1.本技术涉及蛋白质修饰分析
技术领域：
：，特别是涉及一种分析生物样本中多种蛋白修饰的方法。
背景技术：
：：2.很长时间里，蛋白质修饰或称蛋白修饰的研究并未引起足够的重视，直到2004年泛素化介导蛋白质降解的发现获得诺贝尔奖之后，这一情形才得以改观。迄今，人们已经发现200多种的蛋白质修饰，常见的蛋白质修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂质化和蛋白水解。蛋白质修饰通过在一个或多个氨基酸残基上加上修饰基团，可以改变蛋白质的物理、化学性质，进而影响蛋白质的空间构象、活性、亚细胞定位、蛋白质折叠以及蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质修饰在多种细胞过程，如细胞分裂、蛋白分解、信号传到、调控过程、基因表达调控和蛋白相互作用中起到关键作用。3.在修饰蛋白质组研究领域中，富集得到修饰肽段后利用质谱仪进行分析是普遍的检测技术，常用的质谱扫描方式有数据依赖采集(data-dependentacquisition，dda)和数据非依赖采集(data-independentacquisition，dia)两种模式。dia结合了dda和选择反应监测(selectedreactionmonitoring，srm)的特点，将整个扫描范围等分为若干窗口，每个窗口依次选择，碎裂，采集窗口内所有母离子的全部子离子的信息。4.现有技术对每一种蛋白质修饰都是单独进行检测，以磷酸化蛋白修饰和糖基化蛋白修饰检测为例，如图1所示，如果需要对这两种蛋白修饰进行检测，则需要分别对蛋白质提取和酶解获得的多肽产物进行磷酸化富集和糖基化富集，分别获得磷酸化肽段和糖基化肽段；利用磷酸化肽段获得磷酸化dda谱图库，利用糖基化肽段获得糖基化dda谱图库；然后再分别对磷酸化肽段进行dia模式的质谱数据采集，基于磷酸化dda谱图库分析采集的磷酸化dia数据，获得待测样本的磷酸化蛋白修饰检测结果；对糖基化肽段进行dia模式的质谱数据采集，基于糖基化dda谱图库分析采集的糖基化dia数据，获得待测样本的糖基化蛋白修饰检测结果。5.由此可见，每检测一种蛋白修饰就需要对待测样本进行一次dia数据采集；如果需要对前述常见的八种蛋白质修饰进行检测，则需要进行八次dia数据采集。然而，单次dia数据采集需要消耗2小时质谱仪的机时，一小时机时成本大约400元；仅仅是对一个样本的八种常见蛋白质修饰进行检测就已经价格不菲，如果需要检测更多的其它蛋白修饰，不仅费用会更加昂贵，而且检测周期长、时间成本高。6.因此，如何更高效的分析或检测多种蛋白修饰，是本领域亟待解决的问题。技术实现要素：7.本技术的目的是提供一种改进的分析生物样本中多种蛋白修饰的方法。8.为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：9.本技术公开了一种分析生物样本中多种蛋白修饰的方法，包括按照需要检测的蛋白修饰类型分别对蛋白质酶解消化的肽段进行相应的肽段富集；该蛋白质酶解消化的肽段为提取自待测样本的蛋白质经过酶解消化获得的肽段；将富集的各肽段混合，获得需要检测的蛋白修饰类型的混合肽段；对混合肽段进行一次性的dia采集和/或dda采集；基于需要检测的蛋白修饰类型的肽段相应的dda谱图库，对采集的dia信息和/或dda信息进行分析，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果。10.其中，按照需要检测的蛋白修饰类型分别对蛋白质酶解消化的肽段进行相应的肽段富集，例如，需要检测的蛋白修饰类型为磷酸化蛋白修饰，则按照磷酸化肽段富集的方法进行肽段富集，需要检测的蛋白修饰类型为糖基化蛋白修饰，则按照糖基化肽段富集的方法进行肽段富集。11.需要说明的是，本技术的方法，其关键在于将所有富集的肽段混合在一起，仅仅采用质谱仪一针采集的数据，就可以分析获得待测样本中多种蛋白修饰的分析结果。至于不同修饰蛋白的肽段富集、dda谱图库构建等，都可以参考现有技术，在此不作具体限定。12.本技术的一种实现方式中，本技术的生物样本多种蛋白修饰分析方法还包括，根据富集的肽段分别获得所有需要检测的蛋白修饰类型的肽段相应的dda谱图库。13.需要说明的是，原则上如果已经获得生物样本的dda谱图库，则可以直接使用，无需重复根据富集的肽段进行dda谱图库构建；但是，对于一个新检测样本，或者新增加的需检测蛋白修饰类型而言，则需要先构建富集多肽对应的dda谱图库。14.本技术的一种实现方式中，需要检测的蛋白修饰类型为两种或两种以上的蛋白修饰。15.需要说明的是，本技术的方法，其关键在于可以实现多种蛋白修饰类型的同时检测，即仅仅采用质谱仪一针采集数据，就可以获得多种蛋白修饰分析结果；因此，本技术方法尤其适用于两种或更多种蛋白修饰的检测，例如常见的磷酸化蛋白修饰和糖基化蛋白修饰两种蛋白修饰的同时检测；或者，磷酸化蛋白修饰、糖基化蛋白修饰和乙酰化蛋白修饰三种蛋白修饰的同时检测；又或者，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂质化和蛋白水解八种蛋白修饰的同时检测。原则上，本技术方法可同时检测的蛋白修饰数量不限。16.本技术的一种实现方式中，dda谱图库的建库质谱采集参数包括，采用tims离子淌度模式，扫描范围100-1700m/z，离子淌度范围0.60-1.60v.s/cm2。17.本技术的一种实现方式中，dda谱图库的建库质谱采集参数还包括，离子传输管电压1600v，干燥气流速3.0l/min，干燥温度180℃，挑选10个母离子，碎裂能量10ev。18.本技术的一种实现方式中，dda谱图库由蛋白鉴定软件对采集的dda质谱数据进行分析鉴定获得。19.优选的，蛋白鉴定软件为maxquant、proteomediscoverer或mascot。20.本技术的一种实现方式中，dia采集的参数包括，采用tims离子淌度dia-pasep模式，扫描范围302-1077m/z，1/k0设置0.602-1.336v.s/cm2。21.本技术的一种实现方式中，dia采集的参数还包括，离子传输管电压1600v，干燥气流速3.0l/min，干燥温度180℃，碎裂能量10ev，窗口宽度25m/z，窗口分段数4，每段窗口数8，pasef循环时间100ms。