同时测定松花粉提取物中七种酚类含量的HPLC检测方法

同时测定松花粉提取物中七种酚类含量的hplc检测方法
技术领域
1.本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时测定松花粉提取物中七种酚类含量的hplc(高效液相色谱)检测方法。


背景技术：

2.松花粉是马尾松、油松等几种同属植物的雄性生殖细胞。其含有200余种营养物质，因此松花粉具有多种药理作用，具有广阔的开发前景和潜在应用价值，越来越受到食品等健康相关行业的关注。松花粉的营养成分包括蛋白质、氨基酸、酶、维生素、矿物质、核酸、黄酮类化合物、碳水化合物、胆碱、植物甾醇等。研究表明，松花粉具有护肝、抗炎、抗肿瘤、抗凋亡等作用。
3.松花粉中的酚类物质的种类和含量均极为丰富。酚类物质是指芳香环上的氢被羟基取代的一类芳香族化合物。自然界中存在的酚类大部分是植物产生的。植物中的酚类物质有抗衰老、抗氧化调节血糖血脂和抗肿瘤等功效。
4.松花粉作为我国传统的药食同源物质，其化学成分虽以被大量研究，但是仍存在着不完善的地方，整个松花粉行业也缺少标准的检测分析方法。酚类物质作为松花粉中重要的活性成分，将其定量研究以提高酚类的利用率是极为有意义的。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种同时测定松花粉提取物中七种酚类含量的hplc检测方法
6.按照本发明的技术方案，所述同时测定松花粉提取物中七种酚类含量的hplc检测方法，包括以下步骤：
7.(1)制备不同浓度的原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、花旗松素和柚皮素的混合标准品，吸取混合标准品采用高效液相色谱仪进行分析，以混合标准品的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标分别绘制原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、花旗松素和柚皮素的标准曲线并确定线性回归方程；
8.(2)将待测的松花粉提取物复溶，得到样品液；吸取样品液采用高效液相色谱仪进行分析，分别测定样品液与混合标准品对应的峰面积；
9.(3)根据步骤(2)测定的峰面积，对照步骤(1)的标准曲线和回归方程，计算所述样品液中原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、花旗松素和柚皮素的含量。
10.进一步的，所述步骤(1)中，混合标准品的溶剂为乙醇或甲醇。
11.进一步的，所述步骤(1)和(2)中，采用高效液相色谱仪进行分析的检测波长为200-600nm。
12.进一步的，所述原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、对香豆酸、花旗松素和柚皮素的检测波长为280nm；所述咖啡酸的检测波长为320nm。
13.具体的，所述步骤(1)中，线性回归方程如下：
14.原儿茶酸：y＝13236x
–
25730，r2＝0.9997；
15.儿茶素：y＝5926.3x
–
41156，r2＝0.9991；
16.表儿茶素：y＝5465x 33363，r2＝0.9979；
17.咖啡酸：y＝46764x
–
460469，r2＝0.9992；
18.对香豆酸：y＝46661x
–
253380，r2＝0.9996；
19.花旗松素：y＝23282x
–
131676，r2＝0.9995；
20.柚皮素：y＝29583x
–
125374，r2＝0.9997。
21.进一步的，所述步骤(1)和(2)中，采用高效液相色谱仪进行分析的色谱条件包括：固定相为waters xbridge c18色谱柱，规格为4.6*250mm，粒径为5μm；流动相a为纯乙腈；流动相b为0.1v/v％的甲酸水溶液；流速为1ml/min；进样量：10μl；柱温：35℃；梯度洗脱，梯度洗脱的程序如下：
22.。
23.本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明所建立的同时测定松花粉提取物中七种酚类的hplc检测方法选择性好、灵敏度高、准确可靠，为松花粉提取物的品质分析和质量控制提供了新的分析方法及依据。
附图说明
24.图1是原儿茶酸标准曲线。
25.图2是儿茶素标准曲线。
26.图3是表儿茶素标准曲线。
27.图4是咖啡酸标准曲线。
28.图5是对香豆酸标准曲线。
29.图6是花旗松素标准曲线。
30.图7是柚皮素标准曲线。
31.图8是混标溶液m的色谱图。
32.图9是松花粉供试品液n的色谱图。
33.图10是溶剂的色谱图。
具体实施方式
34.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
35.实施例1用hplc法同时测定七种酚类标准品的出峰时间及波长
36.用hplc法同时测定七种酚类标准品的出峰时间，包括：
37.(1)精密称取原儿茶酸标准品5.1mg、儿茶素标准品5.1mg、表儿茶标准品素5mg、咖啡酸标准品4.9mg、对香豆酸标准品5.1mg、花旗松素标准品5.1mg、柚皮素标准品5.1mg，并用乙醇配制成0.5mg/ml的混合标准溶液；
38.(2)将混合标准溶液用hplc进行分析，色谱条件为：固定相为waters xbridge c18色谱柱，规格为4.6*250mm，粒径为5μm；流动相a为纯乙腈；流动相b为0.1％的甲酸水溶液；流速：1ml/min；检测波长：280nm和320nm；进样量：10μl；柱温：35℃。将混合标准溶液进行梯度洗脱，洗脱程序见表1。
