一种以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物的制作方法

一种以rbd靶向递送shrna的ncovsirna药物
技术领域
1.本发明涉及一种以rbd靶向递送shrna的ncovsirna药物，属于传染病防治的生物制药领域。


背景技术：

2.新型冠状病毒的主要结构包括单股正链核酸(ssrna)、刺突蛋白(s)、膜蛋白(m)、包膜蛋白(e)和核壳蛋白(n)，其中s蛋白的n端由结构域(s1-ntd)和受体结合域 (s1-rbd)组成，新型冠状病毒通过其受体结合域s1-rbd与宿主细胞受体ace2结合引起感染。
3.ace2为i型跨膜糖蛋白，由805个氨基酸组成，包括跨膜区、胞内羧基端和胞外氨基端，冠状病毒通过其s1-rbd与ace2的细胞外催化结构域互动结合，导致细胞内吞、膜融合，使病毒进入表达ace2或含有ace2受体的细胞。
4.因新冠病毒通过其rbd与ace2结合引起感染，所以现有疫苗基本针对rbd进行研发，已有多款疫苗用于临床，世界各国也尝试了如瑞德西韦、洛西那韦、利托那韦、氯喹、羟氯喹、激素、干扰素等药物，虽然取得了某些效果，但特别是针对变异毒株目前仍缺少特效药。
5.rna干扰(rnai)作为一种高效的序列特异性基因沉默技术，正在给疾病的治疗带来难以想象的应用前景，已有多种sirna药物被fda审批上市。小干扰rna(sirna)大约21～23bp，以参与rna干扰(rnai)的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使rna(mrna)，但无论是细胞水平还是活体内，使用sirna进行基因干扰均要克服很多困难：1)膜通透性：sirna 带有大量的负电荷，分子量大(～13kd)，自身很难穿过细胞膜，运输sirna主要靠化学修饰和一些运输载体；2)抗核酸酶降解：sirna由大量的核糖核酸分子构成，很容易被外界的 rna酶降解，如果在设计sirna及选择运输载体时不对碱基进行特定的化学修饰或采取载体保护方法，则在sirna进入作用位点前即被rna酶降解；3)靶向递送及载体：sirna的作用位点主要在靶细胞浆内，所以需将sirna特异性递送给靶细胞浆，如果不能有效地选用合适的靶向递送载体并及时使sirna从内涵体释放到胞浆，通常可激活细胞免疫反应，导致干扰素等细胞因子的释放，所以，如何有效地将sirna运输并释放到靶细胞浆是影响rnai效果的瓶颈问题，有些sirna能导致序列或浓度依赖性非特异性基因沉默即脱靶，因此，在设计 sirna时，应同时考虑靶向递送、基因抑制效果以及尽可能选择低脱靶效应的序列。
6.在covid-19的防治中，如果能以合适的靶向递送载体将ncovsirna稳定地、特异地依次递送给靶器官、靶组织、靶细胞、定位于靶细胞、穿越靶细胞膜、释放到靶细胞浆，并对多种变异毒株广谱有效，就应能更好地开展covid-19的靶向基因治疗。
7.所以，本发明要设计、合成以rbd靶向递送shrna的ncovsirna药物。


技术实现要素：

8.本发明的目的是要提供一种以rbd靶向递送shrna的ncovsirna药物及其合成和用
途；在ncovsirna药物中，shrna具有靶向基因治疗和免疫佐剂的双重作用，rbd具有靶向递送和蛋白疫苗的双重作用，脂质体具有稳定shrna、细胞转染和免疫佐剂的作用。
9.本发明的目的通过以下技术方案实施：
10.筛选共有基因：从数据库记载的各种致病性冠状病毒及其变异毒株中筛选不随病毒变异而改变的共有基因，包括保守基因、超保守基因和/或保守微卫星。
11.筛选sirna：从共有基因中预选多对以该共有基因为干扰靶标的sirna，使sirna包含有保守基因、超保守基因和/或保守微卫星。
12.合成sirna：合成2条互补的21-25nt的寡核苷酸sirna及起间隔作用的碱基序列。
13.合成shrna：将已合成的2条互补寡核苷酸多肽sirna和起间隔作用的碱基序列进一步合成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shrna双链。
14.优选sirna：将合成的shrna构建干扰载体，检测其mrna表达、蛋白表达和干扰效果，经sirna设计、合成、筛选、迭代设计和验证，优选具有高沉默效率的sirna。
15.合成优选的sirna和shrna：采用优选的sirna序列按上述所述合成sirna、shrna，包括为增加稳定性和避免脱靶进行的化学修饰。
16.合成rbd多肽或蛋白：合成位于但不限于冠状病毒s蛋白的第319-510位氨基酸序列、位于但不限于n439、v483和q493位点的保守氨基酸序列及经密码子优化的氨基酸序列。
17.化合物的合成：以二硫键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、硫醚键、肟键、酰胺键或马来酰亚胺-巯基键等偶联方法将已合成的shrna和rbd连接、合成为化合物；或根据shrna的核苷酸序列和rbd的氨基酸序列合成rbd-shrna-rbd。
18.化合物的提纯：以高效液相色谱、反向高效液相色谱或离子交换色谱提纯化合物。
19.化合物的脂质体修饰：通过带负电荷的shrna吸附带正电荷的脂质体制备脂质体修饰化合物；通过rbd氨基的巯基化使巯基与脂质体的马来酰胺形成马来酰亚胺-巯基键制备peg内化的脂质体修饰化合物；通过rbd氨基末端与脂质体形成氨甲酸酯键制备脂质体修饰化合物；通过rbd或rbd片段连接脂质体修饰的sirna制备脂质体修饰化合物。
20.化合物的验证：在体外细胞水平检测化合物对2种或以上不同变异毒株的抗病毒效果，观察是否具有以保守基因为靶标的广谱抗变异毒株作用；检测化合物在动物体内是否具有靶向递送shrna的rnai作用、疫苗的免疫作用以及是否有免疫增强的效果。
21.本发明的有益效果在于：
22.首次发现源自冠状病毒受体结合域的新型靶向递送载体rbd和源自冠状病毒保守基因的广谱抗变异毒株靶标shrna，并将rbd和shrna合成为以rbd靶向递送shrna的化合物；合成后的化合物又使rbd和shrna相互增效，进一步产生诸多新功能。