22.本技术的一种实现方式中，基于dda谱图库对采集的dia信息进行分析，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果，具体包括，使用dia蛋白组分析软件，以所有需要检测的蛋白修饰类型的肽段相应的dda谱图库为数据库，进行dia数据分析，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果。23.优选的，dia蛋白组分析软件为skyline、spectronaut或diann。24.本技术的一种实现方式中，基于dda谱图库对采集的dda信息进行分析，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果，具体包括，采用比对分析方法，利用所有需要检测的蛋白修饰类型的肽段相应的dda谱图库解析采集的dda信息，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果。25.优选的，比对分析方法为matchbetweenruns分析方法。26.由于采用以上技术方案，本技术的有益效果在于：27.本技术的生物样本多种蛋白修饰分析方法，将富集的需要检测的蛋白修饰类型的肽段混合，结合各肽段的dda谱图库，只需要对混合肽段采集一次数据，就可以分析获得待测样本中多种蛋白修饰的分析结果；缩短了多种蛋白修饰的检测周期，节约了质谱仪的机时，降低了多种蛋白修饰的检测成本。附图说明28.图1是现有技术分析生物样本中多种蛋白修饰的方法；29.图2是本技术实施例中分析生物样本中多种蛋白修饰的方法；30.图3是本技术实施例中改进的分析生物样本中多种蛋白修饰的方法；31.图4是本技术实施例中改进的另一种分析生物样本中多种蛋白修饰的方法；32.图5是本技术实施例中提取的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。具体实施方式33.下面通过具体实施方式结合附图对本技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他装置、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。34.现有技术中，如果需要对多种蛋白修饰进行检测，如图1所示，通常是先对样本11进行蛋白质提取12；然后对提取的蛋白质进行蛋白质酶解13，获得酶解的肽段；按照需要检测的蛋白修饰类型分别对蛋白质酶解消化的肽段进行相应的肽段富集；例如，对磷酸化蛋白修饰检测，则进行磷酸化富集141获得磷酸化肽段142；根据富集的磷酸化肽段分别进行磷酸化dda谱图库建立1431和磷酸化肽段dia采集1432；最后，基于dda谱图库分析dia数据144，获得磷酸化蛋白修饰检测结果；又例如，对糖基化蛋白修饰检测，则进行糖基化富集151获得糖基化肽段152；根据富集的糖基化肽段分别进行糖基化dda谱图库建立1531和糖基化肽段dia采集1532；最后，基于dda谱图库分析dia数据154，获得糖基化蛋白修饰检测结果。由此可见，现有技术对多种蛋白修饰进行检测，需要每一种蛋白修饰进行一次dia采集，这极大的增加了检测成本和时间。35.本技术创造性的提出，将富集的肽段混合，直接对混合的肽段进行一针采集数据，就可以获得多种蛋白修饰分析结果。如图2所示，同样的，对样本21进行蛋白质提取22；然后对提取的蛋白质进行蛋白质酶解23，获得酶解的肽段；按照需要检测的蛋白修饰类型分别对蛋白质酶解消化的肽段进行相应的肽段富集；例如，对磷酸化蛋白修饰检测，则进行磷酸化富集241获得磷酸化肽段242；对糖基化蛋白修饰检测，则进行糖基化富集251获得糖基化肽段252；这些步骤与现有技术是相同的；所不同的是，本技术的方法，根据富集的磷酸化肽段进行磷酸化dda谱图库建立243，根据富集的糖基化肽段进行糖基化dda谱图库建立253；然后，将所有肽段混合，获得混合肽段26，对混合肽段26进行一次性的肽段样本dia采集27；最后，基于多种图谱库的dia信息分析28，同时获得多种蛋白修饰的检测结果，如图2所示，即同时获得磷酸化蛋白修饰和糖基化蛋白修饰的检测结果。36.本技术的方法，当同时做两个以上修饰蛋白质组时，每种蛋白修饰建立谱图库后，样本dia上机时，每个样本只需要采集一次dia模式数据就能获得两种以上蛋白质修饰的结果；而传统方法一种修饰蛋白检测就需采集一次，两种就采集2次，采集的次数与检测的蛋白修饰类型数目相同。因此，本技术的方法样本数越多、一次分析的蛋白修饰的种类越多，节约的周期和机时成本就越多。如图3所示，其在图2所示方案的基础上，进一步增加了乙酰化蛋白修饰的检测，其中，对样本31进行蛋白质提取32，然后对提取的蛋白质进行蛋白质酶解33，获得酶解的肽段，这些都与图2所示的技术方案相同；只是富集肽段方面增加了相应的乙酰化肽段富集，具体的，针对磷酸化蛋白修饰检测，进行磷酸化富集341获得磷酸化肽段342；对糖基化蛋白修饰检测，进行糖基化富集351获得糖基化肽段352；对乙酰化蛋白修饰检测，进行乙酰化富集361获得乙酰化肽段362；根据富集的磷酸化肽段进行磷酸化dda谱图库建立343，根据富集的糖基化肽段进行糖基化dda谱图库建立353，根据富集的乙酰化肽段进行乙酰化dda谱图库建立363；然后，将所有肽段混合，获得混合肽段37，对混合肽段37进行一次性的肽段样本dia采集38；最后，基于多种图谱库的dia信息分析39，如图3所示，同时获得磷酸化蛋白修饰、糖基化蛋白修饰和乙酰化蛋白修饰的检测结果。37.本技术的方法中，混合肽段是使用dia采集模式进行采集，后续分析中，用多种dda谱图库来辅助样本dia数据解析。在一种改进方案中，也可以对混合肽段进行dda采集，即将混合肽段样本用dda模式采集，再将采集的dda数据，与多种dda谱图库一起分析，采用比对分析方法，如matchbetweenruns的分析方法，利用谱图库数据解析单个样本的dda数据，实现待测样本两个或多个蛋白修饰的同时鉴定及定量。