一种恩他卡朋中残留杂质的检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种恩他卡朋中残留杂质的检测方法。


背景技术：

2.恩他卡朋为儿茶酚-o-甲基转移酶(comt)抑制剂，是一种可逆的、特异性的，主要作用于外周的comt抑制剂。其通过抑制comt酶减少左旋多巴代谢为3-氧位-甲基多巴(3-omd)，可使左旋多巴的生物利用度增加，并增加脑内可利用的左旋多巴总量。恩他卡朋可作为左旋多巴/苄丝肼或左旋多巴/卡比多巴的辅助用药，用于治疗以上药物不能控制的帕金森病及剂末现象(症状波动)。现有工艺生成恩他卡朋原料药中可能会产生残留一种痕量的工艺杂质：n,n-二乙氰基乙酰胺，其化学结构如下所示：
[0003][0004]
按照ich q3a指导原则，恩他卡朋原料药中n,n-二乙氰基乙酰胺的限度为不得超过0.10％，因此需要严格进行控制。目前，常规气相色谱或液相色谱检测方法的灵敏度不能满足恩他卡朋原料药中n,n-二乙氰基乙酰胺的检测要求，且尚未发现能够满足该要求的检测方法报道。因此，需要提供一种能够准确可靠检测恩他卡朋中杂质n,n-二乙氰基乙酰胺的检测方法，以满足检测需要。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术中不能对恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺进行有效检测的问题，本发明提供一种恩他卡朋中残留杂质的检测方法。
[0006]
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
[0007]
一种恩他卡朋中残留杂质的检测方法，残留杂质为n,n-二乙氰基乙酰胺，采用高效液相色谱与质谱联用法进行检测，包括如下步骤：
[0008]
(1)供试品溶液和对照品溶液的配制：
[0009]
取恩他卡朋原料，用水配制成供试品溶液；
[0010]
取n,n-二乙氰基乙酰胺对照品，用水配制成对照品溶液；
[0011]
(2)对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测，其中，所述高效液相色谱的条件：
[0012]
色谱柱：c18色谱柱；
[0013]
流动相a：体积浓度为0.08％-0.12％甲酸的水溶液，流动相b：甲醇；
[0014]
梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
[0015]
0min，50％流动相a，50％流动相b；
[0016]
4min，50％流动相a，50％流动相b；
[0017]
5min，8％-2％流动相a，92％-98％流动相b；
[0018]
9min，8％-2％流动相a，92％-98％流动相b；
[0019]
9.1min，50％流动相a，50％流动相b；
[0020]
15min，50％流动相a，50％流动相b；
[0021]
质谱条件为：apci离子源，正离子扫描模式，定量离子为：母离子141.1m/z，子离子为100.2m/z，碰撞电压为16v，去簇电压为60v；定性离子为：母离子141.1m/z，子离子为72.1m/z，碰撞电压为25v，去簇电压为60v。
[0022]
本发明提供的恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺的检测方法灵敏度高，准确可靠，线性关系良好(r2＝0.9988)，同时具有良好的精密度和耐用性。该方法样品的回收率在95.30％～99.26％之间，样品重复性的相对标准偏差小于2％，n,n-二乙氰基乙酰胺的检测限为2.56ng/ml，相当于样品的0.0025％，定量限为5.11ng/ml，相当于样品的0.0050％，符合ich q3a的指导原则的检测要求，可作为其质量监控的依据。且本发明提供的检方法中溶剂不干扰杂质n,n-二乙氰基乙酰胺检测，样品中无干扰杂质测定的峰，方法专属性良好，且方法简便、快速、准确、重复性好。
[0023]
优选的，流速为0.55ml/min-0.65ml/min；柱温为27℃-33℃。
[0024]
进一步优选的，流速为0.6ml/min，柱温为30℃。
[0025]
优选的，所述色谱柱的规格为4.6mm*100mm，填料直径为3μm。
[0026]
进一步优选的，所述色谱柱为ymc-triart c18。
[0027]
优选的，流动相a为体积浓度为0.1％甲酸的水溶液。
[0028]
优选的流动相不会产生基线干扰，可使目标化合物与供试品主物质的保留时间相距更远，提高了检测结果的准确度及精密度，且流动相甲醇和常用的流动相乙腈相比，甲醇灵敏度要比乙腈要高。
[0029]
优选的，进样体积为10μl。
[0030]
优选的，供试品溶液的浓度为0.1mg/ml。
[0031]
优选的，对照品溶液的浓度为100ng/ml。
[0032]
优选的上述液相色谱的检测条件有利于恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺的有效检出，提高检测的灵敏度，从而达到有效准确检测恩他卡朋中痕量n,n-二乙氰基乙酰胺的目的。
[0033]
优选的，所述质谱的扫描模式为多反应监测，气帘气体压力为40psi，碰撞气体为medium，射入电压为10v，碰撞室射出电压为10v，针电流为3ma，喷雾气压力为35psi，离子化温度为350℃。
[0034]
优选的质谱分析条件在具有较高的响应强度的前提下，具有高选择性和较低的基线，使得目标化合物具有较高的信噪比，较高的灵敏度，从而能够最大限度地提高恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺测定的准确性。
[0035]
