一种葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型及其应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型及其应用。


背景技术：

2.生物标志物(biomarker)定义为客观测量和评估正常生物过程、病理过程或者是对治疗干预的药物学反应的生化指标。生物标志物也被称为分子标记，可以被用来观察人体对疾病治疗情况的反应。寻找癌症潜在的生物标志物对癌症研究有着重大的意义。近年来研究表明，生物标志物在癌症研究中的应用，主要有以下三个方面，即诊断、预后、预测。在诊断方面，主要表现为癌症早期的诊断。在预后方面，指预测癌症的自然病程，患者预后是否良好。预测方面主要指病人对治疗的反应。2011年美国国家综合癌症网络(national comprehensive cancer network，nccn)将生物标志物分为四类：诊断标志物、预后标志物、预测标志物、联合诊断标志物。
3.葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，uvm)是一种少见的眼病，但却是眼内原发肿瘤中最常见的一种。葡萄膜黑色素瘤在任何年龄均可发生，青少年发病较少，随着年龄的增长发病率迅速增加。葡萄膜黑色素瘤起源于虹膜或脉络膜睫状体的神经外胚层黑素细胞。葡萄膜黑色素瘤发病可能与染色体变异及基因改变有关，还可能由葡萄膜痣转变而来，但具体原因仍不清楚。深入研究葡萄膜黑色素瘤的发生发展机制，寻找葡萄膜黑色素瘤的生物标志物，对于葡萄膜黑色素瘤的诊断具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是基于葡萄膜黑色素瘤的生物标志物提供一种葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型，为实现该目的，本发明采用了如下技术方案：
5.本发明一方面提供了一种葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型，所述的葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型以生物标志物表达水平作为输入变量，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和/或hcp5。
6.在本发明中，术语“生物标志物”意指化合物，优选是基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。术语“生物标志物”通常是指一种基因的存在/浓度/含量或两种或更多种基因的存在/浓度/含量。在本发明中，所述生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和/或hcp5。生物标志物例如slc12a3(solute carrier family 12member 3，gene id：6559)、slc12a9(solute carrier family 12member 9，gene id：56996)、mir140(microrna 140，gene id：406932)、hcp5(hla complex p5，gene id：10866)；包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的标志物。该术语涵盖标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。gene id可在https://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。
7.生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。
8.优选地，生物标志物以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10，如使用韦尔奇氏t检验(welch's t-test)或wilcoxon秩和检验(wilcoxon's rank-sum test)所确定的水平差异地存在。
9.进一步，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和hcp5的组合。
10.进一步，所述的葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型是采用多因素cox回归分析构建得到。
11.进一步，所述的葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型的公式为slcmhscore＝exp(-0.25982*mir140 0.27088*hcp5 0.02578*slc12a3 0.97102*slc12a9-18.23654)。
12.本发明另一方面提供了生物标志物在构建前面所述的葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型中的应用，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和/或hcp5。
13.进一步，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和hcp5的组合。