39.表1梯度洗脱程序
[0040][0041]
各酚类物质的出峰时间及波长如表2所示：
[0042]
表2 7种物质的保留时间和波长
[0043][0044]
由表2可以看出，表儿茶素和咖啡酸保留时间相近，通过波长不同进行区分。
[0045]
实施例2用hplc法同时测定松花粉醇提物中七种酚类物质方法学验证
[0046]
(1)线性关系考察
[0047]
精密称取原儿茶酸标准品5.1mg、儿茶素标准品5.1mg、表儿茶标准品素5mg、咖啡酸标准品4.9mg、对香豆酸标准品5.1mg、花旗松素标准品5.1mg、柚皮素标准品5.1mg，并用乙醇配制成0.5mg/ml的混合标准母液，之后依次稀释不同浓度，用0.22μm的膜过滤，以峰面积为纵坐标、标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线回归方程如下：
[0048]
原儿茶酸：y＝13236x
–
25730，r2＝0.9997；
[0049]
儿茶素：y＝5926.3x
–
41156，r2＝0.9991；
[0050]
表儿茶素：y＝5465x 33363，r2＝0.9979；
[0051]
咖啡酸：y＝46764x
–
460469，r2＝0.9992；
[0052]
对香豆酸：y＝46661x
–
253380，r2＝0.9996；
[0053]
花旗松素：y＝23282x
–
131676，r2＝0.9995；
[0054]
柚皮素：y＝29583x
–
125374，r2＝0.9997。
[0055]
表明各酚类物质线性关系良好，其标准曲线分别见图1-图7.
[0056]
(2)专属性实验
[0057]
分别精密吸取混标溶液m、供试品液n和溶剂b(乙醇)，按照实施例1的的色谱条件进行测定，记录色谱图如图8-10所示(图8和9中的峰1-7分别对应原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、花旗松素和柚皮素)。从图中可见，空白溶剂无干扰，说明本方法专属性良好。
[0058]
(3)精密度实验
[0059]
取混标溶液m，重复进样6次，进样量为10μl，按照实施例1的色谱条件测定，记录峰面积，计算rsd(相对标准偏差)。
[0060]
实验结果表明，原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、花旗松素和柚皮素的峰面积rsd(％)均小于2.0％，表明仪器精密度良好。
[0061]
表3精密度实验结果
[0062][0063]
(4)稳定性实验
[0064]
取混标溶液m，分别在0，3，6，9，12，24h进样(依次编号为1-6)，按照实施例1的色谱条件测定，记录峰面积，计算rsd。
[0065]
实验结果表明，原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、花旗松素和柚皮素的峰面积rsd(％)均小于2.0％，表明溶液在24小时内稳定良好，能满足测定要求。
[0066]
表4稳定性实验结果
[0067][0068]
(5)重复性试验
[0069]
抽取一份松花粉供试品液n样品，0.22μm过滤，制备6份样品溶液，按照实施例1色谱条件测定，记录峰面积，计算rsd。
[0070]
表5重复性实验结果
[0071][0072]
(6)加样回收试验
[0073]
精密量取混标溶液稀释液和已知含量的松花粉醇提物制备6份相同样品，按照实施例1色谱条件测定，计算加样回收率和rsd，结果表明，该方法的加样回收率良好。
[0074]
表6加样回收实验结果
[0075][0076]
实施例3用hplc法同时测定松花粉醇提物中七种酚类物质
[0077]
用hplc法同时测定松花粉醇提物中七种酚类物质，包括：
[0078]
(1)取100g破壁松花粉溶于2l 70％乙醇，45℃下超声搅拌，温度为45℃、超声时间为3h抽滤。共重复三次后合并滤液，40℃旋转蒸发全部乙醇，冻干，得到松花粉醇提物。
[0079]
(2)将松花粉醇提物复溶于70％乙醇，浓度为30mg/ml，离心后用0.22μm的膜过滤待测。
[0080]
(3)将待测的松花粉醇提物溶液用hplc进行分析，色谱条件与实施例1相同，结果如表7所示。
[0081]
表7实施例3酚类测定结果
[0082][0083]
注：以各自标准品定量，单位μg/g，n.d.为未检出。
[0084]
实施例4用hplc法同时测定松花粉醇提物小分子中七种酚类物质
[0085]
用hplc法同时测定松花粉醇提物小分子中七种酚类物质，包括：
[0086]
(1)取100g破壁松花粉溶于2l 70％乙醇，45℃下超声搅拌，温度为45℃、超声时间为3h抽滤。共重复三次后合并滤液，5kda滤膜超滤，得透过液，40℃旋转蒸发全部乙醇，冻干，得到松花粉醇提物小分子。
[0087]
(2)将松花粉醇提物小分子复溶于70％乙醇，浓度为30mg/ml，离心后用0.22μm的膜过滤待测。
[0088]
(3)将待测的松花粉醇提物溶液用hplc进行分析，色谱条件与实施例1相同，结果如表8所示。
[0089]
表8实施例4酚类测定结果
[0090][0091]
注：以各自标准品定量，单位μg/g，n.d.为未检出。
[0092]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。