本发明采用高效液相色谱和质谱联用的检测方法，能够实现对恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺的准确检测，检测限为样品的0.0025％，适用于恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺的的痕量检测，解决了目前无法对恩他卡朋原料中n,n-二乙氰基乙酰胺进行有效控制的问题。且该检测方法操作简便、精密度高，具有推广和实用价值。
附图说明
[0036]
图1为实施例1中空白溶液的色谱图；
[0037]
图2为实施例1中对照溶液的色谱图；
[0038]
图3为实施例1中供试品溶液的色谱图；
[0039]
图4为实施例1中供试品加对照品溶液的色谱图；
[0040]
图5为实施例2中n,n-二乙氰基乙酰胺的标准曲线图；
[0041]
图6为对比例1中供试品溶液的色谱图；
[0042]
图7为对比例2中对照品溶液的色谱图。
具体实施方式
[0043]
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，应当理解，此处所描述的具体实施例可以使本领域的技术人员更全面的理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。
[0044]
本发明检测方法的高效液相色谱与质谱条件：
[0045]
高效液相色谱条件为：
[0046]
色谱柱：ymc-triart c18，4.6mm*100mm，3μm；
[0047]
流动相a：0.1％甲酸的水溶液；
[0048]
流动相b：甲醇；
[0049]
流速：0.6ml/min；
[0050]
进样体积：10μl；
[0051]
柱温：30℃；
[0052]
梯度洗脱，洗脱程序如下：
[0053]
mina相％b相％050504.0050505.005959.005959.10505015.005050
[0054]
质谱条件为：apci离子源，使用正离子扫描模式，扫描模式为多反应监测，气帘气体压力为40psi，碰撞气体为medium，射入电压为10v，碰撞室射出电压为10v，针电流为3ma，喷雾气压力为35psi，离子化温度为350℃，检测离子对以及碰撞电压和去簇电压见下表。
[0055]
[0056]
实施例1
[0057]
专属性试验：
[0058]
空白溶液：纯水。
[0059]
对照品贮备液：取n,n-二乙氰基乙酰胺适量，精密称定，用水配制成每1ml中约含2.00μg的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品贮备液。
[0060]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，精密称定，用水稀释至每1ml中约含100ng的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品溶液。
[0061]
供试品溶液：取恩他卡朋原料约25.00mg，精密称定，置于250ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。
[0062]
供试品加对照品溶液：取恩他卡朋原料约25.00mg，精密称定，置于250ml容量瓶中，加入对照品贮备液12.5ml，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品加对照品溶液。
[0063]
取上述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和供试品加对照品溶液各10μl，分别按照上述条件进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，如图1-图4所示。
[0064]
由图1-图4可知，本发明n,n-二乙氰基乙酰胺的测定方法，检测灵敏度高，空白溶液及供试品溶液中均无干扰n,n-二乙氰基乙酰胺测定的峰，该方法专属性良好。
[0065]
实施例2
[0066]
线性关系：
[0067]
线性储备液：取n,n-二乙氰基乙酰胺对照品适量，精密称定，用水制成每1ml中约含2.00μg的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为线性储备液。
[0068]
线性溶液：精密量取线性储备液适量，分别用水稀释至每1ml中约含n,n-二乙氰基乙酰胺5.11ng、20.44ng、61.31ng、102.19ng、143.07ng、204.38ng的溶液，摇匀，作为线性溶液。
[0069]
取各线性溶液，进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图。以n,n-二乙氰基乙酰胺进样浓度(ng/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图5；并计算回归方程，结果见表1。
[0070]
表1 n,n-二乙氰基乙酰胺线性试验结果
[0071][0072][0073]
由表1可知，n,n-二乙氰基乙酰胺在5.11ng/ml～204.38ng/ml的浓度范围内相关系数r2＝0.9988，峰面积与浓度间呈良好的线性关系。
[0074]
实施例3
[0075]
检测限和定量限试验：
[0076]
对照品贮备液：取n,n-二乙氰基乙酰胺适量，精密称定，用水配制成每1ml中约含2.00μg的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品贮备液。
[0077]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，精密称定，用水稀释至每1ml中约含100ng的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品溶液。
[0078]
取对照品溶液，用水逐级定量稀释，进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，按信噪比不低于10:1，得到定量限，结果见表2。
[0079]