14.本发明还提供了一种葡萄膜黑色素瘤预后风险评估系统，所述的系统包括计算单元，所述的计算单元利用前面所述的预后风险评估模型计算风险得分。
15.进一步，所述的系统还包括检测单元，所述的检测单元用于检测生物标志物的表达水平，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和/或hcp5。
16.进一步，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和hcp5的组合；
17.进一步，所述的系统还包括信息获取单元，所述的信息获取单元用于执行获取受试者检测信息的操作，所述的检测信息包括所述生物标志物的表达水平。
18.进一步，所述的系统还包括评估单元，所述的评估单元用于执行根据所述的计算单元的计算结果判断受试者葡萄膜黑色素瘤预后的风险高低，给出合理化预防和治疗建议。
19.进一步，所述的系统还包括结果显示单元，所述的结果显示单元用于显示所述的评估单元得出的结论。
20.进一步，所述的结果显示单元通过屏幕显示、声音播报或打印的方式显示结果。
21.本发明还提供一种计算机可读存储介质，所述的计算机可读存储介质包括存储的计算机程序，其中，在所述的计算机程序运行时控制所述的计算机可读存储介质所在装置执行前面所述的葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型。
22.应当理解，本文使用的“系统”、“装置”、“单元”是用于区分不同级别的不同组件、元件、部件、部分或装配的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换所述词语。
23.所属技术领域的技术人员知道，本发明可以实现为设备、方法或计算机程序产品。因此，本公开可以具体实现为以下形式，即：可以是完全的硬件、也可以是完全的软件(包括固件、驻留软件、微代码等)，还可以是硬件和软件结合的形式，本文一般称为“单元”或“系统”。此外，在一些实施例中，本发明还可以实现为在一个或多个计算机可读介质中的计算机程序产品的形式，该计算机可读介质中包含计算机可读的程序代码。
24.可以采用一个或多个计算机可读的介质的任意组合。计算机可读介质可以是计算机可读信号介质或者计算机可读存储介质。计算机可读存储介质例如可以是但不限于电、磁、光、电磁、红外线、或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。计算机可读存储介质的更具体的例子(非穷举的列表)包括：具有一个或多个导线的电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、可擦式可编程只读存储器(eprom或闪存)、光纤、便携式紧凑磁盘只读存储器(cd-rom)、光存储器件、磁存储器件，或者上述的任意合适的组合。在本文件中，计算机可读存储介质可以是任何包含或存储程序的有形介质，该程序可以被指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用。
25.计算机可读的信号介质可以包括在基带中或者作为载波一部分传播的数据信号，其中承载了计算机可读的程序代码。这种传播的数据信号可以采用多种形式，包括但不限于电磁信号、光信号或上述的任意合适的组合。计算机可读的信号介质还可以是计算机可读存储介质以外的任何计算机可读介质，该计算机可读介质可以发送、传播或者传输用于由指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用的程序。
26.计算机可读介质上包含的程序代码可以用任何适当的介质传输，包括但不限于无线、电线、光缆、rf等等，或者上述的任意合适的组合。
27.可以以一种或多种程序设计语言或其组合来编写用于执行本发明操作的计算机程序代码，所述程序设计语言包括面向对象的程序设计语言—诸如java、smalltalk、c ，还包括常规的过程式程序设计语言诸如“c”语言或类似的程序设计语言。程序代码可以完全地在用户计算机上执行、部分地在用户计算机上执行、作为一个独立的软件包执行、部分在用户计算机上部分在远程计算机上执行、或者完全在远程计算机或服务器上执行。在涉及远程计算机的情形中，远程计算机可以通过任意种类的网络包括局域网(lan)或广域网(wan)连接到用户计算机，或者，可以连接到外部计算机(例如利用因特网服务提供商来通过因特网连接)。
28.本发明还提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备用于葡萄膜黑色素瘤预后诊断的产品中的应用，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和/或hcp5。
29.进一步，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和hcp5的组合。
30.在本发明中，术语“样本”或“测试样本”指获自或衍生自目的个体的生物试样，生物试样的供给源可以是新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或从活检或引物产生的固体组织；血液或任意血液组分。术语“样本”或“测试样本”包括在其获得后以任意方式操作过的生物样本，如通过试剂处理、稳定化、或针对某些成分(如蛋白质或多核苷酸)富集、或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。
31.进一步，所述的试剂包括能够检测所述生物标志物的mrna的表达水平的试剂。
