，故可作为区分精液和唾液的标志物。
52.实施例3
53.1.蛋白质变性还原烷基化，酶解
54.体液样品为循环血、月经血，首先使用8m尿素进行蛋白变性，分别按每毫克蛋白加100mm二硫苏糖醇，56℃反应1.0,以实现蛋白质的还原；再按每毫克蛋白加入100-400mm碘乙酰胺，避光条件下反应30-60min，以实现蛋白质的烷基化；按照酶/蛋白比例为1:30至1:50(w/w)加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜得到肽段。
55.2.dda建库
56.将酶解肽段混合后先进行第一维色谱分离：流动相a相为体积浓度为2％乙腈溶液以及体积浓度为0.1％甲酸的水溶液，流动相b相为体积浓度为98％乙腈溶液以及体积浓度为0.1％甲酸的水溶液。色谱条件设置流速为1μl/min，梯度设置为0到10min使用100％的a相，10min到11min100％的a至95％a，11min到111min从95％a到75％a线性梯度分离100min，111min到126min再从75％a相到65％a相线性梯度分离15min。
57.色谱分离完成后进行lc-ms分析，质谱型号为easy nano液相耦合qe plus质谱，使用dda数据采集模式。一级质谱选择质量范围为300-1800m/z的肽段离子；二级质谱选择一级质谱信号最强的20个离子进行二次碎裂，分离窗口为2.0da，碎裂模式为高能粒子碰撞。所有样品重复测定3次。
58.质谱数据采集完成后，使用spectronaut进行数据库搜索，参数设置：使用数据库为uniprot人库，蛋白质酶为胰蛋白酶，蛋白和肽段的fdr值小于0.1％。将所有馏分共同搜库，所得结果即为dda建立的蛋白库。
59.3.dia分析
60.先用所有体液混合样本走一针质谱dda分析，液相、质谱参数与建库所用参数相同。根据dda一级母离子质量分布，优化dia质量采集窗口，共80个窗口，3秒一次循环，每个样品使用dia方法重复测定3次。
61.所得dia数据使用spectronaut软件处理，使用基于谱图库的检索方式，结果每个样品能定量到685个蛋白。
62.4.候选标志物筛选
63.筛选分两部分进行，第一部分通过卡dia蛋白结果中p-value小于0.05，且样品间强度比值大于2的蛋白质作为候选生物标志物，如p09466，p54108，q9bqr3等；第二部分结合hpa筛选，首先进入the human protein atlas网站，选择与子宫内膜的组织图谱，并选择组
织上调蛋白质如p09466，p54108等；外周血未筛选出组织特异性蛋白。筛选两部分共有的蛋白质如p09466，p54108，可作为月经血与循环血区分的候选标志物。
64.5.mrm/prm验证
65.分别取体液样本进行prm验证，使用skyline软件获得候选标志物蛋白质的母离子或母离子－子离子对，在质谱方法中设置仅扫描给定目标蛋白质信号。统计候选标志物在所有样品间的出现情况，如p09466，p54108仅在月经血中出现，可作为月经血与循环血区分的标志物。