一种高通量自动化的单细胞蛋白质组样品处理方法

1.本发明涉及一种高通量自动化的单细胞蛋白质组学样品处理方法，是一种结合高通量单细胞分选、原位单细胞蛋白质样品处理、紫外辅助快速酶解以及全自动化上样的方法，旨在提高单细胞蛋白质组样品处理的回收率和分析通量。


背景技术：

2.细胞是生命体最基本的功能单元。由于遗传信息表达随机性以及微环境变化等因素，细胞之间的异质性普遍存在，并在生物发育和疾病发展等过程中起着关键作用。基于群体细胞的常规分析反映的是平均值，往往会掩盖细胞间的差异，因此需要在单细胞水平上研究细胞的异质性。然而，单细胞蛋白质组的规模化分析面临着巨大挑战：单个细胞的蛋白质含量极低，且无法像基因一样进行扩增；同一细胞中存在多种类型的蛋白质及其修饰，其丰度差异往往跨越10个数量级；只有对大量单细胞中的多种蛋白质进行定量分析，才能提供足够的数据发现复杂群体中的细胞异质性和功能特征，并揭示细胞间重要的相互作用。因此，单细胞蛋白质组学分析对灵敏度和通量有极高的要求。
3.目前，基于抗体的方法适合用于分析单细胞中感兴趣的低丰度蛋白质，然而受抗体非特异性的限制。与抗体方法相比，质谱方法具有较深的定量覆盖度，基于质谱的非靶向方法适合对单个细胞的蛋白质组进行全局分析，有利于发现未知的生物标志物或者揭示新的信号网络。
4.传统的群体细胞蛋白质组样品处理方法通常需要微克至毫克的样品起始量，处理流程包括蛋白质的提取、变性、还原、烷基化、脱盐和酶解等，这些操作通常在离线条件下完成，并且需要多步转移，因此会造成蛋白质样品的损失，不适合用于痕量样品如单细胞的分析。
5.近年来，单细胞蛋白质组样品处理方法取得了较大的发展。通过采用微型化的反应装置和自动化精密操作系统(anal chem,2018,90:5430-5438)、采取原位处理和机械裂解、将反应体积限制在纳升等策略(anal chem,2018,90:14003-14010)，可以有效提高样品回收率，为实现单细胞蛋白质组学的高灵敏质谱分析奠定了基础。然而，目前单细胞蛋白质组分析缺乏一体化的样品处理平台和自动化lc上样系统，不仅可能导致样品在转移过程中的损失，而且限制了单细胞蛋白质组学分析的通量。
6.针对当前单细胞样品处理方法需要离线上样、分析通量低等问题，我们发展了一种在lc-ms分析之前进行高通量单细胞分选、原位蛋白质组样品处理以及无转移直接上样的集成化方法，该方法能够实现全自动化的单细胞蛋白质组样品处理及lc-ms分析。通过结合紫外辅助快速酶解，以进一步提高单细胞蛋白质组样品处理的效率。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种全自动化单细胞蛋白质组学高通量样品处理方法。通过结合高通量单细胞分选、原位单细胞蛋白质高效提取、紫外辅助快速酶解以及自动化上
样的方法，在提高单细胞蛋白质组分析通量的同时，避免样品转移导致的损失以及人工操作造成的干扰，从而提高样品处理的回收率及分析结果的准确性。
8.为了实现该目的，本发明的技术方案是：
9.1、首先通过流式细胞荧光分选仪(facs)将单细胞分选至pcr 96孔板中，每孔分选得到一个细胞，立即采用平板离心机将含有细胞的液滴甩至孔底，细胞分选后将96孔板密封防止液滴挥发，立即进行下一步样品处理，或者置于-80℃冰箱保存。
10.2、在96孔板中原位进行单细胞蛋白质组样品处理。首先通过加热-冷却循环来裂解单细胞：加热步骤在pcr热循环仪中进行，加热温度为90℃，加热5分钟；然后将样品置于-80℃冰箱冷冻5分钟；加热-冷冻循环3次后细胞裂解，在90℃加热的同时实现蛋白变性。