32.进一步，所述的检测标志物的mrna的表达水平使用选自聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、
原位杂交法、核酸微阵列、rna印迹或dna芯片的方法中的任何一种来进行。
33.进一步，所述的试剂包括能够检测所述生物标志物的编码蛋白的表达水平的试剂。
34.进一步，所述的检测标志物的编码蛋白的表达水平使用选自多重邻位延伸分析、酶联免疫吸附、放射免疫测定、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选、质谱分析、mrm测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定或蛋白质芯片测量中的任何一种来进行。
35.进一步，所述的试剂包括：
36.与所述生物标志物基因特异性结合的引物或探针；
37.与所述生物标志物蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体或化合物。
38.本文使用的术语“引物”是识别靶基因序列的短核酸序列的链，其包括一对正反向引物。具体地，所述“引物”包括一对提供特异性和灵敏度的分析结果的引物。引物被认为在用于扩增靶基因序列时提供高度特异性，但它不引起与靶基因序列不一致或互补的非靶序列的扩增。
39.本文使用的术语“探针”是指特异性结合至样品中待检测的靶标的物质。通过所述结合，探针可确定样品中靶标的存在。只要它通常用于本领域中，任何探针都可用于本公开内容。特别地，所述探针可以是pna(肽核酸)、lna(锁核酸)、肽、多肽、蛋白、rna或dna，最优选pna。具体地，所述探针是一种生物材料，其可以来自有机体或可以体外合成、或是其模拟物。例如，所述探针可以是酶、蛋白、抗体、微生物、动物或植物细胞或器官、神经元、dna或rna。dna可包括cdna、基因组dna和寡核苷酸。同样地，基因组rna、mrna和寡核苷酸可落入rna的范围内。蛋白的实例包括抗体、抗原、酶和肽。
40.本文使用的术语“反义”是指具有核苷酸碱基序列和亚基-亚基骨架的寡聚体，所述骨架允许反义寡聚体通过watson-crick碱基配对与rna中的靶序列杂交以在靶序列中形成rna:寡聚体异源双链核酸分子。
41.本文所使用的术语“抗体”是本领域众所周知的，是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。本发明中的抗体是指与本发明的标志物蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体。抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(诸如fab、fab'、f(ab')2和fv片段)、单链fv(scfv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。
42.本文所使用的术语“肽”具有与靶物质高度结合的能力，并且在热处理/化学处理期间不会发生变性。而且，由于其尺寸小，可以通过将其附接到其它蛋白上而用作融合蛋白。具体而言，因为可以特异性地附接到高分子蛋白链上，它可以用作诊断试剂盒和药物递送物质。
43.本文所使用的术语“适配体”是指一种由特定类型的单链核酸(dna、rna或修饰的核酸)组成的多核苷酸，所述单链核酸自身具有稳定的三级结构，并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子结合的特性。如上所述，由于适配体可以像抗体那样特异性结合抗原性物质，但比蛋白更稳定并具有简单的结构，并且是由易于合成的多核苷酸组成，因此可以代
替抗体来使用。
44.进一步，所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
45.在本发明中，所述试剂盒包含检测样本中如前面所述生物标志物的试剂。例如，所述试剂盒可以是rt-pcr试剂盒、dna芯片试剂盒、elisa试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒、或mrm(多反应监测)试剂盒。
46.例如，所述诊断试剂盒可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。rt-pcr试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物。各引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的序列的核苷酸，其长度可为约7至50bp，更特别为约10至39bp。此外，所述试剂盒可进一步包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物。此外，所述rt-pcr试剂盒可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液(不同ph值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dntp)、酶(例如taq聚合酶和反转录酶)、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、depc-水、和无菌水。
47.此外，本公开内容的诊断试剂盒可包含用于操作dna芯片所必需的元件。所述dna芯片试剂盒可包含与基因或cdna或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外，所述底物可包含对照基因或cdna或相当于其片段的寡核苷酸。