如图4所示，以一针采集磷酸化和糖基化为例，同样的，对样本41进行蛋白质提取42；然后对提取的蛋白质进行蛋白质酶解43，获得酶解的肽段；针对磷酸化蛋白修饰检测，则进行磷酸化富集441获得磷酸化肽段442；对糖基化蛋白修饰检测，则进行糖基化富集451获得糖基化肽段452；根据富集的磷酸化肽段进行磷酸化dda谱图库建立443，根据富集的糖基化肽段进行糖基化dda谱图库建立453；然后，将所有肽段混合，获得混合肽段46，对混合肽段46进行一次性的肽段样本dda采集47，即用dda模式采集；最后，再将磷酸化谱图库数据、糖基化谱图库数据和样本的dda数据一起分析，采用基于matchbetweenrun的dda信息分析48，利用谱图库数据解析单个样本的dda数据，实现磷酸化蛋白组和糖基化蛋白组的同时鉴定及定量，如图4所示。38.实施例39.1.蛋白提取及质控40.(1)蛋白提取41.取6例组织样本，分别命名为a、b、c、d、e、f，每个样本称量50mg转移到2mlep管中，加入600μl蛋白质裂解液(7m尿素、2m硫脲、0.2﹪sds，20mmtris)，6μl蛋白酶抑制剂cocktail(roche，20tablets)以及6μl磷酸酶抑制剂(roche，10tablets)；使用自动化研磨仪将样本研磨成匀浆状态，25000g4℃离心20分钟取500μl上清，上清即为蛋白质溶液；向蛋白质溶液中加入终浓度为10mm的二硫苏糖醇(dtt)在水浴锅中37℃反应30分钟后，再加入终浓度为55mm的碘代乙酰胺(iam)暗室温反应45分钟。42.(2)蛋白定量43.使用bradford方法对蛋白质溶液进行定量，其原理为当bradford染色液(考马斯亮蓝g-250)和蛋白在酸性条件下结合时，最大吸光值波长由465nm转移至595nm，在一定范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正线相关关系；因此可根据标准品吸光值与标准品蛋白质浓度做出标准曲线，定量待测蛋白质浓度，该6例样本在595nm波长下进行测定吸光度值。44.根据表1对浓度为0.2μg/μl的bsa进行取样，测量梯度增加bsa体积样本的吸光值，对吸光值和样本浓度进行拟合，获得吸光值与蛋白质浓度的标准曲线：45.y＝2.001x 0.016546.其中，相关系数为r2＝0.9902，r2大于0.99，说明本例的标准曲线符合要求。47.表1标准曲线样本配制表48.管号12345678910双蒸水/μl2468101214161820bsa/μl181614121086420工作液/μl18018018018018018018018018018049.计算获得样本a、b、c、d、e、f的蛋白质溶液的浓度分别为10.25μg/μl，12.58μg/μl，9.89μg/μl，10.79μg/μl，13.01μg/μl，12.11μg/μl。50.(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳51.每个样本等量取10μg蛋白质，加入1/3蛋白质溶液体积的loadingbuffer，混匀后95℃加热5min，5000g离心1min，取上清点入12％sds聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中，80v恒压电泳30min后再120v恒压电泳120min；电泳结束后，将胶放入快速染脱仪器中10min后，取出胶图扫描。52.聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图5所示，图中，kda为蛋白分子量，m为9个条带的质控品，泳道1为样本a、泳道2为样本b、泳道3为样本c、泳道4为样本d、泳道5为样本e，泳道6为样本f；电泳结果图显示，本例的六个蛋白质样本，其蛋白质条带分布均匀，背景干净，达到合格标准。53.2.酶解54.对已提取好的蛋白质溶液进行酶解，按照蛋白质：胰蛋白酶(hualishiscientific，100ug/瓶)＝40:1(μg:μg)进行加酶，并在37℃水浴锅中反应过夜，次日用stratax柱(phenomenex，tubes-10mg/1ml)进行除盐，真空抽干，得到酶解后的肽段；利用质谱仪对酶解后的肽段进行质控。55.结果显示，六个蛋白质酶解产物的峰型、强度都质控合格，可以用于后续处理。56.3.富集57.由于每一种修饰蛋白的富集方法都不一样，因此该步开始分开技术路线去富集获得不同的修饰蛋白。本例对待测样本进行磷酸化蛋白修饰和糖基化蛋白修饰检测。因此，分别对提取的蛋白质溶液的酶解肽段进行磷酸化肽段富集和糖基化肽段富集。详细如下：58.(1)磷酸化肽段富集59.本例先按照表2配制磷酸化富集试剂，按照表3配制highphrp柱elutionbuffer。60.表2磷酸化富集试剂表[0061]loadingbufferwashbufferelutionbuffer1elutionbuffer2ddh2o15％19％83.3％51.67％100％acn80％80％040％tfa5％1％00gln(谷氨酰胺)30mg/ml00025％氨水0016.7％8.33％[0062]表3highphrp柱elutionbuffer配方[0063]fractionacn(％)acn(μl)0.1％triethylamine(μl)1550950277093038809204990910510100900611110890713130870815150850917170830102020080011252507501250500500[0064]取1.2mg肽段用loadingbuffer稀释成1.0μg/μl备用；以样品:tio2＝1:4称取tio2，向tio2中加入1mlloadingbuffer，室温震荡10min，12000g离心30s，弃上清，保留tio2沉淀；向上述tio2中加入稀释好的肽段样本，于恒温震荡仪中37℃1100rpm震荡1h，磷酸化肽段与tio2结合，即富集反应；将上述震荡完的样品于12000g离心30s，收集上清至另一离心管，同时保留沉淀；向沉淀中加入1mlloadingbuffer，室温圆盘翻转5min，12000g离心30s，弃上清；加入1ml的washbuffer，室温圆盘翻转5min，12000g离心30s，弃上清，重复该步骤4次；加入600μlelutionbuffer1，室温1200rpm震荡20min，12000g离心30s，收集上清；加入500μlelutionbuffer2，室温1200rpm震荡20min，12000g离心30s，收集上清；将两次收集到的上清合并冷冻抽干，即获得富集的磷酸化肽段。