23.因本发明从不随或几乎不随病毒变异而变异的冠状病毒保守基因、超保守基因和/或保守微卫星基因中筛选sirna，以这种sirna合成的shrna以不随病毒变异而变异的保守基因为干扰靶标，所以具有广谱抗变异毒株的靶向基因治疗作用。
24.因免疫佐剂的主要成分是寡核苷酸和脂质，所以本质为寡核苷酸的sirna或shrna具有增强rbd疫苗免疫效果的免疫佐剂的新用途。
25.冠状病毒特异性感染表达ace2的靶细胞，目前还没有将抗冠状病毒的sirna/shrna特异性递送给病毒感染细胞而不递送给未感染细胞的靶向递送载体，本发明根据配体rbd与受体 ace2的特殊关系，将rbd与shrna连接为化合物，使rbd产生靶向递送shrna的
(蛋白)，两条rbd分别与shrna正反义链相连接。4为脂质体层，5为peg层，shrna2被脂质体4包裹。其中shrna起rnai作用，脂质体起保护shrna和引起细胞内吞作用，peg使 shrna缓慢释放和长效循环，rbd起靶向递送和疫苗的双重作用。
具体实施方式
40.下面结合图1，2、3、4和5，对本发明的具体实施方法作详细的举例描述，但这些范例性的描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
41.一、设计以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna
42.1、超保守基因、保守基因及保守微卫星的设计
43.如技术线路图1所示，从genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载β冠状病毒属(特别是新型冠状病毒及其变异毒株)全基因组(cdna)序列，在全基因组序列中搜寻最长的公共子序列，获得超保守基因或保守基因；利用clustal w软件对 genbank数据库下载的全基因组进行序列比对，检测不同序列之间的相似度，筛选保守微卫星序列；利用mega6.0分子进化遗传分析软件，用邻接法(neighbour-jioning，n-j)对下载的冠状病毒氨基酸序列构建氨基酸种系分子进化树，对氨基酸序列的分子变异特征进行分析，推断保守基因序列。
44.共找到以下3段最长及次长的超级保守子序列(没有插入或删除的完全相同的子序列)，其长度为22～30bp,与小rna长度相当，但在高等生物特别是人类中不包含这3段子序列。
45.具体序列如下：
46.seq id no.1(subsequence 1)＝ttaatacgacctctctgttggattttgaca(30bp)；
47.seq id no.2(subsequence 2)＝ggttcgcaacttcacaca gagt(22bp)；
48.seq id no.3(subsequence 3)＝caggcgtttgttggttgattaa(22bp)。
49.共找到以下3段最长及次长的保守子序列，它们的长度为22～30bp,与小rna长度相当，但在高等生物特别是人类中不包含这3段保守子序列：
50.seq id no.4(subsequence 1)＝gttttacgacaacgatgttggtttaggaca(30bp)；
51.seq id no.5(subsequence 2)＝ggttcggttgttatatacgata(22bp)；
52.seq id no.6(subsequence 3)＝ggttcagagagtctcctattta(22bp)。
53.共找到以下5个由核苷酸重复多次的保守微卫星位点，微卫星分别为ctctct、agagag、 aaaaaaa、tatata、cacaca。
54.2、sirna的常规设计及其常见变异株间的比对
55.根据上述从genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下载的β冠状病毒属(特别是新型冠状病毒及其变异毒株)的完整基因组(cdna)序列，利用ambion公司的 shrna在线设计软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/sirnatools.html)获得长度约为19nt的多个sirna备选序列，根据rna结合的tm值及特异性比对结果，优选sirna。例如，据此本技术从nc_045512.2株、delta变异株、omicron变异株的e、m、n、orf1ab及s基因中分别优选到表1-5所示的候选sirna，表中“钭黑体”序列为三种毒株的共有sirna序列(如表1中的seq id no.9～11)，即尽管nc_045512.2 株变异为delta株和omicron株，但是各毒株中仍保持不变且理论上具有靶向干扰作用的保守序列(sirna)，如果靶向干扰这些sirna
序列，即可广谱杀灭相应的变异毒株。
56.表1新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株e基因的sirna候选序列
[0057][0058][0059]
表2新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株m基因的sirna候选序列
[0060][0061]
表3新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株n基因的sirna候选序列
[0062][0063][0064]
表4新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株orf1ab基因的sirna候选序列
[0065][0066]
表5新型冠状病毒nc_045512.2株、delta株、omicron株s基因的sirna候选序列
[0067]
[0068][0069]
3、筛选以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna
[0070]