48.在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒可包含用于进行elisa所必需的元件。所述elisa试剂盒可包含特异性针对蛋白的抗体。所述抗体具有针对标记物蛋白的高选择性和亲合力，与其他蛋白无交叉反应性，并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，所述elisa试剂盒可包含特异性针对对照蛋白的抗体。此外，所述elisa试剂盒可进一步包含能够检测被结合的抗体的试剂，例如，标记的第二抗体、发色团、酶(例如，与抗体缀合)、及其底物或能够结合所述抗体的物质。
49.本发明还提供了生物标志物在构建前面所述的葡萄膜黑色素瘤预后风险评估系统中的应用，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和/或hcp5。
50.进一步，所述的生物标志物包括slc12a3、slc12a9、mir140和hcp5的组合。
51.本发明具有的优点和有益效果：
52.本发明首次提供了一种葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型，即通过检测葡萄膜黑色素瘤患者样本中slc12a3、slc12a9、mir140和hcp5表达水平并进行综合评分来作为评判参数，高评分提示葡萄膜黑色素瘤患者的预后较差。
附图说明
53.图1是slc12家族基因对葡萄膜黑色素瘤临床结果影响的分析结果图，其中，图a是slc12家族基因表达水平对os和dss影响的森林图；图b是根据slc12a3表达水平对os和dss进行kaplan-meier分析的结果图；图c是根据slc12a9表达水平对os和dss进行kaplan-meier分析的结果图；图d是slc12a3和slc12a9与其他临床特征的多变量cox比例风险回归分析结果图；图e是slc12家族基因相关性热图；图f是基于slc12a3和slc12a9分组的热图；图g是基于slc12a3和slc12a9分组的os和dss的kaplan-meier生存曲线；
54.图2是过表达slc12a3和/或slc12a9对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响的分析结果图，其中，图a是免疫染色的阴性对照结果图，图b是uvm黑色素瘤组织的slc12a9免疫染色
结果图，图c是uvm黑色素瘤组织的slc12a3免疫染色结果图，图d是western blotting分析过表达细胞c918和mum2c中slc12a9的蛋白质水平结果图，图e是western blotting分析过表达细胞c918和mum2c中slc12a3的蛋白质水平结果图，图f是c918在slc12a9过表达后的生长曲线图，图g是c918在slc12a3过表达后的生长曲线图，图h是mum2c在slc12a9过表达后的生长曲线图，图i是mum2c在slc12a3过表达后的生长曲线图，图j是过表达slc12a9的c918细胞的克隆形成分析及其定量结果图，图k是过表达slc12a3的c918细胞的克隆形成分析及其定量结果图，图l是过表达slc12a9的mum2c细胞的克隆形成分析及其定量结果图，图m是过表达slc12a3的mum2c细胞的克隆形成分析及其定量结果图；
55.图3是敲低slc12a3和slc12a9对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响的分析结果图，其中，图a是特异性sirna对slc12a3或slc12a9基因敲除效率的分析结果图，图b是敲除slc12a3和/或slc12a9后c918细胞的生长曲线图，图c是敲除slc12a3和/或slc12a9后mum2c细胞的生长曲线图，图d是敲除slc12a3和/或slc12a9后c918细胞的克隆形成分析结果图；图e是及敲除slc12a3和/或slc12a9后c918细胞的克隆形成分析定量图，图f是敲除slc12a3和/或slc12a9后mum2c细胞的克隆形成分析结果图，图g是敲除slc12a3和/或slc12a9后mum2c细胞的克隆形成分析定量图，图h是敲除slc12a3和/或slc12a9后c918细胞edu染色结果图，图i是敲除slc12a3和/或slc12a9后c918细胞edu染色定量分析结果图，图j是敲除slc12a3和/或slc12a9后mum2c细胞edu染色结果图，图k是敲除slc12a3和/或slc12a9后mum2c细胞edu染色定量分析结果图；
56.图4是分析cerna相关风险模型预测生存期的优越性、稳健性的实验结果图，其中，图a是cerna网络构建流程图，图b是mir140或hcp5高表达患者和低表达患者的os和dss的kaplan-meier生存曲线图，图c是风险评分的分布、患者的生存状态和分子表达模式图，图d是tcga队列中预后风险评分模型的kaplan-meier分析和3、5年的timeroc曲线图，图e是gse22138队列中预后风险评分模型的kaplan-meier分析和3、5年的timeroc曲线图，图f是gse84976队列中预后风险评分模型的kaplan-meier分析和3、5年的timeroc曲线图。
57.图5是slc12a3和/或slc12a9预测葡萄膜黑色素瘤预后的时间依赖性roc分析结果，其中，图a是slc12a3的时间依赖性roc分析图，图b是slc12a9的时间依赖性roc分析图，图c是slc12a3和slc12a9的时间依赖性roc分析图。