[0065](2)糖基化肽段富集[0066]用300μl60％acn/0.1％fa的溶液溶解肽段，充分震荡溶解后，备用；使用hilic柱(merck，5μm，150*4.6mm)，buffera为80％acn/0.1％fa，bufferb为0.1％fa，平衡柱子后进行富集和分组份。馏分从第30min开始收到第54min，每分钟收集一管，共收集24管并标记好；放入冷冻抽干机中抽干，然后每相邻4管用总共50μl的50mmhh4hco3相继复溶合成一管，最终分成6个组份；每个组份加入2.5μlpngasef(biolabs，p0710s)进行脱糖，震荡混匀后离心，37℃水浴过夜；次日放入冷冻抽干机中抽干，即获得富集的糖基化肽段。[0067]4.磷酸化肽段组份分离[0068]富集的各样本磷酸化肽段混合后用300μl0.1％tfa复溶；用highphrp柱(thermoscientificpiercetm)进行组份分离：[0069](1)highphrp柱的活化及平衡：[0070]a.取出柱子，5000g离心2min去除柱中保留液；[0071]b.向柱子中，加300μlacn5000g离心2min洗涤2遍；[0072]c.向柱子中，加300μl0.1％tfa5000g离心2min洗涤2遍；[0073](2)载样：向柱子中，加入复溶样品(300μl)，3000g离心2min，保留ft液(ft)于另一离心管；[0074](3)洗涤：加入300μl水，3000g离心2min，保留wash液(wt)于另一离心管；[0075](4)洗脱：使用表3配制的elutionbuffer依次洗脱，分别标为f1、f2…f12，洗脱时加入300μleutionbuffer，3000g离心2min，收集各洗脱液；[0076](5)洗脱液按[0077]“f1 f7”、“f2 f8”、“f3 f9”、“f4 f10”、“f5 f11”、“f6 f12 ft wt”合并为6个组份，各组份抽干后于-20℃保存备用。[0078]5.质谱上机[0079]使用串联质谱仪timstofpro将分组份后的样本每个采用dda模式采集1小时质谱数据，将每个样本对应的磷酸化富集肽段和糖基化富集肽段混合后采用dia模式采集1小时质谱数据。[0080](1)液相分离条件[0081]使用自装c18色谱柱(75μm内径，1.8μm柱料粒径，约25cm柱长)，buffera：h2o 0.1％fa，bufferb：acn 0.1％fa[0082]液相梯度如表4所示。[0083]表4液相梯度[0084]时间(min)流速(μl/min)b％00.32450.322500.335550.380600.380[0085](2)dda建库质谱采集参数[0086]采用tims离子淌度模式，扫描范围100-1700m/z，离子淌度范围0.60-1.60v.s/cm2。[0087]离子传输管电压1600v，干燥气流速3.0l/min，干燥温度180℃，挑选10个母离子，碎裂能量10ev。[0088](3)dia检测质谱采集参数[0089]采用tims离子淌度dia-pasep模式，扫描范围302-1077m/z，1/k0设置0.602-1.336v.s/cm2。[0090]离子传输管电压1600v，干燥气流速3.0l/min，干燥温度180℃，碎裂能量10ev，窗口宽度25m/z，窗口分段数4，每段窗口数8，pasef循环时间100ms。[0091]6.dda数据的建立[0092]使用蛋白鉴定软件，如maxquant、proteomediscoverer、mascot等软件，分别对磷酸化肽段dda质谱数据和糖基化肽段dda质谱数据进行分析鉴定，分别得到磷酸化蛋白组谱图库和糖基化蛋白组谱图库。本例具体采用maxquant软件进行分析鉴定，获得dda谱图库。谱图库鉴定数目如表5。[0093]表5磷酸化蛋白组及糖基化蛋白组dda谱图库鉴定数目[0094]修饰类型所有肽段数目修饰肽段数目修饰蛋白数目磷酸化蛋白谱图库47826196485608糖基化蛋白谱图库94912118454205[0095]7.数据分析[0096]使用dia蛋白组份析软件，如skyline、spectronaut、diann等软件，以上述建立的磷酸化蛋白组谱图库和糖基化蛋白组谱图库混合得到的混合修饰蛋白组谱图库为数据库进行dia数据的分析，同时得到磷酸化蛋白组和糖基化蛋白组鉴定和定量分析结果。[0097]本例具体采用spectronaut软件进行dia数据的分析，结果见表6。[0098]表6磷酸化肽段与糖基化肽段混合进行dia采集分析结果[0099]样本磷酸化肽段数目磷酸化蛋白数目糖基化肽段数目糖基化蛋白数目a15221402576462747b14325396874942676c13537386975382682d15860414980272866e15863417579652835f16096417480832856[0100]此外，本例按照传统方法分别进行磷酸化蛋白组及糖基化蛋白组dia数据采集，结果见表7。[0101]表7传统方法磷酸化蛋白组及糖基化蛋白组分析结果[0102]样本磷酸化肽段数目磷酸化蛋白数目糖基化肽段数目糖基化蛋白数目a16440434783662967b16071428980892886c15621417981412895d17129448186633095e17132449886023065f17384450887293081[0103]表6和表7的结果显示，本例方法检测的磷酸化肽段数及糖基化肽段数目都较高，仅略低于传统方法结果数目，在实验分析误差范围内。因此，本例方法完全能够满足市场及科学研究需求；并且，极大的缩短了多种检测周期，节约了质谱仪机时，降低了检测成本。[0104]以上内容是结合具体的实施方式对本技术所作的进一步详细说明，不能认定本技术的具体实施只局限于这些说明。对于本技术所属
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：的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。当前第1页12当前第1页12
