一种蛋白印迹法检测试剂盒的制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种蛋白印迹法检测试剂盒的制备方法和应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(英文名称：infection with african swine fever virus，简称：asf)是由非洲猪瘟病毒(英文名称：african swine fever virus，简称：asfv)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％。
3.我国是养猪及猪肉消费大国，生猪出栏量、存栏量以及猪肉消费量均位于全球首位，每年种猪及猪肉制品进口总量巨大。2018年非洲猪瘟在全国爆发，导致大量家猪和种猪的死亡，造成猪肉价格的暴涨。
4.经过各大养猪场惨痛的检验和教训，制定出非洲猪瘟的预防和控制措施。就是加大检测力度，尽量在最早期发现传染源，并进行相应的隔离措施。
5.目前最主要的检测方法是使用核酸检测。但是一种检测方法难免存在假阳性和假阴性。因此抗体检测作为核酸检测的补充。而常用的抗体检测有elisa和金标快速试剂。但是elisa试剂和金标试剂存在一定比例的假阳性，因此非常有必要开发抗体检测的金标准试剂——免疫印迹法来确认elisa和金标试剂阳性结果的正确性。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服现有技术中elisa试剂和金标试剂的假阳性、准确度不高等难题，提供一种蛋白印迹法检测试剂盒的制备方法和应用，该蛋白印迹法检测试剂盒比胶体金标记要灵敏1～6倍，并且主要包被p30、p54、p66、p72等重组抗原，利于提供更多的抗体结合位点，提高了检测灵敏度。本发明的技术方案为：
7.第一个方面，本发明提供一种蛋白印迹法检测试剂盒，至少包括：包埋重组抗原的硝酸纤维素膜和碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg。
8.进一步地，所述重组抗原包括非洲猪瘟病毒的p30、p72、p54、p66抗原。
9.进一步地，所述试剂盒还包括洗膜缓冲液，所述洗膜缓冲液按照终浓度的组成为：na2hpo4·
12h2o，(2.0～5.0)
×
10-3
g/ml；nah2po4·
2h2o，(3～6.5)
×
10-3
g/ml；nacl，(7～9)
×
10-3
g/ml；tween-20，5～20％(v/v)；溶剂为纯化水。
10.优选地，所述洗膜缓冲液按照重量份组成为：na2hpo4·
12h2o，3.0
×
10-3
g/ml；nah2po4·
2h2o，4.2
×
10-3
g/ml；nacl，8.5
×
10-3
g/ml；tween-20，20％(v/v)；溶剂为纯化水。
11.进一步地，所述试剂盒还包括底物液，所述底物液按照质量百分比的组成为：bcip(5-溴-4-氯-3-引哚基磷酸盐)，0.02％；nbt(氮蓝四唑)，0.02％；溶剂为柠檬酸盐缓冲液。
12.进一步地，所述试剂盒还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液按照终浓度的组成为：
nacl，5～8％(wt/v)；kcl，0.03～0.08％(wt/v)；山羊血清，5～10％(wt/v)；tris-hcl(ph7.0
±
0.1)，0.1mol/l；proclin300，0.05～0.1％(v/v)。
13.优选地，所述反应缓冲液按照终浓度的组成为：nacl，5％(wt/v)；kcl，0.05％(wt/v)；山羊血清，10％(wt/v)；tris-hcl(ph7.0
±
0.1)，0.1mol/l；proclin300，0.05％(v/v)。
14.第二个方面，本发明提供上述蛋白印迹法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
15.步骤1，将重组抗原于电压100v、电流1～2a的条件下在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，通电时间为45min；