平行制备定量限溶液6份，进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，观察定量限精密度，结果见表3。
[0080]
表2检测限、定量限检测结果
[0081][0082]
表3定量限重复性检测结果
[0083][0084]
由表2可知，n,n-二乙氰基乙酰胺的检测限浓度为2.56ng/ml，相当恩他卡朋原料的0.0025％可被检出；定量限浓度为5.11ng/ml，相当于恩他卡朋原料的0.0050％可被定量检出，检测限和定量限均能满足恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺的检测要求。且由表3可知，对6份定量限溶液进行检测，重复性良好，证明该方法的灵敏度高。
[0085]
实施例4
[0086]
准确度试验：
[0087]
n,n-二乙氰基乙酰胺的准确度试验以回收率(％)表示。
[0088]
对照品贮备液：取n,n-二乙氰基乙酰胺适量，精密称定，用水配制成每1ml中约含2.00μg的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品贮备液。
[0089]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，精密称定，用水稀释至每1ml中约含100ng的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品溶液。
[0090]
60％n,n-二乙氰基乙酰胺限度回收率溶液：取恩他卡朋原料约25.00mg，置于250ml容量瓶中，加入对照品贮备液7.5ml，用水稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
[0091]
100％n,n-二乙氰基乙酰胺限度回收率溶液：取恩他卡朋原料约25.00mg，置于250ml容量瓶中，加入对照品贮备液12.5ml，用水稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
[0092]
140％n,n-二乙氰基乙酰胺限度回收率溶液：取恩他卡朋原料约25.00mg，置于250ml容量瓶中，加入对照品贮备液17.5ml，用水稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
[0093]
取对照品溶液和各回收率溶液，分别进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，回收率结果见表4。
[0094]
回收率(％)＝(测得量-原有量)/加入量
×
100％
[0095]
表4 n,n-二乙氰基乙酰胺回收率检测结果
[0096][0097][0098]
由表4可知，n,n-二乙氰基乙酰胺在60％-140％限度浓度范围内，回收率在95.30％-99.26％之间，rds小于10％，该检测方法的回收率良好；在60％-140％限度浓度范围内平均回收率为97.55％，该方法的准确度良好。
[0099]
实施例5
[0100]
重复性试验：
[0101]
供试品溶液：取恩他卡朋原料约25.00mg，精密称定，置于250ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，平行制备6份。
[0102]
取上述制备的供试品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图。检测结果见表5。
[0103]
表5 n,n-二乙氰基乙酰胺重复性试验结果
[0104][0105]
由表5可知，重复测定同批配制的6份供试品溶液，n,n-二乙氰基乙酰胺均未检出，说明本方法重复性良好。
[0106]
实施例6
[0107]
精密度试验：
[0108]
对照品贮备液：取n,n-二乙氰基乙酰胺适量，精密称定，用水配制成每1ml中约含2.00μg的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品贮备液。
[0109]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，精密称定，用水稀释至每1ml中约含100ng的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品溶液。
[0110]
取对照品溶液进行hplc-ms/ms检测，连续进样检测6次，记录色谱图。检测结果见
表6。
[0111]
表6精密度试验结果
[0112][0113]
由表6可知，连续检测对照品溶液6次，n,n-二乙氰基乙酰胺的峰面积rsd值为0.91％，小于10％，说明本方法精密度良好。
[0114]
实施例7
[0115]
中间精密度试验：
[0116]
供试品溶液：取恩他卡朋原料约25.00mg，精密称定，置于250ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，平行制备6份。
[0117]
分别取上述6份供试品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图。此次检测与重复性检测日期不同、操作者不同，检测结果见表7。
[0118]
表7中间精密度试验结果
[0119][0120]
由表7可知，不同日期、不同操作者对6份供试品溶液进行检测，均未检出n,n-二乙氰基乙酰胺，与实施例5中的重复性结果一致，说明本方法中间精密度性良好。
[0121]
实施例8
[0122]
耐用性试验：
[0123]
对照品贮备液：取n,n-二乙氰基乙酰胺适量，精密称定，用水配制成每1ml中约含2.00μg的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品贮备液。