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：，特别是涉及一种分析生物样本中多种蛋白修饰的方法。
背景技术：
：：2.很长时间里，蛋白质修饰或称蛋白修饰的研究并未引起足够的重视，直到2004年泛素化介导蛋白质降解的发现获得诺贝尔奖之后，这一情形才得以改观。迄今，人们已经发现200多种的蛋白质修饰，常见的蛋白质修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂质化和蛋白水解。蛋白质修饰通过在一个或多个氨基酸残基上加上修饰基团，可以改变蛋白质的物理、化学性质，进而影响蛋白质的空间构象、活性、亚细胞定位、蛋白质折叠以及蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质修饰在多种细胞过程，如细胞分裂、蛋白分解、信号传到、调控过程、基因表达调控和蛋白相互作用中起到关键作用。3.在修饰蛋白质组研究领域中，富集得到修饰肽段后利用质谱仪进行分析是普遍的检测技术，常用的质谱扫描方式有数据依赖采集(data-dependentacquisition，dda)和数据非依赖采集(data-independentacquisition，dia)两种模式。dia结合了dda和选择反应监测(selectedreactionmonitoring，srm)的特点，将整个扫描范围等分为若干窗口，每个窗口依次选择，碎裂，采集窗口内所有母离子的全部子离子的信息。4.现有技术对每一种蛋白质修饰都是单独进行检测，以磷酸化蛋白修饰和糖基化蛋白修饰检测为例，如图1所示，如果需要对这两种蛋白修饰进行检测，则需要分别对蛋白质提取和酶解获得的多肽产物进行磷酸化富集和糖基化富集，分别获得磷酸化肽段和糖基化肽段；利用磷酸化肽段获得磷酸化dda谱图库，利用糖基化肽段获得糖基化dda谱图库；然后再分别对磷酸化肽段进行dia模式的质谱数据采集，基于磷酸化dda谱图库分析采集的磷酸化dia数据，获得待测样本的磷酸化蛋白修饰检测结果；对糖基化肽段进行dia模式的质谱数据采集，基于糖基化dda谱图库分析采集的糖基化dia数据，获得待测样本的糖基化蛋白修饰检测结果。5.由此可见，每检测一种蛋白修饰就需要对待测样本进行一次dia数据采集；如果需要对前述常见的八种蛋白质修饰进行检测，则需要进行八次dia数据采集。然而，单次dia数据采集需要消耗2小时质谱仪的机时，一小时机时成本大约400元；仅仅是对一个样本的八种常见蛋白质修饰进行检测就已经价格不菲，如果需要检测更多的其它蛋白修饰，不仅费用会更加昂贵，而且检测周期长、时间成本高。6.因此，如何更高效的分析或检测多种蛋白修饰，是本领域亟待解决的问题。技术实现要素：7.本技术的目的是提供一种改进的分析生物样本中多种蛋白修饰的方法。8.为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：9.本技术公开了一种分析生物样本中多种蛋白修饰的方法，包括按照需要检测的蛋白修饰类型分别对蛋白质酶解消化的肽段进行相应的肽段富集；该蛋白质酶解消化的肽段为提取自待测样本的蛋白质经过酶解消化获得的肽段；将富集的各肽段混合，获得需要检测的蛋白修饰类型的混合肽段；对混合肽段进行一次性的dia采集和/或dda采集；基于需要检测的蛋白修饰类型的肽段相应的dda谱图库，对采集的dia信息和/或dda信息进行分析，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果。10.其中，按照需要检测的蛋白修饰类型分别对蛋白质酶解消化的肽段进行相应的肽段富集，例如，需要检测的蛋白修饰类型为磷酸化蛋白修饰，则按照磷酸化肽段富集的方法进行肽段富集，需要检测的蛋白修饰类型为糖基化蛋白修饰，则按照糖基化肽段富集的方法进行肽段富集。11.需要说明的是，本技术的方法，其关键在于将所有富集的肽段混合在一起，仅仅采用质谱仪一针采集的数据，就可以分析获得待测样本中多种蛋白修饰的分析结果。至于不同修饰蛋白的肽段富集、dda谱图库构建等，都可以参考现有技术，在此不作具体限定。12.本技术的一种实现方式中，本技术的生物样本多种蛋白修饰分析方法还包括，根据富集的肽段分别获得所有需要检测的蛋白修饰类型的肽段相应的dda谱图库。13.需要说明的是，原则上如果已经获得生物样本的dda谱图库，则可以直接使用，无需重复根据富集的肽段进行dda谱图库构建；但是，对于一个新检测样本，或者新增加的需检测蛋白修饰类型而言，则需要先构建富集多肽对应的dda谱图库。14.本技术的一种实现方式中，需要检测的蛋白修饰类型为两种或两种以上的蛋白修饰。15.需要说明的是，本技术的方法，其关键在于可以实现多种蛋白修饰类型的同时检测，即仅仅采用质谱仪一针采集数据，就可以获得多种蛋白修饰分析结果；因此，本技术方法尤其适用于两种或更多种蛋白修饰的检测，例如常见的磷酸化蛋白修饰和糖基化蛋白修饰两种蛋白修饰的同时检测；或者，磷酸化蛋白修饰、糖基化蛋白修饰和乙酰化蛋白修饰三种蛋白修饰的同时检测；又或者，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂质化和蛋白水解八种蛋白修饰的同时检测。原则上，本技术方法可同时检测的蛋白修饰数量不限。16.本技术的一种实现方式中，dda谱图库的建库质谱采集参数包括，采用tims离子淌度模式，扫描范围100-1700m/z，离子淌度范围0.60-1.60v.s/cm2。17.本技术的一种实现方式中，dda谱图库的建库质谱采集参数还包括，离子传输管电压1600v，干燥气流速3.0l/min，干燥温度180℃，挑选10个母离子，碎裂能量10ev。18.本技术的一种实现方式中，dda谱图库由蛋白鉴定软件对采集的dda质谱数据进行分析鉴定获得。19.优选的，蛋白鉴定软件为maxquant、proteomediscoverer或mascot。20.本技术的一种实现方式中，dia采集的参数包括，采用tims离子淌度dia-pasep模式，扫描范围302-1077m/z，1/k0设置0.602-1.336v.s/cm2。21.