利用clustal w软件或其他软件，将上述设计的超保守基因、保守基因及保守微卫星与常规筛选的sirna进行基因序列比对，检测不同序列之间的相似度，设计既为超保守基因、保守基因或保守微卫星，又为rnai靶位点的多对sirna(设计以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna)。
[0071]
(1)以超保守基因和保守微卫星为靶标的sirna(s1/s2)：
[0072]
seq id no.1(subsequence 1)＝ttaatacgacctctctgttggattttgaca(30bp)；
[0073]
seq id no.2(subsequence 2)＝ggttcgcaacttcacaca gagt(22bp)；
[0074]
(2)以保守基因和保守微卫星为靶标的sirna(s3/s4)：
[0075]
seq id no.5(subsequence 3)＝ggttcggttgttatatacgata(22bp)；
[0076]
seq id no.6(subsequence 4)＝ggttcagagagtctcctattta(22bp)。
[0077]
通过上述设计，获得以超保守基因、保守基因或保守微卫星为干扰靶标的在理论上抗冠状病毒变异毒株的sirna，命名为sirna1/2/3/4。
[0078]
二、验证以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna功能
[0079]
1、合成sirna/shrna
[0080]
根据psilencer4.1.cmv.neo干扰载体的多克隆酶切位点设计能表达发夹结构的shrna 模板，每个模板由两条大部分互补的55bp的单链dna构成，退火互补后能形成带有bamh i 和hind iii酶切位点粘性末端的dna双链，用于与线性化的psilencer4.1.cmv.neo的连接。然后按设计的sirna及其shrna模板，委托公司合成，所合成的sirna/shrna序列如下：
[0081]
seq id no.1(subsequence 1)＝ttaatacgacctctctgttggattttgaca(30bp)；
[0082]
seq id no.2(subsequence 2)＝ggttcgcaacttcacaca gagt(22bp)；
[0083]
seq id no.5(subsequence 3)＝ggttcggttgttatatacgata(22bp)；
[0084]
seq id no.6(subsequence 4)＝ggttcagagagtctcctattta(22bp)。
[0085]
2、shrna表达载体的构建
[0086]
将上述合成的shrna分别与线性化的干扰载体psilencer4.1.cmv.neo进行连接和鉴定，构建shrna表达质粒，转化dh5a，获得shrna表达载体。
[0087]
3、shrna表达(干扰)载体的效果鉴定
[0088]
根据合成的sirna/shrna序列，构建荧光标签载体，并分别与shrna表达质粒共转染 293t细胞，进行鉴定，或以pcr扩增shrna。常规方法如下：
[0089]
shrna引物设计：参照网上在线引物设计软件，设计上、下游引物，在上游引物5'端添加起始密码，为将扩增产物克隆到pegfp-n1中，引物的5'端添加用于与载体发生同源重组的同源臂。
[0090]
shrna基因扩增：按上海生工试剂盒所提供的基因扩增反应体系及反应条件进行基因扩增、产物回收和纯化，获得扩增产物。
[0091]
pegfp-n1的线性化：复苏含有pegfp-n1质粒的dh5a菌种，按试剂盒提取质粒，测定浓度后进行酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收线性化的载体。
[0092]
将扩增的shrna与荧光标签载体(pegfp-n1)进行连接：使用金斯瑞公司的同源重
组试剂盒进行连接，连接结束后可保存在-20℃备用或马上进行转化。
[0093]
shrna干扰载体的效果鉴定：分别将干扰载体(psilencer-shrna1/2/3/4)和荧光标签载体(pegfp-shrna1/2/3/4)共转染293t细胞，干扰载体与标签载体的质量比为1：2，同时设立对照，转染后48h观察细胞内gfp蛋白的融合表达，根据荧光强度评价干扰效果：
[0094]
流式细胞检测：为定量分析不同干扰载体的干扰效果，用流式细胞术检测，分析荧光蛋白表达细胞在总细胞数中的比例。
[0095]
westernbolt分析：
①
细胞收集与裂解：以ripa裂解细胞。
②
sds-page蛋白电泳：制备 sds-page胶，将样品加入等体积的2xsds缓冲液，沸水煮5min，冰浴2min，12000xg，10min。
③
western blot检测：经转膜、封闭、一抗结合、洗涤、二抗结合和显色，观察结果。
[0096]
rt-pcr检测mrna：采用相对荧光定量rt-pcr法检测转染细胞中基因的相对表达量，根据标准曲线，由ct值换算目的基因以及b-actin内参基因拷贝数，以b-actin内参基因校正病毒基因mrna相对表达量(目的基因拷贝数/b-actin拷贝数)，定量评价干扰效果。
[0097]
4、获得高沉默效率的sirna/shrna
[0098]
经上述设计、合成、筛选、迭代设计、合成和验证，获得以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的sirna/shrna：
[0099]
seq id no.1(subsequence 1(shrna1))＝ttaatacgacctctctgttggattttgaca；
[0100]
seq id no.2(subsequence 2(shrna2))＝ggttcgcaacttcacaca gagt；
[0101]
seq id no.5(subsequence 3(shrna3))＝ggttcggttgttatatacgata。
[0102]
三、合成以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的shrna
[0103]