具体实施方式
58.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
59.实验方法
60.1、uvm患者队列获取
61.从ucsc xena数据库(https://xena.ucsc.edu/)获得80例uvm患者的肿瘤基因组图谱(tcga)转录谱(mrna，mirna，lncrna)和临床资料。本研究排除了3例福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)的uvm样本。从geo数据库中下载得到两个具有微阵列表达谱和临床数据的独立uvm队列，其登录号为gse84976(n＝28)和gse22138(n＝63)。
62.2、差异表达基因(deg)分析
63.用双尾非配对mann-whitney u检验筛选不同组间差异表达的mrnas(demrnas)、mirnas(demirnas)和lncrnas(delncrnas)。只保留有在至少80％的样本中表达的mrnas。
64.demirnas和delncrnas筛选标准：log2(fold change)》1(上调)或《-1(下调)，fdr《0.05。
65.demrnas筛选标准：log2(fold change)》2(上调)或《-2(下调)，fdr《0.05。
66.3、功能富集分析
67.使用r包clusterprofile(18)进行go和kegg途径富集分析，确定显著富集的go生物学过程(bp)terms和kegg途径。然后，使用r包goplot计算z得分以确定丰富的terms或路径是更有可能减少(负值)还是增加(正值)。利用基因集富集分析软件(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp).对不同亚型中丰富或过度表达的基因集进行分析。
68.4、肿瘤免疫微环境的计算定量
69.从charoentong的研究(charoentong p,finotello f,angelova m,mayer c,efremova m,rieder d,et al.pan-cancer immunogenomic analyses reveal genotype-immunophenotype relationships and predictors of response to checkpoint blockade.cell rep.2017；18(1):248-62.)中获得了与16个免疫细胞亚群相关的基因概要。使用具有r包的特定基因集的单样本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis，ssgsea)量化每个患者在肿瘤免疫微环境中的16个免疫细胞亚群的相对丰度。
70.5、网络分析
71.使用pearson相关系数测量基因之间的共表达关系，并使用pearson’s|r|》0.2和p《0.05的基因对构建基因共表达网络，剔除重复边和自环后可视化。使用分子复合物检测(molecular complex detection，mcode)算法生成高度连接的基因模块，node score cutoff为0.1，其他参数设置为默认值。
72.失调的竞争性内源性rna(competing endogenous rna，cerna)网络是基于cerna假设构建如下：
73.1)从encori、targetscan(release 8.0)和mirdip检索人类mirna-slc12a3/a9和mirna-lncrnas相互作用；
74.2)demirnas与slc12a3/a9、demirna与delncrnas、delncrnas与slc12a3/a9的表达相关性采用pearson相关系数测量；
75.3)选择delncrna-slc12a3/a9正相关(pearson's r》0.2)且被相同的demirna下调(pearson's r《-0.2)的slc12a3/a9-demirna-delncrnas三联体作为cerna三联体。这些cerna三联体被整合到一个cerna网络中。
76.6、细胞培养和基因敲除
77.葡萄膜黑色素瘤细胞株c918和mum2c采用10％胎牛血清和抗生素的dmem(gibco)培养基，置于5％co2，37℃条件下培养。在sirna研究中，细胞在12孔板中培养至约50％融合，然后用lipojet
tm
试剂(signagen)转染40pmol的sirna。sirna由中国上海基因制药有限公司设计合成，序列如下所示：
78.si-nc：5
’‑
uucuccgaacgugucacgutt(seq id no.1)；
79.si-slc12a9：5
’‑
gcattgggctcatgttcta(seq id no.2)；
80.si-slc12a3：5
‘‑
gcccacauaugagcacuautt(seq id no.3)。
81.7、采用慢病毒感染进行基因过表达
82.slc12a3过表达慢病毒(nm_001126108)购自吉凯基因有限公司(中国上海)，而slc12a9过表达慢病毒(nm_020246)购自易锦生物技术有限公司(中国广州)。感染前1天，将c918细胞在12孔板中培养至约50％的融合度。然后将10μl slc12a3或slc12a9过表达慢病毒(2
×
108tu/ml)加入无fbs的dmem中约6小时，细胞在完全培养基中培养。感染后72小时，通过western blotting分析slc12a3或slc12a9蛋白。