本技术的一种实现方式中，dia采集的参数还包括，离子传输管电压1600v，干燥气流速3.0l/min，干燥温度180℃，碎裂能量10ev，窗口宽度25m/z，窗口分段数4，每段窗口数8，pasef循环时间100ms。22.本技术的一种实现方式中，基于dda谱图库对采集的dia信息进行分析，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果，具体包括，使用dia蛋白组分析软件，以所有需要检测的蛋白修饰类型的肽段相应的dda谱图库为数据库，进行dia数据分析，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果。23.优选的，dia蛋白组分析软件为skyline、spectronaut或diann。24.本技术的一种实现方式中，基于dda谱图库对采集的dda信息进行分析，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果，具体包括，采用比对分析方法，利用所有需要检测的蛋白修饰类型的肽段相应的dda谱图库解析采集的dda信息，获得待测样本的蛋白修饰的分析结果。25.优选的，比对分析方法为matchbetweenruns分析方法。26.由于采用以上技术方案，本技术的有益效果在于：27.本技术的生物样本多种蛋白修饰分析方法，将富集的需要检测的蛋白修饰类型的肽段混合，结合各肽段的dda谱图库，只需要对混合肽段采集一次数据，就可以分析获得待测样本中多种蛋白修饰的分析结果；缩短了多种蛋白修饰的检测周期，节约了质谱仪的机时，降低了多种蛋白修饰的检测成本。附图说明28.图1是现有技术分析生物样本中多种蛋白修饰的方法；29.图2是本技术实施例中分析生物样本中多种蛋白修饰的方法；30.图3是本技术实施例中改进的分析生物样本中多种蛋白修饰的方法；31.图4是本技术实施例中改进的另一种分析生物样本中多种蛋白修饰的方法；32.图5是本技术实施例中提取的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。具体实施方式33.下面通过具体实施方式结合附图对本技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他装置、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。34.现有技术中，如果需要对多种蛋白修饰进行检测，如图1所示，通常是先对样本11进行蛋白质提取12；然后对提取的蛋白质进行蛋白质酶解13，获得酶解的肽段；按照需要检测的蛋白修饰类型分别对蛋白质酶解消化的肽段进行相应的肽段富集；例如，对磷酸化蛋白修饰检测，则进行磷酸化富集141获得磷酸化肽段142；根据富集的磷酸化肽段分别进行磷酸化dda谱图库建立1431和磷酸化肽段dia采集1432；最后，基于dda谱图库分析dia数据144，获得磷酸化蛋白修饰检测结果；又例如，对糖基化蛋白修饰检测，则进行糖基化富集151获得糖基化肽段152；根据富集的糖基化肽段分别进行糖基化dda谱图库建立1531和糖基化肽段dia采集1532；最后，基于dda谱图库分析dia数据154，获得糖基化蛋白修饰检测结果。由此可见，现有技术对多种蛋白修饰进行检测，需要每一种蛋白修饰进行一次dia采集，这极大的增加了检测成本和时间。35.本技术创造性的提出，将富集的肽段混合，直接对混合的肽段进行一针采集数据，就可以获得多种蛋白修饰分析结果。如图2所示，同样的，对样本21进行蛋白质提取22；然后对提取的蛋白质进行蛋白质酶解23，获得酶解的肽段；按照需要检测的蛋白修饰类型分别对蛋白质酶解消化的肽段进行相应的肽段富集；例如，对磷酸化蛋白修饰检测，则进行磷酸化富集241获得磷酸化肽段242；对糖基化蛋白修饰检测，则进行糖基化富集251获得糖基化肽段252；这些步骤与现有技术是相同的；所不同的是，本技术的方法，根据富集的磷酸化肽段进行磷酸化dda谱图库建立243，根据富集的糖基化肽段进行糖基化dda谱图库建立253；然后，将所有肽段混合，获得混合肽段26，对混合肽段26进行一次性的肽段样本dia采集27；最后，基于多种图谱库的dia信息分析28，同时获得多种蛋白修饰的检测结果，如图2所示，即同时获得磷酸化蛋白修饰和糖基化蛋白修饰的检测结果。36.本技术的方法，当同时做两个以上修饰蛋白质组时，每种蛋白修饰建立谱图库后，样本dia上机时，每个样本只需要采集一次dia模式数据就能获得两种以上蛋白质修饰的结果；而传统方法一种修饰蛋白检测就需采集一次，两种就采集2次，采集的次数与检测的蛋白修饰类型数目相同。因此，本技术的方法样本数越多、一次分析的蛋白修饰的种类越多，节约的周期和机时成本就越多。如图3所示，其在图2所示方案的基础上，进一步增加了乙酰化蛋白修饰的检测，其中，对样本31进行蛋白质提取32，然后对提取的蛋白质进行蛋白质酶解33，获得酶解的肽段，这些都与图2所示的技术方案相同；只是富集肽段方面增加了相应的乙酰化肽段富集，具体的，针对磷酸化蛋白修饰检测，进行磷酸化富集341获得磷酸化肽段342；对糖基化蛋白修饰检测，进行糖基化富集351获得糖基化肽段352；对乙酰化蛋白修饰检测，进行乙酰化富集361获得乙酰化肽段362；根据富集的磷酸化肽段进行磷酸化dda谱图库建立343，根据富集的糖基化肽段进行糖基化dda谱图库建立353，根据富集的乙酰化肽段进行乙酰化dda谱图库建立363；然后，将所有肽段混合，获得混合肽段37，对混合肽段37进行一次性的肽段样本dia采集38；最后，基于多种图谱库的dia信息分析39，如图3所示，同时获得磷酸化蛋白修饰、糖基化蛋白修饰和乙酰化蛋白修饰的检测结果。37.本技术的方法中，混合肽段是使用dia采集模式进行采集，后续分析中，用多种dda谱图库来辅助样本dia数据解析。在一种改进方案中，也可以对混合肽段进行dda采集，即将混合肽段样本用dda模式采集，再将采集的dda数据，与多种dda谱图库一起分析，采用比对分析方法，如matchbetweenruns的分析方法，利用谱图库数据解析单个样本的dda数据，实现待测样本两个或多个蛋白修饰的同时鉴定及定量。