根据上述筛选的以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的shrna1/2/3，委托生物公司，每个shrna合成2条互补的19-25nt的寡核苷酸多肽sirna，以及合成起间隔作用的9nt的碱基序列，然后将所合成的sirna和碱基序列连接成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shrna双链，所合成的shrna双链的每条单链均可以分别连接rbd多肽或蛋白。
[0104]
例如，分别将seq id no.1(shrna1)、seq id no.2(shrna2)和seq id no.5 (shrna3)合成 5'-ttaatacgacctctctgttggattttgacattcaagagatgtcaaatccaacagagaggtcgtattaa-3'(seqid no.42)、5'-ggttcgcaacttcacacagagtttcaagagaactctgtgtgaagttgcgaacc-3'(seq idno.43)和5'-ggtt cggt tgtta tatac gata ttcaagaga tatc gtata taaca accg aacc-3'(seqid no.44)，其中“ttcaagaga”为loop环，其左、右侧分别为互补的正反义链，seq idno.42～44可分别合成shrna1、shrna2和shrna3。同理从表1-5中进一步优选高沉默效率的 sirna，合成shrna，进而在其3'和/或5'连接rbd蛋白或其多肽。
[0105]
四、靶向递送载体rbd的设计和合成
[0106]
合成的rbd具有靶向递送载体和重组蛋白疫苗的双重作用。因为冠状病毒通过rbd特异性结合ace2受体引起感染，rbd与ace2是配体与受体的关系，所以可通过rbd将药物靶向递送给病毒感染细胞并进入胞浆。另外现有技术通常以病毒通过rbd与ace2结合感染的特性设计rbd蛋白疫苗，所以合成的rbd既是靶向递送载体也是蛋白疫苗。
[0107]
1、rbd的氨基酸序列及合成设计：根据全球共享禽流感数据库(gisaid)和genbank数据库收集sars-cov、mers、sars-cov-2的s蛋白基因序列，进行氨基酸系统进化树分析，或经序列同源性分析，确定rbd中能与人ace2受体结合并且不易发生变异的保守氨基酸序列位点n439、v483和q493。另外根据sars cov s蛋白由1255个氨基酸组成、可被酶解为s1受体
结合区(rbd)和s2膜融合区、rbd定位于s蛋白的第319到510位氨基酸(aa319-510)、 rbd通过其c端与ace2的细胞膜外n端结合、rbd能单独通过ace2进入靶细胞、rbd s蛋白 n连接的糖基化的去除不会影响rbd s蛋白的功能、sars-cov-2rbd(aa.331-550)中有3个 n-糖基化残基(n331,n343,n360)、组成肽链的色氨酸、组氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸都有多个n等特点，可设计rbd的合成，以及将rbd与脂质体或shrna进行连接。
[0108]
2、rbd的合成：以氨基酸合成多肽通常是由两个氨基酸脱水缩合形成肽键，由多个氨基酸残基以肽键相连接形成多肽。可委托公司，采用多肽合成仪自动化合成位于s蛋白的第 319-510位氨基酸序列、位于能与ace2结合但不易发生变异的n439、v483和q493位点的保守氨基酸序列以及经密码子优化的氨基酸序列。其基本方法是，按被合成多肽的氨基酸序列逐个加入氨基酸，使肽链从c端到n端残基逐步延长，要求每一个氨基酸残基以一端保护和另一端活化的形式缩合，并且在每一轮肽链延长循环后除去氨基上的临时性保护基团，直至目标多肽的全部氨基酸序列缩合完毕。目前常用的固相合成多肽的反应原理是在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知的序列从c端-羧基端向n端-氨基端的顺序不断添加所需氨基酸，进行合成反应，最终得到多肽。其主要步骤包括：
①
去保护：用碱性溶剂去除氨基的保护基团；
②
激活和交联：活化下一个氨基酸的羧基，使活化的单体羧基与游离的氨基交联，形成肽键，反复循环这两步反应，直到多肽合成完成。
[0109]
五、以shrna和rbd合成化合物
[0110]
以shrna和rbd合成的化合物，因为shrna为基因治疗药物，而rbd又具有蛋白疫苗和靶向递送shrna的作用，所以合成的化合物(rbd-shrna-rbd)既是靶向药物又是疫苗。
[0111]
1、rbd-shrna-rbd的设计：如图2和图3所示，根据seq id no.1～2、seq id no.5、seqid no.7～39、seq id no.42～44及rbd序列(seq id no.45)，将以病毒保守基因为干扰靶标的sirna的正反义链的一端与loop环(5'-ttcaagaga-3’)相连，另一端分别与rbd s蛋白n连接的糖基化位点相连，连接成“rbd-sirna正义链-loop环-sirna反义链-rbd”。其中两条互补的正反义链会形成双链，但两条多肽rbd不会形成双链，所以是带有两条多肽rbd 和loop环的发夹状连接物shrna。因为rbd可通过c端结合病毒受体ace2并通过ace2进入靶细胞浆，以及多肽与sirna的结合可增加sirna的通透性、稳定性及干扰效果，所以本设计使rbd产生靶向递送、穿膜肽、蛋白抗原和竞争受体的作用，不但能稳定、有效地将 covsirna靶向递送至病毒感染的靶细胞浆进行靶向干扰，而且自身能作为重组蛋白刺激机体产生免疫性抗体，以及能与病毒竞争结合靶细胞受体ace2从而抑制病毒感染。
[0112]