[0124]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，精密称定，用水稀释至每1ml中约含100ng的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品溶液。
[0125]
微调色谱条件：(1)其他条件不变，设置流速为0.65ml/min；
[0126]
(2)其他条件不变，设置流速为0.55ml/min；
[0127]
(3)其他条件不变，设置柱温为33℃；
[0128]
(4)其他条件不变，设置柱温为27℃；
[0129]
(5)其他条件不变，设置梯度中5min-9min的b相最大值为98％；
[0130]
(6)其他条件不变，设置梯度中5min-9min的b相最大值为92％。
[0131]
在以上微调后的色谱条件下，分别取对照品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，考察n,n-二乙氰基乙酰胺的耐用性，检测结果见表8。
[0132]
表8 n,n-二乙氰基乙酰胺耐用性试验结果
[0133][0134][0135]
由表8可知，微调色谱条件对n,n-二乙氰基乙酰胺检测无影响，说明该方法耐用性良好，适于实际应用和推广。
[0136]
实施例9
[0137]
稳定性试验：
[0138]
对照品贮备液：取n,n-二乙氰基乙酰胺适量，精密称定，用水配制成每1ml中约含2.00μg的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品贮备液。
[0139]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，精密称定，用水稀释至每1ml中约含100ng的n,n-二乙氰基乙酰胺溶液，作为对照品溶液。
[0140]
供试品溶液：取恩他卡朋供原料25.00mg，精密称定，置于250ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。
[0141]
将对照溶液和供试品溶液在室温条件下静置，每隔0h、2h、4h、6h、8h后，分别进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，检测结果见表9和表10。
[0142]
表9对照品溶液稳定性试验结果
[0143][0144]
表10供试品溶液稳定性试验结果
[0145][0146]
由表9可知，对照品溶液在室温条件下，放置8小时，峰面积的rsd为4.01％(≤
10％)，说明对照品溶液的稳定性均良好；由表10可知，供试品溶液在室温条件下，放置0h、2h、4h、6h、8h，n,n-二乙氰基乙酰胺均未检出，说明供试品溶液的稳定性均良好。
[0147]
实施例10
[0148]
样品检测：
[0149]
按照本发明提供的恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺的检测方法，对四批恩他卡朋原料样品中的n,n-二乙氰基乙酰胺进行检测。检测结果见表11。
[0150]
表11样品检测结果
[0151]
批次1234含量(％)未检出未检出未检出未检出
[0152]
结果显示，4批恩他卡朋原料样品中n,n-二乙氰基乙酰胺均未检出，符合限度规定(n,n-二乙氰基乙酰胺≤0.10％)。
[0153]
由以上实施例可知，本发明方法灵敏度高，准确可靠，线性关系良好，同时具有良好的精密度和耐用性，适用于恩他卡朋中n,n-二乙氰基乙酰胺的检测，可作为其质量监控的依据。
[0154]
对比例1
[0155]
气相色谱检测n,n-二乙基氰乙酰：
[0156]
色谱条件为：色谱柱为以6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷(或极性相近)为固定液的毛细管柱；起始温度为60℃，再以每分钟20℃的速率升温至240℃，维持10分钟；进样口温度为150℃；检测器为氢火焰离子化(fid)检测器，检测器温度为300℃；载气为氮气；进样体积1μl。分流比3：1，柱流量3ml/min。
[0157]
取实施例1中供试品溶液在该色谱条件下进行检测，记录色谱图，见图6,取实施例1中对照品溶液，用水逐级定量稀释，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，按信噪比不低于10:1，得到检定量限，检测结果见表12。
[0158]
表12检测限、定量限检测结果
[0159][0160]
结果显示，由于供试品高温会出现降解现象，故进样口不能设置过高。但进样口温度低后，供试品会在进样口残留，出现重复性差等现象，且该方法灵敏度不足，不能满足n,n-二乙氰基乙酰胺的检测要求。
[0161]
对比例2
[0162]
液相色谱检测n,n-二乙基氰乙酰：
[0163]
色谱条件为：色谱柱：shimadzu shim-pack gist c18，色谱柱的规格为4.6mm
×
250mm，填料直径为5μm，以水溶液为流动相a，以甲醇溶液为流动相b，总流速1.0ml/min，紫外检测波长：210nm，柱温：30℃，进样体积10μl。梯度洗脱顺序为：
[0164]
mina相％b相％09010
15010015.19010259010
[0165]
取实施例1中对照品溶液在该色谱条件下进行检测，记录色谱图，见图7,取实施例1中对照品溶液，用水逐级定量稀释，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，按信噪比不低于10:1，得到检定量限，检测结果见表13。
[0166]
表13检测限、定量限检测结果
[0167][0168][0169]
结果显示，由于n,n-二乙基氰乙酰没有特征结构，故选择末端吸收。这也就造成了基线漂移的现象，并且仪器灵敏度严重不足。故液相色谱法也不能满足n,n-二乙基氰乙酰的检测要求。
[0170]
以上所述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。