如图4所示，以一针采集磷酸化和糖基化为例，同样的，对样本41进行蛋白质提取42；然后对提取的蛋白质进行蛋白质酶解43，获得酶解的肽段；针对磷酸化蛋白修饰检测，则进行磷酸化富集441获得磷酸化肽段442；对糖基化蛋白修饰检测，则进行糖基化富集451获得糖基化肽段452；根据富集的磷酸化肽段进行磷酸化dda谱图库建立443，根据富集的糖基化肽段进行糖基化dda谱图库建立453；然后，将所有肽段混合，获得混合肽段46，对混合肽段46进行一次性的肽段样本dda采集47，即用dda模式采集；最后，再将磷酸化谱图库数据、糖基化谱图库数据和样本的dda数据一起分析，采用基于matchbetweenrun的dda信息分析48，利用谱图库数据解析单个样本的dda数据，实现磷酸化蛋白组和糖基化蛋白组的同时鉴定及定量，如图4所示。38.实施例39.1.蛋白提取及质控40.(1)蛋白提取41.取6例组织样本，分别命名为a、b、c、d、e、f，每个样本称量50mg转移到2mlep管中，加入600μl蛋白质裂解液(7m尿素、2m硫脲、0.2﹪sds，20mmtris)，6μl蛋白酶抑制剂cocktail(roche，20tablets)以及6μl磷酸酶抑制剂(roche，10tablets)；使用自动化研磨仪将样本研磨成匀浆状态，25000g4℃离心20分钟取500μl上清，上清即为蛋白质溶液；向蛋白质溶液中加入终浓度为10mm的二硫苏糖醇(dtt)在水浴锅中37℃反应30分钟后，再加入终浓度为55mm的碘代乙酰胺(iam)暗室温反应45分钟。42.(2)蛋白定量43.使用bradford方法对蛋白质溶液进行定量，其原理为当bradford染色液(考马斯亮蓝g-250)和蛋白在酸性条件下结合时，最大吸光值波长由465nm转移至595nm，在一定范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正线相关关系；因此可根据标准品吸光值与标准品蛋白质浓度做出标准曲线，定量待测蛋白质浓度，该6例样本在595nm波长下进行测定吸光度值。44.根据表1对浓度为0.2μg/μl的bsa进行取样，测量梯度增加bsa体积样本的吸光值，对吸光值和样本浓度进行拟合，获得吸光值与蛋白质浓度的标准曲线：45.y＝2.001x 0.016546.其中，相关系数为r2＝0.9902，r2大于0.99，说明本例的标准曲线符合要求。47.表1标准曲线样本配制表48.管号12345678910双蒸水/μl2468101214161820bsa/μl181614121086420工作液/μl18018018018018018018018018018049.计算获得样本a、b、c、d、e、f的蛋白质溶液的浓度分别为10.25μg/μl，12.58μg/μl，9.89μg/μl，10.79μg/μl，13.01μg/μl，12.11μg/μl。50.(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳51.每个样本等量取10μg蛋白质，加入1/3蛋白质溶液体积的loadingbuffer，混匀后95℃加热5min，5000g离心1min，取上清点入12％sds聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中，80v恒压电泳30min后再120v恒压电泳120min；电泳结束后，将胶放入快速染脱仪器中10min后，取出胶图扫描。52.聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图5所示，图中，kda为蛋白分子量，m为9个条带的质控品，泳道1为样本a、泳道2为样本b、泳道3为样本c、泳道4为样本d、泳道5为样本e，泳道6为样本f；电泳结果图显示，本例的六个蛋白质样本，其蛋白质条带分布均匀，背景干净，达到合格标准。53.2.酶解54.对已提取好的蛋白质溶液进行酶解，按照蛋白质：胰蛋白酶(hualishiscientific，100ug/瓶)＝40:1(μg:μg)进行加酶，并在37℃水浴锅中反应过夜，次日用stratax柱(phenomenex，tubes-10mg/1ml)进行除盐，真空抽干，得到酶解后的肽段；利用质谱仪对酶解后的肽段进行质控。55.结果显示，六个蛋白质酶解产物的峰型、强度都质控合格，可以用于后续处理。56.3.富集57.由于每一种修饰蛋白的富集方法都不一样，因此该步开始分开技术路线去富集获得不同的修饰蛋白。本例对待测样本进行磷酸化蛋白修饰和糖基化蛋白修饰检测。因此，分别对提取的蛋白质溶液的酶解肽段进行磷酸化肽段富集和糖基化肽段富集。详细如下：58.(1)磷酸化肽段富集59.本例先按照表2配制磷酸化富集试剂，按照表3配制highphrp柱elutionbuffer。60.表2磷酸化富集试剂表[0061]loadingbufferwashbufferelutionbuffer1elutionbuffer2ddh2o15％19％83.3％51.67％100％acn80％80％040％tfa5％1％00gln(谷氨酰胺)30mg/ml00025％氨水0016.7％8.33％[0062]表3highphrp柱elutionbuffer配方[0063]fractionacn(％)acn(μl)0.1％triethylamine(μl)1550950277093038809204990910510100900611110890713130870815150850917170830102020080011252507501250500500[0064]取1.2mg肽段用loadingbuffer稀释成1.0μg/μl备用；以样品:tio2＝1:4称取tio2，向tio2中加入1mlloadingbuffer，室温震荡10min，12000g离心30s，弃上清，保留tio2沉淀；向上述tio2中加入稀释好的肽段样本，于恒温震荡仪中37℃1100rpm震荡1h，磷酸化肽段与tio2结合，即富集反应；将上述震荡完的样品于12000g离心30s，收集上清至另一离心管，同时保留沉淀；向沉淀中加入1mlloadingbuffer，室温圆盘翻转5min，12000g离心30s，弃上清；加入1ml的washbuffer，室温圆盘翻转5min，12000g离心30s，弃上清，重复该步骤4次；加入600μlelutionbuffer1，室温1200rpm震荡20min，12000g离心30s，收集上清；加入500μlelutionbuffer2，室温1200rpm震荡20min，12000g离心30s，收集上清；将两次收集到的上清合并冷冻抽干，即获得富集的磷酸化肽段。