2、rbd-shrna-rbd的合成：可委托公司，按照seq id no.42～45，采用多肽与寡核苷酸的常规合成方法，将多肽和寡核苷酸以肟键、酰胺键、硫醚键、二硫键、磷酰键、腙键、酰脲键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、马来酰亚胺-巯基键等形式偶联成缀合物，包括多肽和寡核苷酸的正义链(5'末端、3'末端)或反义链(3'末端)以较牢固的共价键、较松散的离子键、疏水键或以带间隔臂的羧腙键进行非共价或共价交联，合成多肽-寡核苷酸偶联物 (pocs)。目前最常用的合成pocs法是共价交联-液相片段合成法，已广泛应用于合成各种pocs，其主要步骤是：分别在固相基质上分别合成多肽和寡核苷酸，然后同时将两个合成物从固相基质上剥离，所剥离的多肽和寡核苷酸在溶液中通过反应活性基团进行偶联。合成 pocs主要包括：
①
马来酰亚胺-巯基偶联：在多肽或寡核苷酸上修饰马来酰亚胺，在另一单体上修饰巯基，然后将两个单体加入同一溶液中即可反应得到pocs；
②
二硫键或硫醚键偶
联：其中硫醚键偶联包括巯基亲核取代卤代乙酰胺上卤代物的反应和巯基michael加成到马来酰亚胺两类；二硫键偶联可以通过两个巯基直接氧化，或先通过联吡啶二硫醚等活化剂将巯基活化再与另一含有巯基的寡聚物偶联，常用二硫键合成sirna与多肽的偶联物；
③
肟键偶联：醛基与氨基相互反应产生肟，该反应条件温和、反应效率高，并且可以直接生成双链dna与特定多肽的偶联产物，同时，还可以通过双功能化的寡核苷酸与多肽或糖类通过肟键在核酸的5’与3’端同时连接上两条多肽，该方法不需要各种保护过程并能一步完成，用于合成了“肽-寡核苷酸-肽”产物，具体方法为在寡核苷酸的5’和3’均引入醛基，再与羟基胺修饰的多肽反应，得到“肽-寡核苷酸-肽”，且所得产率较高，这种双官能团化的寡核苷酸与多肽的一步反应不需要任何保护策略和交联剂，在微酸的条件下就能得到较高的产率；
④
酰胺键偶联：直接利用含有活化羧酸或硫酯的寡聚物与另一修饰有氨基的聚合物反应得到产物；
⑤
腙键偶联：需要先将肼基引入到多肽上，然后加入ph值为3～5之间的柠檬酸缓冲溶液，再与修饰有乙酰醛基的寡核苷酸进行反应，才可得到以腙键连接的pocs。
[0113]
3、rbd-shrna-rbd的提纯：色谱方法一直是纯化和分析多肽与寡核苷酸偶联物的最常用的方法之一。根据偶联物的复杂程度需选择不同的色谱方法进行分离，主要方法有高效液相色谱(hplc)、反向高效液相色谱(rp-hplc)，离子交换色谱(iec，通常为阴离子交换色谱)，或者将其中的两个或几个进行串联使用，具体按操作说明。
[0114]
经上述shrna的筛选、合成及其与rbd的合成，获得seq id no.42～45相应的化合物 rbd-shrna1/2/3-rbd，包括但不限于rbd-shrna1-rbd、rbd-shrna2-rbd、rbd-shrna3-rbd以及rbd-sirna和s-sirna。
[0115]
六、化合物的脂质体修饰
[0116]
如图4-5，脂质体(liposomes，lip)修饰是为了稳定运输shrna，包括以带负电荷的shrna 吸附带正电荷的脂质体、以rbd氨基的巯基化使巯基与脂质体形成巯基-马来酰亚胺键或以 rbd氨基末端与脂质体形成氨甲酸酯键等方法。如经脂质体dotap/chol、dc-chol/dope或lip 包裹，制成rbd-shrna1/lip-rbd、rbd-shrna2/lip-rbd、rbd-shrna3/lip-rbd(分别缩写为 rbd
2-shrna1/lip、rbd
2-shrna2/lip和rbd
2-shrna3/lip)、rbd-sirna/lip和s-sirna/lip。
[0117]
实施例1：以脂质体dotap/chol制备脂质体修饰化合物
[0118]
(1)rbd-shrna-rbd的合成
[0119]
采用本技术以shrna和rbd合成的rbd-shrna-rbd化合物。
[0120]
(2)脂质溶液的配制
[0121]
dotap(mw＝698.5)：10mg/ml，精确称取dotap[n-(2,3-二油酰氧基-1-丙基)三甲基甲磺酸铵：n-1-(2,3-di-oleoyloxy)propyl)-n,n,n-trimeth ylammoniumethyl sulfate]粉末100 mg，加入10ml容量瓶中，加氯仿溶液至刻度线。
[0122]
chol(mw＝386)：5mg/ml，精确称取chol[胆固醇：cholesterol]粉末50mg，加入10ml 容量瓶中，加氯仿溶液至刻度线。
[0123]
m-peg
2000-dspe(mw＝2787)：1 0mg/ml，称取m-peg
2000-dspe(甲氧基化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺：methoxy-polyethylene glycol-distearoyl phosphatidyi-ethanolamine)粉末1 0mg，加入l ml depc水，涡旋后超声1min，使之彻底溶解。
[0124]
mal-peg
2000-dspe(mw＝2941.6)：1 0mg/ml，精确称取mal-peg2000-dspe
(maleimidederivatized polyethylene glycol-distearoyl phosphatidyl-ethanolamine：马来酰亚胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)粉末10mg，加1ml depc水，涡旋后超声1min，溶解。
[0125]
(3)脂质体dotap/chol的制备(薄膜水化法)
[0126]
采用薄膜水化法(lipid-film method)制备脂质体dotap/chol，脂质浓度为10mm，主要步骤如下：按照制备1ml脂质体dotap/chol的量，分别取dotap、chol两种脂质的氯仿溶液，以dotap：chol＝1：1(m：m)的比例加至500ml三角烧瓶，加3～4ml氯仿溶液；37℃真空旋转蒸发45～60min，使成为均匀的脂质薄膜，用高纯氮气吹尽痕量氯仿；加入1ml depc 水振摇，将脂质薄膜从瓶壁洗下，得脂质混悬液；待充分水合后，超声lmin，依次通过400 nm、200nm、80nm、50nm聚碳酸酯膜挤出，各10～20次，即得脂质体dotap/chol。
[0127]