83.8、western blotting
84.用pbs洗涤uvm细胞并用ripa(biyuntian,china)在冰上裂解30分钟。通过sds-page分离等量的蛋白质裂解物并转移到pvdf膜上，在室温下用5％脱脂牛奶封闭2小时，然后在4℃下一抗孵育过夜。一抗包括：抗slc12a9抗体(1:1000,huabio china),抗slc12a3抗体(1:1000,abcam,ab233401)，或抗gapdh抗体(1:4000，cell signaling technology，5174s)。在室温下用荧光素结合二级抗体(li-cor)在2小时内鉴定一级抗体，并使用odys seyclx系统(li-cor)分析印迹，使用imagej软件对条带进行定量密度测定。
85.9、细胞生长曲线分析
86.采用cell counting kit-8试剂盒(cck-8，beyotime biotechnology co.，ltd)分析细胞存活率。将1 000个黑素瘤细胞置于96孔培养板培养，分别于0h、24h、48h、78h、96h时加入cck-8工作液10ul 2小时后测定450nm处的光密度值。
87.10、edu掺入法
88.带有alexa fluor 594的beyoclick
tm
edu细胞增殖试剂盒购自碧云天生物技术公司(中国上海)。将细胞置于6孔板中培养，并在10μmol/l edu工作溶液中于37℃孵育2小时。然后，将细胞在室温下于4％聚甲醛中固定15分钟，并在黑暗中与0.3％triton x-100一起孵育15分钟。细胞核在室温下用dapi染色5分钟后，在倒置荧光显微镜下观察细胞。
89.11、免疫组化(ihc)染色
90.组织标本进行免疫组化分析，切片厚度为5μm。用二甲苯脱蜡，用一系列分级酒精洗涤水化，使用edta 100℃进行抗原热修复20min并在pbs中冲洗。抗体包括：抗slc12a9抗体(1：200，huabio，china)，抗slc12a3抗体(1：200，ab233401，abcam，usa)。使用相同的方案并行处理阴性对照，但省略一抗，并使用leica dm750自动显微镜系统捕获图像。
91.12、统计分析
92.所有分析均在r版本3.6中进行。通过使用双尾wilcoxon秩和检验确定两组之间连续变量的统计差异。每个实验重复3次，结果以平均值
±
标准差(sd)表示。采用student's t检验评估实验组和对照组之间的统计学显着性。采用r包生存的coxph函数，建立单因素和多因素cox比例风险回归模型，检验特定因素和临床变量对患者生存的影响。计算风险比(hazard ratio，hr)和95％可信区间(ci)。采用kaplan-meier法和log-ranch检验评估各组间的生存差异。对r包“hmisc”进行相关分析，使用r包“corrplot”进行相关矩阵可视化。绘制时间依赖的受试者工作特征(time-dependent receiver operating characteristic，timeroc)曲线通过r包“timeroc”评估预后模型的性能，并计算曲线下面积(auc)。p＜0.05被认为具有统计学意义。
93.实施例1slc12a3和slc12a9表达水平与uvm患者预后相关性
94.为了评价slc12s与uvm患者预后之间的关系，本发明在tcga-uvm队列中进行了单变量cox回归分析。结果显示，slc12a3和slc12a9的高表达与较差的总生存期(os)显著相关(slc12a3:hr＝1.16,95％ci＝1.03-1.29,p＝0.01；slc12a9:hr＝2.36,95％ci＝1.14-4.88,p＝0.02)，和疾病特异性生存(disease-specif ic survival，dss)显著相关(slc12a3:hr＝1.16,95％ci＝1.03-1.31,p＝0.01；sl c12a9:hr＝2.55,95％ci＝1.20-5.45,p＝0.02)，而其他slc12家族成员没有呈现显著相关(如图1a所示)。
95.生存分析还显示，根据slc12a3和slc12a9表达水平可将77例uvm患者分为os和dss差异显著的高危组和低危组(log-rank p《0.05)(如图1b和1c所示)。在性别、年龄、分期等多因素cox回归分析中，slc12a3、slc12a9与os仍保持显著相关性(slc12a3:hr＝1.20,95％ci＝1.1-1.4,p＝0.005；slc12a9:hr＝2.44,95％ci＝1.10-5.70,p＝0.038)，和dss仍显著相关(slc12a3:hr＝1.20,95％ci＝1.04-1.40,p＝0.009；slc12a9:hr＝2.70,95％ci＝1.10-6.50,p＝0.031)(如图1d所示)，说明slc12a3和slc12a9是影响临床结局的独立预后因素。本发明采用时间依赖性roc分析比较患者在3年的预测能力，如图5所示，slc12a3的3年auc为0.68；slc12a9的3年auc为0.67，slc12a3和slc12a9联合预测预后的3年auc为0.74。上述结果表明slc12a3和slc12a9在uvm患者中具有较好的预后预测能力。
96.本发明测量了slc12家族成员之间的表达相关性，发现slc12a3和slc12a9之间没有显著的相关性(如图1e所示)。进一步研究slc12a3与slc12a9联合应用是否对患者预后有协同作用。根据slc12a3和slc12a9的表达水平将所有患者分为4个危险组。如图1g所示，四个危险组之间的os和dss存在显著差异(os:log-rank p＝0.015；dss:log-rank p＝0.016)。slc12a3和slc12a9高表达的患者(称为a3ha9h组)os和dss最差，而slc12a3和slc12a9低表达的患者(称为a3