11.3、为了提高单细胞蛋白质提取效率，通过自动化移液工作站在96孔板中预先加入质谱兼容的十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)表面活性剂，ddm的浓度为0.1％-4％(克/毫升)，体积为每孔100-200纳升。在完成单细胞分选、细胞裂解以及蛋白质提取后，向96孔板中加入三(2-羧乙基)膦(tcep)和碘乙酰胺(iaa)分别进行蛋白质的还原和烷基化，tcep和iaa的浓度分别为5mm和10mm，加入体积为每孔50-100纳升。
12.4、通过机器人移液系统在各个样品孔中加入胰蛋白酶(1-10纳克)，加入体积为每孔50-100纳升。然后将96孔板置于高功率(800-2000毫瓦)紫外交联仪中，紫外光照3-5分钟实现蛋白质的快速酶解。单细胞蛋白质组样品处理后的总体积约为每孔0.5-1微升。
13.5、对于上述单细胞蛋白质组样品处理流程，从单细胞分选到蛋白酶解仅需0.5-1小时即可完成。最后，将96孔板置于纳升液相色谱自动进样器，所获得的酶解产物可直接用于液相色谱-质谱分析，无需进行除盐、冻干等操作，并通过无转移方式实现自动上样。
14.6、将上述高通量自动化的单细胞蛋白质组样品处理方法应用于肿瘤细胞、免疫细胞、神经细胞的研究，通过高灵敏lc-ms分析揭示肿瘤细胞、免疫细胞、神经细胞的细胞异质性。
15.本发明具有如下优点：
16.1、实现了单细胞蛋白质组样品处理和lc-ms分析全流程的自动化，从而有效避免人工操作对单细胞分析结果造成的误差和干扰；
17.2、通过自动化移液平台进行批量化的样品处理，采用紫外光照法快速进行酶解，从而有效提高单细胞分析的通量；
18.3、原位进行单细胞蛋白质组样品处理，避免由于转移步骤导致的样品损失，有利于提高单细胞蛋白质组样品处理的回收率；
19.4、开放式的96孔板结构与各种样品处理方法兼容，可将其应用于单细胞蛋白质组学的无标记或标记定量分析。
附图说明
20.图1、单细胞蛋白质组样品处理流程图。
21.图2、采用单细胞蛋白质组样品处理及高灵敏度液质联用分析系统对单个巨噬细胞进行分析得到的质谱图。
22.图3、采用单细胞蛋白质组样品处理及高灵敏度液质联用分析系统对单个神经母瘤细胞进行分析得到的质谱图。
23.图4、采用单细胞蛋白质组样品处理及高灵敏度液质联用分析系统对单个食蟹猴卵母细胞进行分析得到的质谱图。
具体实施方式
24.实施例1
25.巨噬细胞的单细胞蛋白质组学无标记定量分析。操作步骤如下：
26.1.首先通过自动化移液工作站在96孔板中预先加入水或者质谱兼容的表面活性剂，如十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)，体积为每孔100纳升。然后通过流式细胞分选仪将悬浮于pbs中的巨噬细胞分选至96孔板内，每孔分选得到一个巨噬细胞。细胞分选后，立即采用平板离心机将细胞甩至孔板底部，并将孔板密封以防止液滴挥发。如果不及时进行样品处理，需要置于-80℃冰箱保存，进行下一步处理前通过离心收集样品。
27.2.在96孔板中原位进行单细胞蛋白质组样品处理。首先将96孔板置于pcr热循环仪中，90℃加热5分钟，再置于-80℃冰箱中冷冻5分钟，重复该加热-冷却循环3次以实现细胞裂解，在加热的同时进行蛋白质的变性。预先加入的ddm表面活性剂有利于促进蛋白质的提取，并且不需要在质谱分析前进行去除，ddm的浓度为0.1％(克/毫升)，体积为每孔100纳升。
28.3.通过自动化移液工作站在96孔板中加入三(2-羧乙基)膦(tcep)和碘乙酰胺(iaa)分别进行蛋白质的还原和烷基化，tcep和iaa的浓度分别为5mm和10mm，各加入体积为每孔100纳升。