(4)rbd-shrna-rbd的巯基化
[0128]
2-it(traut's reagent)是蛋白巯基化的常用试剂，可在rbd s蛋白n连接的糖基化处进行巯基化，步骤如下：取rbd-shrna-rbd和2-it(traut's reagent，2-iminothiolane-hcl)，混合均匀(2-it与rbd-shrna-rbd的摩尔比为200：1)，室温条件下反应2h；通过透析法除去多余的2-it，每次以足量透析液(1
×
pbs，5mm edta，ph＝7.4)，4℃保存，隔夜透析，小心低速磁力搅拌，6～8h换透析液，共2次；巯基化抗体的浓度和巯基化程度分别采用bca 法和ellman法测定其蛋白浓度和巯基化程度。
[0129]
(5)以脂质体dotap/chol制备脂质体修饰化合物
[0130]
(a)利用带负电何的sirna/shrna吸附带正电荷的脂质体进行制备
[0131]
①
取120μl的dotap/chol脂质体(10mm)，加入20μ1的rbd-shrna-rbd(约2μg/μ1， 40μg)，加depc水11μl，室温静置10min，获得脂质体包裹的rbd-shrna-rbd复合物。
[0132]
②
取sirna90μ1(24μg，20mm)、shrna90μ1(24μg，10mm)和/或rbd-shrna-rbd100μ1(约 10μg/μ1，200μg)，加depc水57.6μ1，室温静置10min,加入600μl的dotap/chol脂质体(50 mm)，获得脂质体包裹的sirna、shrna和/或rbd-shrna-rbd复合物。
[0133]
③
将
①
制备的脂质体复合物与
②
制备的sirna、shrna和/或rbd-shrna-rbd脂质体复合物等量混合，获rbd修饰的含游离sirna/shrna的脂质体包裹rbd-shrna/sirna-rbd复合物。
[0134]
(b)以rbd中的巯基与peg中的马来酰亚胺的交联反应进行制备
[0135]
为了增长脂质体的循环时间和靶向特异性，对(a)制备的各种脂质体进行peg化和进一步的rbd靶向修饰，获得peg化和以rbd为配体的脂质体修饰化合物。
[0136]
分别取6.36μl、9.53μl和12.7μl的10mg/ml的mal-dspe-peg，分别将其插入上述(a) 制备的脂质体复合物rbd-shrna/sirna-rbd(分别将两者混合)，50℃水浴孵育10min，室温静置10min，然后加入约200μg经上述巯基化的rbd-shrna-rbd，使rbd中巯基化氨基上的巯基与mal-dspe-peg中的马来酰亚胺发生交联反应，分别获得rbd修饰的5mo1％peg、7.5 mo1％peg和10mo1％peg的peg化脂质体复合物rbd-shrna/sirna-rbd，即该复合物为由脂质体dotap/chol以静电吸附包裹sirna、shrna和/或rbd-shrna-rbd，再以mal-dspe-peg 包裹在外层，最后以mal-dspe-peg连接rbd-shrna-rbd，其中rbd起靶向递送、蛋白抗原和稳定sirna/shrna的作用，脂质体和peg起保护sirna/shrna、缓慢释放sirna/shrna/rbd、向胞内转染sirna/shrna或疫苗佐剂的作用。
[0137]
实施例2：以脂质体liposomal制备脂质体修饰化合物
[0138]
当ph＞8时，rbd的氨基末端与pnp-peg-dppe(peg-pe)反应形成稳定的氨甲酸酯键偶联物，并定向定量地插入脂质体的外层膜，制成脂质体修饰化合物。本实施例以rbd片段和 sirna制备以rbd靶向递送sirna(rbd-sirna)的脂质体修饰化合物。
[0139]
(1)rbd的合成
[0140]
采用上述rbd合成方法合成rbd或其片段。
[0141]
(2)pnp-peg-dppe的合成
[0142]
取20mg/ml dppe(二棕榈酰乙醇胺)氯仿溶液10ml，置50ml圆底烧瓶中，滴加三乙胺 (tea)0.65ml，取约4.0g浓度为200mg/ml的(pnp)
2-peg
3400
(聚乙二醇3400二对硝基苯碳酸酯)氯仿溶液加入上述混合液中，吹入氮气，密封，避光，于室温下磁力搅拌过夜，减压蒸干溶剂，真空除尽残留氯仿，加入0.01mol/l hcl水溶液100ml，超声处理形成透明的胶束溶液。0.01mol/l hci水溶液为洗脱液，经cl-4b sepharose进行分离，除去未反应的 (pnp)
2-peg
3400
和释放的pnp，收集含pnp-peg-dppe胶束的洗脱液，冷冻干燥，用tlc、hplc、 ms和nmr对pnp-peg-dppe进行定性和定量。
[0143]
(3)rbd-peg-dppe的合成：取pnp-peg-dppe 100mg溶于10ml氯仿中，置50ml烧瓶中，于旋转蒸发仪上减压除去氯仿，形成脂膜，真空除尽残留氯仿，将25mg rbd溶于0.01 mol/l hcl 4ml中，加入内壁涂布脂膜的烧瓶中，于室温孵育30min，轻摇使脂膜充分分散。于混悬液中加10mum/l(ph 9.0)tris缓冲液20ml，混匀，氮气保护，于4℃孵育过夜。将样品置于分子质量为5kd的透析袋中，在10mmol/l(ph 7.4)tris缓冲液中透析约4h，再用去离子水于4℃透析24h，取出袋内溶液，冷冻干燥，置-20℃冰箱内保存。
[0144]
(4)rbd-sirna/liposomal的合成：将epc(蛋黄磷脂)、ch(胆固醇)、peg
2000-dspe(二硬脂酰乙醇胺聚乙二醇2000)和dotap(二油酰三甲胺丙烷)的氯仿溶液按摩尔比 (60:34:3.0:3.0)混合，如需标记脂膜，于上述混合液中加入占总脂质量摩尔比为0.1％ rho-pe，减压除尽氯仿，形成脂膜。将一定量的sirna溶于经depc处理的超纯水中，sirna 用量应完全中和dotap所带的正电荷。于50℃水浴中用含sirna的水溶液将上述磷脂膜水化 30min，形成包裹sirna的脂质体。用手动挤出装置(avanti polar lipids)，将初步形成的脂质体分别过0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯核孔膜(whatman)10次，制备粒径均一的脂质体。取适量rbd-peg-dppe溶于甲醇中，置烧瓶，氮气吹干成膜，加入制备的脂质体悬液，于37℃水浴温浴2h，使rbd-peg-dppe定向地插入到脂质体的外层膜上。其中rbd在脂质体中占总脂质的摩尔比一般为0.5％～1.o％(可适当调整)。用动态激光散射、冰冻蚀刻电子显微镜、核酸电泳检验rbd修饰的包载sirna的聚乙二醇修饰的脂质体的特性。