l
a9
l
组)os和dss最长。这些发现表明，将slc12a3和slc12a9联合预测预后的效果优于单个标志物。
97.实施例2过表达slc12a3和/或slc12a9对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响
98.本发明采用免疫组化方法分析了slc12a3和slc12a9在葡萄膜黑色素瘤组织中的表达。免疫组化染色显示，slc12a3和slc12a9在正常视网膜癌旁组织中低表达，在葡萄膜黑色素瘤组织中高表达(如图2a-c所示)。为了研究slc12a3和slc12a9在葡萄膜黑色素瘤中的功能作用，本发明利用慢病毒感染在葡萄膜黑色素瘤细胞系c918和mum2c中过表达slc12a3和slc12a9。western blotting结果显示，过表达的细胞株中slc12a3和slc12a9蛋白水平分别升高(如图2d和图2e所示)。细胞生长曲线显示，与egfp对照组相比，过表达sl c12a3和slc12a9均可增加细胞增殖活性(如图2f-i所示)。此外，过表达sl c12a3和slc12a9也加速了葡萄膜黑色素瘤细胞的集落形成(如图2j-m所示)。这些结果清楚地表明，slc12a3和slc12a9在葡萄膜黑色素瘤中均高表达，并促进葡萄膜黑色素瘤细胞增殖。
99.实施例3敲低slc12a3和slc12a9对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响
100.本发明敲低葡萄膜黑色素瘤细胞系中的slc12a3或slc12a9，或将slc12a3和slc12a9同时敲低，发现si-slc12a3(简称si-a3)和si-slc12a9(简称si-a9)都能分别有效地敲低slc12a3和slc12a9(如图3a所示)。细胞生长曲线显示，敲低slc12a3和slc12a9能抑制c918细胞的增殖(如图3b所示)。同时在c918细胞中同时敲低slc12a3和slc12a9对细胞增殖的抑制作用更强(如图3b所示)。为了在其他葡萄膜黑色素瘤细胞系中进一步证实该结
果，本发明还在mum2c细胞中敲低了slc12a3和slc12a9，细胞生长曲线也显示，slc12a3和slc12a9敲低的细胞的增殖受到抑制(图3c)。与细胞增殖数据一致，敲低slc12a3和slc12a9可降低c918和mum2c细胞的集落形成，而同时敲低sl c12a3和slc12a9具有协同作用(图3d-g)。此外，与nc细胞相比，在c918(如图3h和图3i所示)和mum2c细胞(图3j和k)中，slc12a3或slc12a9基因敲低后，细胞中的edu染色阳性的细胞比例降低(edu标志着s期增殖细胞)。
101.实施例4slc12a3/a9-mir140-hcp5轴的预后风险评分模型构建
102.为了进一步研究slc12a3/a9参与葡萄膜黑色素瘤的调控机制，本发明构建了一个失调的slc12a3/a9-mirna-lncrna cerna 网络，如图4a所示。结果发现lncrnahcp5可能作为cerna通过竞争共享mir140来调节slc12a3和slc12a9的表达。
103.此外，tcga-uvm队列的生存分析还显示，mir140低表达和hcp5高表达与不良的os和dss显著相关(图4b)，提示slc12a3/a9-mir140-hcp5cern a调节轴可能成为uvm患者新的预后生物标志物和潜在的治疗靶点。为了确定slc12a3/a9-mir140-hcp5轴的预后价值，本发明采用tcga-uvm队列的回归分析，建立了slc12a3/a9-mir140-hcp5轴的预后风险评分模型exp(-0.25982*mir140 0.27088*hcp5 0.02578*slc12a3 0.97102*slc12a9-18.23654)(简称slcmhscore)，并将77例患者分为高危组(n＝38)和低危组(n＝39)，两组患者的生存率差异显著(hr＝4.61,95％ci 1.77-12,log-rank p《0.001)。cerna风险模型预测3年和5年生存率的时间依赖性roc(time-dependent roc)，分析结果如图4d所示，auc分别为0.81和0.82。采用两个外部uvm队列进行独立验证，预测3年和5年生存率的auc均高于0.7(图4e和图4f)。kaplan-meier曲线显示，在最佳分界点下，slcmhscore高的患者与slcmhscore低的患者相比存活率较低(gse22138:hr＝2.19,95％ci＝1.10-4.36,log-rank p＝0.022；gse84976:hr＝15.61,95％ci＝3.40-71.66,log-rank p《0.001)(图4e和图4f)。
104.以上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。
105.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。
106.此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本技术的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。