16.步骤2，将步骤1获得的产物采用转膜液进行转膜处理；
17.步骤3，将转膜处理后的膜浸泡在封闭液内进行封闭处理；之后将膜风干得到包埋重组抗原的硝酸纤维素膜；
18.步骤4，采用过碘酸钠法将活化的碱性磷酸酶对鼠抗猪igg进行标记，之后透析去除未结合的碱性磷酸酶，得到碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg，再将碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg用含0.12
‰
绿色素的酶标稀释液稀释，并与包埋重组抗原的硝酸纤维素膜一起于2～8℃避光封闭保存。
19.进一步地，所述转膜液按照终浓度的组成为：甘氨酸，(1.5～3.5)
×
10-3
g/ml；tris，(4.5～6.6)
×
10-3
g/ml；sds，(2.0～5.0)
×
10-4
g/ml；甲醇，15～30％(v/v)；溶剂为纯化水。
20.优选地，所述转膜液按照重量份的组成为：甘氨酸，2.9
×
10-3
g/ml；tris，5.8
×
10-3
g/ml；sds，3.7
×
10-4
g/ml；甲醇，20％(v/v)；溶剂为纯化水。
21.进一步地，所述步骤2中转膜处理的参数控制为：砖膜机的电流设定为200ma，处理时间为100min。
22.进一步地，所述封闭液按照重量份的组成为：硼酸(h3bo3)，(2.18～3.92)
×
10-3
g/ml；硼砂(na2b4o7﹒10h2o)，(2.82～3.26)
×
10-3
g/ml；蔗糖，0.02～0.06g/ml；脱脂奶粉，(5～15)
×
10-3
g/ml；proclin300，0.05～0.1％(v/v)，鱼明胶0.01～0.025g/ml；溶剂为纯化水。
23.优选地，所述封闭液按照重量份的组成为：硼酸(h3bo3)，3.92
×
10-3
g/ml；硼砂(na2b4o7﹒10h2o)，3.26
×
10-3
g/ml；蔗糖，0.05g/ml；脱脂奶粉，0.01g/ml；proclin300，0.05％(v/v)；鱼明胶，0.02g/ml；溶剂为纯化水。
24.进一步地，所述步骤3中封闭处理的参数控制为：温度33～37℃，处理时间3～6小时。
25.进一步地，所述酶标稀释液按照重量份组成为：硼酸(h3bo3)，(2.18～3.92)
×
10-3
g/ml；硼砂(na2b4o7·
10h2o)，(2.82～3.26)
×
10-3
g/ml；蔗糖，0.02～0.05g/ml；小牛血清，15～25％(v/v)；proclin300，0.05-0.1％(v/v)；溶剂为纯化水。
26.优选地，所述酶标稀释液按照重量份组成为：硼酸(h3bo3)，3.92
×
10-3
g/ml；硼砂(na2b4o7·
10h2o)，3.26
×
10-3
g/ml；蔗糖，0.05g/ml；小牛血清，20％(v/v)；proclin300，0.05％(v/v)；溶剂为纯化水。
27.进一步地，当所述试剂盒还包括洗膜缓冲液时，所述制备方法还包括：按照洗膜缓冲液的组成配料，混合均匀后与包埋重组抗原的硝酸纤维素膜和碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg于2～8℃避光封闭保存。
28.进一步地，当所述试剂盒还包括底物液时，所述制备方法还包括：按照底物液的组
成配料，混合均匀后与包埋重组抗原的硝酸纤维素膜和碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg于2～8℃避光封闭保存。
29.进一步地，当所述试剂盒还包括反应缓冲液时，所述制备方法还包括：按照反应缓冲液的组成配料，混合均匀后与包埋重组抗原的硝酸纤维素膜和碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg于2～8℃避光封闭保存。
30.第三个方面，本发明提供上述蛋白印迹法检测试剂盒或者上述制备方法获得的蛋白印迹法检测试剂盒在非诊断目的的非洲猪瘟病毒抗体检测中的应用。
31.进一步地，所述应用方法包括：
32.(1)加样：将反应缓冲液、包埋重组抗原的硝酸纤维素膜和待测样品混匀后，于25
±