[0145]
七、化合物(ncovsirna)的验证
[0146]
1、体外验证以保守基因为靶标的广谱抗病毒效果
[0147]
(1)病毒液的准备
[0148]
在vero e6细胞生长至30％汇合度的dmem培养液(10％fbs)中加入病毒株，36℃、5％co2培养箱培养5～7d，至出现细胞病变效应(cpe)时，分离病毒，用培养液配成103～10
5 tcid
50
/ml病毒液备用。据此分别准备新冠病毒的两种变异毒株b.1.617.1和b.1.617.2的病毒液，用于验证化合物是否对2种或以上含有相同保守基因的变异病毒同时有效，以证明本发明的shrna是否具有以保守基因为靶标的广谱抗病毒效果。
[0149]
(2)化合物(ncovsirna)和病毒共培养
[0150]
将化合物rbd-shrna1/2/3-rbd的表达式改名为rbd
2-shrna1/2/3，分别设立实验组和对照组，试验化合物对抗b.1.617.1和b.1.617.2的效果。每组接种8孔板，每孔2
×
105个 vero-e6细胞、2ml dmem培养液(10％fbs)，置36℃、5％co2培养箱中培养至30％汇合度时 (24h后)，更换培养液，同时加入试验化合物、b.1.617.1和b.1.617.2株病毒液。
[0151]
其中实验组包括:rbd
2-shrna1组(0.1nmol rbd
2-shrna1 0.6ml病毒液)、rbd
2-shrna2 组(0.1nmol rbd
2-shrna2 0.6ml病毒液)、rbd
2-shrna3组(0.1nmol rbd
2-shrna3 0.6ml 病毒液)、rbd-sirna组(0.1nmol rbd-sirna 0.6ml病毒液)；对照组包括：naked shrna1 组(0.1nmol naked shrna1 0.6ml病毒液)、naked shrna2组(0.1nmol naked shrna2 0.6 ml病毒液)、naked shrna3组(0.1nmol naked shrna3 0.6ml病毒液)、naked sirna组(0.1 nmol naked sirna 0.6ml病毒液)、rbd对照组(0.1nmol rbd 0.6ml病毒液)、阳性对照组(0.6ml病毒液)、阴性对照组(0.6ml dmem培养液)(表1-6)。
[0152]
继续培养，然后于培养1小时、24小时和72小时后每组各取上清液，以1:4、1:12、 1:36、1:108、1:324、1:972、1:2916、1:8748倍稀释，进行rt-pcr检测。
[0153]
(3)实时荧光rt-pcr检测各组病毒rna
[0154]
病毒核酸提取和核酸(orf1ab/n)检测按试剂盒说明书操作。
[0155]
(4)病毒rna检测结果
[0156]
①
b.1.617.1株检测结果：如表1所示，各组细胞培养1h后，阴性对照组病毒rna检测结果为阴性，阳性对照组rna检测结果的滴度为1:36，其他各组rna检测结果滴度均为1:12。如表2所示，各组细胞培养24h后，阴性对照组病毒rna检测结果仍为阴性，阳性对照组 rna检测结果滴度为1:2916，4组对照组的rna检测结果滴度为1:972～1:2916，而实验组的rna检测结果滴度为1:36～1:108，明显低于对照组(p＜0.01)。如表3所示，各组细胞培养72h后，阴性对照组病毒rna检测结果仍为阴性，阳性对照组rna检测结果滴度＞ 1:8748，对照组的rna检测结果滴度＞1:2916～1:8748，而实验组的rna检测结果滴度为 1:108～1:324，明显低于对照组(p＜0.01)。
[0157]
表1-3说明，实验组具有明显的抗b.1.617.1株作用，说明与rbd连接的shrna或sirna 能被递送至靶细胞内进行rna干扰，而未与rbd连接的shrna或sirna不能进入靶细胞内，不能发挥rna干扰的作用，另外，rbd也有一定的抗病毒作用。
[0158]
表1化合物与b.1.617.1株共培养1小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果( /-)
[0159][0160]
表2化合物与b.1.617.1株共培养24小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果( /-)
[0161][0162][0163]
表3化合物与b.1.617.1株共培养72小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果( /-)
[0164][0165]
②
b.1.617.2株检测结果：如表4所示，各组细胞培养1h后，阴性对照组病毒rna检测结果为阴性，阳性对照组rna检测结果的滴度为1:36，其他各组rna检测结果滴度均为1:12～ 1：36。如表5所示，各组细胞培养24h后，阴性对照组病毒rna检测结果仍为阴性，阳性对照组rna检测结果滴度为1:2916，在4组对照组的的rna检测结果中有3组的滴度为1:2916，而4组实验组的rna检测结果滴度为1:108～1:324，明显低于对照组(p＜0.01)。如表6所示，各组细胞培养72h后，阴性对照组病毒rna检测结果仍为阴性，阳性对照组rna检测结果滴度＞1:8748，在4组对照组(naked)的rna检测结果中有3组的滴度为1:8748或以上，在4组实验组的rna检测结果中有1组的滴度为1:972、3组的滴度为1:324，与对照组相比仍有明显的差异(p＜0.01)。
[0166]