29.4.在蛋白质提取及变性还原化等步骤后，通过自动化移液平台向各个样品孔中加入10纳克胰蛋白酶，体积为每孔100纳升。然后将96孔板置于高功率(800-2000毫瓦)紫外交联仪中进行快速酶解，紫外光照时间为5分钟。上述样品处理总时间为0.5-1小时，每孔样品总体积少于1微升。
30.5.最后将96孔板置于纳升液相色谱自动进样器，无需进行除盐、冻干等操作，单细胞酶解产物通过直接上样方式进行lc-ms分析。
31.6.通过高灵敏lc-ms联用系统进行巨噬细胞蛋白质组学的无标记定量分析，在单个巨噬细胞中鉴定421种蛋白质，说明原位单细胞蛋白质组样品处理有利于提高回收率和鉴定覆盖度。
32.实施例2
33.神经母瘤细胞的单细胞蛋白质组学无标记定量分析。操作步骤如下：首先在96孔板中加入质谱兼容的十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)表面活性剂(浓度为0.1％，体积为每孔100纳升)，然后通过流式细胞分选仪将悬浮于pbs中的神经母瘤细胞分选至96孔板内，每孔分选得到一个神经细胞，立即将细胞离心至底部，并将孔板密封以防止液滴挥发。之后通过3次加热-冷却循环来裂解细胞：在pcr热循环仪中以90℃加热5分钟，同时实现蛋白质的变性，再将样品置于-80℃冰箱中冷冻5分钟。为了进行原位单细胞蛋白质组样品处理，通过自动化移液工作站在96孔板中加入三(2-羧乙基)膦(tcep)和碘乙酰胺(iaa)进行蛋白质的还原烷基化，tcep和iaa的浓度分别为5mm和10mm，各加入体积为每孔100纳升，然后向各个样品孔中加入10纳克胰蛋白酶，体积为每孔100纳升，并置于高功率(800-2000毫瓦)紫外交联仪中进行快速酶解，紫外光照时间为5分钟。所得到的单细胞酶解产物直接进行lc-ms分析，
通过easy-nlc进样器实现自动上样，无需进行除盐、冻干等操作。通过高灵敏lc-ms联用系统对单个神经母瘤细胞进行无标记定量分析，鉴定到584种蛋白质，结合高通量的单细胞蛋白质组样品处理，有利于揭示大量单个神经母瘤细胞间的异质性。
34.实施例3
35.食蟹猴卵母细胞的单细胞蛋白质组学无标记定量分析。操作步骤如下：首先在96孔板中加入质谱兼容的十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)表面活性剂(浓度为0.1％，体积为每孔100纳升)，通过显微操作分离单个食蟹猴卵母细胞，将其转移至96孔板中，并将孔板密封以防止液滴挥发。之后通过3次加热-冷却循环来裂解细胞：在pcr热循环仪中以90℃加热5分钟，同时实现蛋白质的变性，再将样品置于-80℃冰箱中冷冻5分钟。为了进行原位单细胞蛋白质组样品处理，通过自动化移液工作站在96孔板中加入三(2-羧乙基)膦(tcep)和碘乙酰胺(iaa)进行蛋白质的还原烷基化，tcep和iaa的浓度分别为5mm和10mm，加入体积为每孔100纳升，然后向各个样品孔中加入10纳克胰蛋白酶，体积为每孔100纳升，并置于高功率(800-2000毫瓦)紫外交联仪中进行快速酶解，紫外光照时间为5分钟。所得到的单细胞酶解产物直接进行lc-ms分析，通过easy-nlc进样器实现自动上样，无需进行除盐、冻干等操作。通过高灵敏lc-ms联用系统在单个食蟹猴卵母细胞中鉴定到1049种蛋白质，对食蟹猴中生发泡时期(gv)和第一次减数分裂时期(m1)的单个卵母细胞进行蛋白质组定量分析，说明182种蛋白质存在显著差异。go分析结果表明差异蛋白参与发育、生物调控和代谢等多个重要生物学过程。
36.实施例4
37.免疫磁珠细胞分选(macs)及单细胞蛋白质组学分析。操作步骤如下：