3℃条件下振荡孵育过夜；
33.(2)洗涤：在步骤(1)的混合物中加入洗膜缓冲液，振荡5分钟，重复2次，除去洗膜缓冲液；
34.(3)加酶结合物：进一步在体系中加入碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg抗体，于25
±
3℃条件下振荡孵育1h；
35.(4)洗板：进一步在体系中加入洗膜缓冲液，振荡5分钟，重复2次，除去洗膜缓冲液；
36.(5)显色：进一步在体系中加入底物液，盖上孵育板，于25
±
3℃条件下振荡孵育15分钟；
37.(6)终止：小心打开孵育板盖，吸出底物液，以蒸馏水洗涤数次以终止反应；
38.(7)判断：根据是否出现条带进行检测结果判断。
39.本发明的有益效果为：本发明的试剂盒具有操作方便、对非洲猪瘟的igg抗体特异性强、准确度高的优点。通过一个试剂盒即可对非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫和/或非洲猪瘟病毒抗体金标试剂检测为阳性的样品进行进一步检测，以确定样品中是否含有抗非洲猪瘟的igg抗体，方便、快速、简捷。
具体实施方式
40.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
41.下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
42.实施例1
43.本实施例提供一种蛋白印迹法检测试剂盒及其制备方法，包括：包埋重组抗原的硝酸纤维素膜、碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg、洗膜缓冲液、底物液、反应缓冲液。
44.具体原料及试剂组成如下：
45.1.原料要求
46.1.1包被原料：p30、p54、p66、p72。
47.1.2碱性磷酸酶标记原料：鼠抗猪igg。
48.1.3膜条：硝酸纤维素膜。
49.2.液体配制
50.2.1洗膜缓冲液的配制：
51.洗膜缓冲液按照重量份组成为：na2hpo4·
12h2o，3.0
×
10-3
g/ml；nah2po4·
2h2o，4.2
×
10-3
g/ml；nacl，8.5
×
10-3
g/ml；tween-20，20％(v/v)；溶剂为纯化水。将前述几种组分按照终浓度组成称取后在纯化水中混合均匀，2～8℃保存备用，有效期12个月。
52.2.2底物液的配制：底物液按照终浓度的组成为：bcip(5-溴-4-氯-3-引哚基磷酸盐)，0.02％；nbt(氮蓝四唑)，0.02％；溶剂为柠檬酸盐缓冲液。按照终浓度组成将bcip和nbt溶于柠檬酸盐缓冲液中，2～8℃保存备用，有效期12个月。
53.2.3反应缓冲液的配制：反应缓冲液按照终浓度的组成为：nacl，5％；kcl，0.05％；山羊血清，10％；tris-hcl(ph7.0
±
0.1)，0.1mol/l；proclin300，0.05％。将前述几种组分按照终浓度组成称取后在纯化水中混合均匀，2～8℃保存备用，有效期12个月。
54.2.4转膜液的配制：转膜液按照重量份的组成为：甘氨酸，2.9
×
10-3
g/ml；tris，5.8
×
10-3
g/ml；sds，3.7
×
10-4
g/ml；甲醇，20％(v/v)；溶剂为纯化水。
55.将前述几种组分按照终浓度组成称取后在纯化水中混合均匀，2～8℃保存备用，有效期12个月。
56.2.5封闭液的配制：封闭液按照重量份的组成为：硼酸(h3bo3)，3.92
×
10-3
g/ml；硼砂(na2b4o7﹒10h2o)，3.26
×
10-3
g/ml；蔗糖，0.05g/ml；脱脂奶粉，0.01g/ml；proclin300，0.05％(v/v)；鱼明胶，0.02g/ml；溶剂为纯化水。将前述几种组分按照终浓度组成称取后在纯化水中混合均匀，2～8℃保存备用，有效期12个月。
57.2.6酶标稀释液的配制：酶标稀释液按照重量份组成为：硼酸(h3bo3)，3.92
×
10-3
g/ml；硼砂(na2b4o7·
10h2o)，3.26
×
10-3
g/ml；蔗糖，0.05g/ml；小牛血清，20％(v/v)；proclin300，0.05％(v/v)；溶剂为纯化水。将前述几种组分按照终浓度组成称取后在纯化水中混合均匀，2～8℃保存备用，有效期12个月。