表4-6说明，实验组具有明显的抗b.1.617.2株作用，说明与rbd连接的shrna或sirna 能被递送至靶细胞内进行rna干扰，而未与rbd连接的shrna或sirna不能进入靶细胞内，从而不能发挥rna干扰的作用。
[0167]
表1-6表明，实验组同时具有抗b.1.617.1和b.1.617.2的作用，说明实验组以保守基因为干扰靶标的化合物(shrna)具有广谱抗变异毒株的效果。
[0168]
表4化合物与b.1.617.2株共培养1小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果( /-)
[0169][0170]
表5化合物与b.1.617.2株共培养24小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果( /-)
[0171][0172][0173]
表6化合物与b.1.617.2株共培养72小时培养液中病毒rna rt-pcr检测结果( /-)
[0174][0175]
2、动物体内验证rbd的靶向递送和免疫功能
[0176]
(1)动物分组和接种
[0177]
动物分组：选择6-8周龄、40克左右的spf级雌性balb/c小鼠，随机分为 rbd
2-shrna1/lip组(接种rbd
2-shrna1/lip b.1.617.2株)、rbd-sirna1/lip组(接种 rbd-sirna1/lip b.1.617.2株)、rbd组(接种rbd b.1.617.2株)，shrna1/lip组(接种shrna1/lip b.1.617.2株)，shrna1组(接种shrna1 b.1.617.2株)阳性对照组(接种 b.1.617.2株 生理盐水)和阴性对照组(仅接种生理盐水)。
[0178]
动物接种：经鼻腔喷雾接种40μl滴度为105/mltcid
50
的b.1.617.2株病毒液，阴性对照组经鼻腔喷雾接种40μl生理盐水。以腹腔注射5％水合氯醛溶液麻醉，分别将0.1nmol 的rbd
2-shrna/lip、rbd-sirna/lip、rbd、shrna1/lip和shrna1缓慢注入小鼠气管，复位组织，在感染后第7天每组处死10只小鼠，进行病毒检测，另10只用于观察抗体。
[0179]
(2)以细胞半数感染量(tcid
50
)的百分率检测病毒
[0180]
将处死小鼠肺组织制备10％匀浆，取100pl离心后上清，以10倍递次稀释，接种于veroe6 单层生长的96孔板，每孔30μl，每个稀释度接种4个孔，轻摇匀浆，放37℃吸附lh，以hank 氏液清洗，加培养液，放37℃c02培养箱培养，观察细胞病变效应(cpe)，分别计算各组veroe6 细胞半数感染量(tcid
50
)的百分率，百分率越大病毒含量越多，见表7-13。
[0181]
表7 rbd
2-shrna1/lip组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0182][0183]
表8 rbd-sirna1/lip组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0184][0185]
表9 rbd组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0186][0187]
表10 shrna1/lip组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0188][0189]
表11 shrna1组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0190][0191][0192]
表12阳性对照组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0193][0194]
表13阴性对照组小鼠肺组织匀浆致veroe6半数感染量的百分率
[0195][0196]
(3)rbd靶向递送的效果
[0197]
从表7-13可知，各组小鼠肺匀浆致veroe6半数感染量的百分率分别为rbd
2-shrna1/lip 组20.0％、rbd-sirna1/lip组27.5％、rbd组87.5％、shrna1/lip组82.5％、shrna1组95.0％、阳性对照组95.0％和阴性对照组2.5％。因为rnai主要发生在细胞浆内，shrna1组的shrna1 极易被核酸酶降解、不易通过细胞膜，所以几乎不起rnai作用；shrna1/lip组的shrna1 虽被lip保护而不易被核酸酶降解并能通过细胞膜，但因不能特异性进入靶细胞而使rnai效果较差，其veroe6半数感染量的百分率达82.5％，与阳性对照组相比无显著性差异(p＞0.05)；而rbd
2-shrna1/lip组和rbd-sirna1/lip组中的shrna1/sirna1因以rbd靶向递送至靶细胞浆，所以其rnai效果较好，rbd
2-shrna1/lip组和rbd-sirna1/lip组的veroe6半数感染量的百分率与shrna1/lip组相比，均具有显著性差异(均为p＜0.05)。
[0198]
(4)化合物(ncovsirna)的免疫功能检测
[0199]
采集rbd
2-shrna1/lip组和rbd组接种后第1、2、4、6周的10只小鼠静脉血，分离血清,保存于-20℃备用，按试剂盒说明书操作，elisa检测sars-cov-2特异性抗体igg和 igm。检测结果见表14。
[0200]
表14 rbd
2-shrna1/lip组和rbd组各10只小鼠血清特异性抗体检测结果比较
[0201][0202]
由表14可知，rbd
2-shrna1/lip组的igm、igg及igm igg的检出例次分别为21例、20 例和16例，分别多于rbd组的8例、8例和5例。因为rbd
2-shrna1/lip组的化合物由2分子rbd、1分子shrna及lip合成，比rbd组的单分子rbd的分子量更大、分子结构更复杂，而且shrna及lip又有免疫佐剂的作用，所以抗原性更强，更易于产生抗体。