38.1.超微磁珠间接标记和阳性分选策略用于分选cd4 /cd8 t细胞：离心收集细胞，采用pbe孵育液充分混匀细胞，加入一抗(终浓度为10-20微克/毫升)，4℃孵育30分钟。用20倍体积的pbe清洗细胞，再加pbe(0.3毫升)充分混悬细胞后，加入相应二抗包被的超微磁珠，混匀后置8-15℃孵育10-15分钟。然后安装分离柱置于磁场中，加入细胞悬浮液和pbe，在重力作用下流尽。取下分离柱插在试管口，加入pbe(1-2毫升)，用力推尽液体，用培养基清洗一次。
39.2.经过磁珠分选(macs)后的免疫t细胞用荧光抗体进行标记，与流式细胞荧光分选(facs)结合，进行单个免疫细胞的分选和检测。首先在96孔板中加入质谱兼容的十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)表面活性剂(浓度为0.1％，体积为每孔100纳升)，然后通过流式细胞分选仪将单个cd4 /cd8 细胞分选至96孔板中，立即将细胞离心至底部，并将孔板密封以防止液滴挥发。
40.3.通过3次加热-冷却循环来裂解细胞，将96孔板置于pcr热循环仪中，以90℃加热5分钟，同时实现蛋白质的变性，再将样品置于-80℃冰箱中冷冻5分钟。
41.4.为了进行原位单细胞蛋白质组样品处理，通过自动化移液工作站在96孔板中加入三(2-羧乙基)膦(tcep)和碘乙酰胺(iaa)进行蛋白质的还原烷基化，tcep和iaa的浓度分别为5mm和10mm，体积为每孔100纳升。
42.5.向各个样品孔中加入10纳克胰蛋白酶，体积为每孔100纳升，并置于高功率(800-2000毫瓦)紫外交联仪中进行快速酶解，光照时间为5分钟。
43.6.所得到的单细胞酶解产物直接进行lc-ms分析，通过easy-nlc进样器实现自动
上样，通过高灵敏lc-ms联用系统对单个免疫细胞进行无标记定量分析，从而揭示免疫细胞的异质性。
44.实施例5
45.神经母瘤细胞的单细胞蛋白质组学tmt标记定量分析。操作步骤如下：
46.1.首先在96孔板中加入质谱兼容的十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)表面活性剂(浓度为0.1％，体积为每孔100纳升)，然后通过流式细胞分选仪分别将单个神经母瘤细胞和群体细胞(50-200个神经母瘤细胞)分选至96孔板中，立即将细胞离心至底部，并将孔板密封以防止液滴挥发。
47.2.通过3次加热-冷却循环来裂解细胞：在pcr热循环仪中以90℃加热5分钟，同时实现蛋白质的变性，再将样品置于-80℃冰箱中冷冻5分钟。
48.3.为了进行原位单细胞蛋白质组样品处理，通过自动化移液工作站在96孔板中加入三(2-羧乙基)膦(tcep)和碘乙酰胺(iaa)进行蛋白质的还原烷基化，tcep和iaa的浓度分别为5mm和10mm，体积为每孔100纳升。
49.4.分别在单细胞及群体细胞样品中加入10纳克和100纳克胰蛋白酶(溶解于50mm三乙胺碳酸缓冲液)，体积均为每孔100纳升，并置于高功率(800-2000毫瓦)紫外交联仪中进行快速酶解，紫外光照时间为5分钟。
50.5.分别在单细胞及群体细胞的酶解产物中加入不同的tmt标签试剂(tmt试剂的浓度为20mm，体积为每孔100纳升)，室温下反应1小时。向各个样品孔中加入羟胺溶液以终止标记(浓度为0.5％，体积为每孔100纳升)，室温下反应15分钟，然后加入甲酸溶液进行酸化(浓度为2％，体积为每孔100纳升)，最后通过自动化移液系统将标记的单细胞和群体细胞样品混合，冻干后加入甲酸溶液(浓度为0.1％，体积为每孔1微升)复溶。
51.6.最后将得到的标记样品置于纳升液相色谱自动进样器，通过直接上样方式进行高灵敏lc-ms分析，根据二级质谱产生的报告离子的强度进行定量，结合多路标记方式以进一步提高神经母瘤细胞的分析通量。