58.该试剂盒的制备方法为：
59.1.膜条的制备和封装
60.1.1电泳：将重组抗原于电压100v、电流1～2a的条件下在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，通电时间为45min。加样量为20μl。
61.1.2转膜：将步骤1.1获得的产物采用转膜液工作液(甘氨酸，2.9
×
10-3
g/ml；tris，5.8
×
10-3
g/ml；sds，3.7
×
10-4
g/ml；甲醇，20％(v/v))，在转膜机上(电流设定：200ma)运行100min。
62.1.3封闭：将转膜处理后的膜浸泡在封闭液内，膜条应完全浸泡在封闭液内，33～37℃封闭3～6小时。
63.1.4干燥及封装：在滤纸上将膜条风干，待确认干透后立即装入黑色瓶内，并用铝箔封装，盖上瓶盖，并贴上标签。质检合格后，置2～8℃半成品库保存。
64.2.酶结合物制备和分装：采用过碘酸钠法将活化的碱性磷酸酶对鼠抗猪igg进行标记，之后透析去除未结合的碱性磷酸酶，得到碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg。将碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg用含0.12
‰
绿色素的酶标稀释液按确定的工作浓度(硼酸(h3bo3)，3.92
×
10-3
g/ml；硼砂(na2b4o7·
10h2o)，3.26
×
10-3
g/ml；蔗糖，0.05g/ml；小牛血清，20％(v/v)；proclin300，0.05％(v/v))稀释。质检合格后用平头盖塑料瓶分装，贴签。质检合格后，置2
～8℃半成品库保存。
65.实施例2
66.试剂盒在检测非洲猪瘟病毒抗体中的应用
67.1.检测样本的要求
68.血清样本按常规方法由静脉采集。血浆样本可以采用肝素、柠檬酸钠、edta进行处理。5天内测定的样本可放置4℃保存。样本放在-20℃至少可以保存3个月。样本避免溶血或者反复冻融。混浊或者有沉淀的样本要经过离心或者过滤后澄清后再检测。
69.2.检验方法
70.2.1每槽内加入2ml的洗膜缓冲液。用镊子小心取出包埋重组抗原的硝酸纤维素膜润湿，有号码的一端向上，分别放入孵育板槽内。在室温下(25
±
3℃)将孵育板置摇床(每分钟摇摆12至16次)上振荡孵育1至2分钟。用吸液器吸出洗膜缓冲液。
71.2.2加样：进一步在每槽中加入2ml反应缓冲液，随后加入30μl的待测样品，盖好孵育板，于室温下(25
±
3℃)在摇床上振荡孵育过夜；
72.2.3洗涤：进一步在每槽中加入2ml洗膜缓冲液，振荡5分钟，重复2次。用吸液器吸出洗涤缓冲液。
73.2.4加酶结合物：进一步加入2ml碱性磷酸酶标记的鼠抗猪igg抗体。盖好孵育板，于室温下(25
±
3℃)在摇床上振荡孵育60分钟；
74.2.5洗板：进一步在每槽中加入2ml洗膜缓冲液，振荡5分钟，重复2次。用吸液器吸出洗膜缓冲液；
75.2.6显色：进一步加2ml底物液盖上孵育板，于室温下(25
±
3℃)在摇床上振荡孵育15分钟；
76.2.7终止：小心打开孵育板盖，吸出底物液，以蒸馏水洗涤数次以终止反应。
77.2.8判断：根据是否出现条带进行检测结果判断。
78.3.检验结果
79.无条带判为阴性；出现一条条带：判断为可疑；出现二条条带或者二条条带以上判为阳性。
80.实施例3
81.采集100份健康猪血清以及30份非洲猪瘟病毒的血清样本，平行采用实施例1的试剂盒组、elisa试剂以及金标试剂进行检测。检测结果见表1。
82.表1三种试剂盒的检测结果对比
[0083][0084]
表1的数据表明，本发明的试剂盒对健康样本和患病样本的检测准确率为100％，
可对非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫和/或非洲猪瘟病毒抗体金标试剂检测为阳性的样品进行进一步检测，以确定样品中是否含有抗非洲猪瘟的igg抗体，方便、快速、简捷。
[0085]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。