[0065](2)糖基化肽段富集[0066]用300μl60％acn/0.1％fa的溶液溶解肽段，充分震荡溶解后，备用；使用hilic柱(merck，5μm，150*4.6mm)，buffera为80％acn/0.1％fa，bufferb为0.1％fa，平衡柱子后进行富集和分组份。馏分从第30min开始收到第54min，每分钟收集一管，共收集24管并标记好；放入冷冻抽干机中抽干，然后每相邻4管用总共50μl的50mmhh4hco3相继复溶合成一管，最终分成6个组份；每个组份加入2.5μlpngasef(biolabs，p0710s)进行脱糖，震荡混匀后离心，37℃水浴过夜；次日放入冷冻抽干机中抽干，即获得富集的糖基化肽段。[0067]4.磷酸化肽段组份分离[0068]富集的各样本磷酸化肽段混合后用300μl0.1％tfa复溶；用highphrp柱(thermoscientificpiercetm)进行组份分离：[0069](1)highphrp柱的活化及平衡：[0070]a.取出柱子，5000g离心2min去除柱中保留液；[0071]b.向柱子中，加300μlacn5000g离心2min洗涤2遍；[0072]c.向柱子中，加300μl0.1％tfa5000g离心2min洗涤2遍；[0073](2)载样：向柱子中，加入复溶样品(300μl)，3000g离心2min，保留ft液(ft)于另一离心管；[0074](3)洗涤：加入300μl水，3000g离心2min，保留wash液(wt)于另一离心管；[0075](4)洗脱：使用表3配制的elutionbuffer依次洗脱，分别标为f1、f2…f12，洗脱时加入300μleutionbuffer，3000g离心2min，收集各洗脱液；[0076](5)洗脱液按[0077]“f1 f7”、“f2 f8”、“f3 f9”、“f4 f10”、“f5 f11”、“f6 f12 ft wt”合并为6个组份，各组份抽干后于-20℃保存备用。[0078]5.质谱上机[0079]使用串联质谱仪timstofpro将分组份后的样本每个采用dda模式采集1小时质谱数据，将每个样本对应的磷酸化富集肽段和糖基化富集肽段混合后采用dia模式采集1小时质谱数据。[0080](1)液相分离条件[0081]使用自装c18色谱柱(75μm内径，1.8μm柱料粒径，约25cm柱长)，buffera：h2o 0.1％fa，bufferb：acn 0.1％fa[0082]液相梯度如表4所示。[0083]表4液相梯度[0084]时间(min)流速(μl/min)b％00.32450.322500.335550.380600.380[0085](2)dda建库质谱采集参数[0086]采用tims离子淌度模式，扫描范围100-1700m/z，离子淌度范围0.60-1.60v.s/cm2。[0087]离子传输管电压1600v，干燥气流速3.0l/min，干燥温度180℃，挑选10个母离子，碎裂能量10ev。[0088](3)dia检测质谱采集参数[0089]采用tims离子淌度dia-pasep模式，扫描范围302-1077m/z，1/k0设置0.602-1.336v.s/cm2。[0090]离子传输管电压1600v，干燥气流速3.0l/min，干燥温度180℃，碎裂能量10ev，窗口宽度25m/z，窗口分段数4，每段窗口数8，pasef循环时间100ms。[0091]6.dda数据的建立[0092]使用蛋白鉴定软件，如maxquant、proteomediscoverer、mascot等软件，分别对磷酸化肽段dda质谱数据和糖基化肽段dda质谱数据进行分析鉴定，分别得到磷酸化蛋白组谱图库和糖基化蛋白组谱图库。本例具体采用maxquant软件进行分析鉴定，获得dda谱图库。谱图库鉴定数目如表5。[0093]表5磷酸化蛋白组及糖基化蛋白组dda谱图库鉴定数目[0094]修饰类型所有肽段数目修饰肽段数目修饰蛋白数目磷酸化蛋白谱图库47826196485608糖基化蛋白谱图库94912118454205[0095]7.数据分析[0096]使用dia蛋白组份析软件，如skyline、spectronaut、diann等软件，以上述建立的磷酸化蛋白组谱图库和糖基化蛋白组谱图库混合得到的混合修饰蛋白组谱图库为数据库进行dia数据的分析，同时得到磷酸化蛋白组和糖基化蛋白组鉴定和定量分析结果。[0097]本例具体采用spectronaut软件进行dia数据的分析，结果见表6。[0098]表6磷酸化肽段与糖基化肽段混合进行dia采集分析结果[0099]样本磷酸化肽段数目磷酸化蛋白数目糖基化肽段数目糖基化蛋白数目a15221402576462747b14325396874942676c13537386975382682d15860414980272866e15863417579652835f16096417480832856[0100]此外，本例按照传统方法分别进行磷酸化蛋白组及糖基化蛋白组dia数据采集，结果见表7。[0101]表7传统方法磷酸化蛋白组及糖基化蛋白组分析结果[0102]样本磷酸化肽段数目磷酸化蛋白数目糖基化肽段数目糖基化蛋白数目a16440434783662967b16071428980892886c15621417981412895d17129448186633095e17132449886023065f17384450887293081[0103]表6和表7的结果显示，本例方法检测的磷酸化肽段数及糖基化肽段数目都较高，仅略低于传统方法结果数目，在实验分析误差范围内。因此，本例方法完全能够满足市场及科学研究需求；并且，极大的缩短了多种检测周期，节约了质谱仪机时，降低了检测成本。[0104]以上内容是结合具体的实施方式对本技术所作的进一步详细说明，不能认定本技术的具体实施只局限于这些说明。对于本技术所属
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
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