负载艾叶提取物水凝胶及其制备方法

1.本发明属于功能材料技术领域，具体涉及一种负载艾叶提取物水凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.创面延迟愈合和不愈合历来是医疗保健系统需要突破的难题，不仅给患者身心带来巨大压力，还加重了社会医疗资源负担。水凝胶是可溶性或亲水性聚合物通过化学或物理交联形成的高分子网络结构，亲水性极强，具备一定的柔韧性。水凝胶凭借独特的理化特性、良好的生物相容性及对生理环境敏感等优点成为理想的敷料材料。相较于传统敷料，水凝胶能减轻患者疼痛、改善创面环境、抗感染及促进创面愈合。
3.感染是创面不愈合的重要因素，严重感染会造成肢体坏死，甚至危及患者生命。全身应用抗生素会因创面局部血供不足而效果不佳，且不良反应多见。大量研究表明，负载抗菌剂的水凝胶可提高抗菌效果，并能避免全身用药的不良反应。
4.在治疗护理伤口中，艾叶是常用的中草药。艾叶是菊科植物艾artemisia argyi levl.et vant.的干燥叶，具有抗炎、抗菌的作用，对于伤口愈合具有很好的促进作用。然而，艾叶在伤口护理中存在水溶性差、易挥发等局限性，导致生物利用度较低，给实际应用带来困难。目前急需研制一种工艺简单且可作为药物载体的水凝胶敷料，整合艾叶和水凝胶的独特优势，避免长期使用抗生素治疗带来的不良后果，同时提高患者对于药物的使用感受，延长艾叶作用的时间，更好地促进慢性伤口的愈合。


技术实现要素：

5.根据本发明的第一个方面，提供了一种负载艾叶提取物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
6.将艾叶提取物(ae)加入介孔二氧化硅纳米颗粒分散体(msn)中，混合，得到负载艾叶提取物的介孔硅溶液(msn@ae)；
7.将甲基丙烯酸化明胶(gelma)溶解于水中得到甲基丙烯酸化明胶溶液，然后将甲基丙烯酸化透明质酸(hama)溶解于甲基丙烯酸化明胶溶液中，得到水凝胶溶液(gelma/hama)，接着将负载艾叶提取物的介孔硅溶液加入水凝胶溶液中，再加入光引发剂，用光照射，得到负载艾叶提取物水凝胶(gelma/hama/msn@ae)。
8.在一些实施方式中，介孔二氧化硅纳米颗粒分散体(msn)的制备方法为：将十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺加入水中，加热至90-100℃，温度恒定后加入正硅酸乙酯，90-100℃下反应1-2h，对反应产物进行纯化，即得。
9.在一些实施方式中，介孔二氧化硅纳米颗粒分散体(msn)的制备方法具体可以为：将2g十六烷基三甲基氯化铵和0.07g三乙醇胺加入20ml水中，搅拌并加热至95℃，保持1h，然后加入1.5ml正硅酸乙酯，95℃下搅拌1h，将反应产物以15000rpm离心5min，用乙醇洗涤3次，之后在1％nacl/甲醇溶液中用透析袋透析3h，再以15000rpm离心5min，即得。
10.在一些实施方式中，艾叶提取物(ae)的制备方法为：将艾叶用水浸没沸腾蒸馏3-5小时，得到蒸馏液、剩余的药渣和药液共混物，然后将蒸馏液、剩余的药渣和药液共混物分别用二氯甲烷萃取，重复萃取两次，合并萃取液，再将萃取液进行真空浓缩至无二氯甲烷，即得。
11.在一些实施方式中，艾叶提取物(ae)的制备方法具体可以为：将5kg艾叶用水浸没沸腾蒸馏3小时，得到50l蒸馏液、30kg剩余的药渣和药液共混物，然后将蒸馏液用50l二氯甲烷萃取，重复萃取两次，合并萃取液，得到第一萃取液，将剩余的药渣和药液共混物用30l二氯甲烷萃取，重复萃取两次，合并萃取液，得到第二萃取液，然后将第一萃取液和第二萃取液合并，得到总萃取液，再将总萃取液进行真空浓缩至无二氯甲烷，即得。
12.在一些实施方式中，艾叶提取物与介孔二氧化硅纳米颗粒分散体的体积比为3-5:1，优选为4:1。由此，按照介孔二氧化硅纳米颗粒的载药率计算，载药率为19.67％。
13.在一些实施方式中，甲基丙烯酸化透明质酸(hama)的制备方法为：将透明质酸溶解在水中，然后加入甲基丙烯酸酐，在ph为8.0-9.0条件下反应6-10小时，然后对反应产物进行纯化，冻干，即得。
14.在一些实施方式中，甲基丙烯酸化透明质酸(hama)的制备方法具体可以为：将1g透明质酸溶解在100ml水中，然后加入3ml甲基丙烯酸酐，搅拌下反应8小时，期间加入氢氧化钠使溶液ph保持在8.2-8.8，然后将反应产物用超纯水透析3-5日，截留分子量：8-14kda，将透析后的液体在-80℃下冻干，即得。
15.在一些实施方式中，甲基丙烯酸化明胶(gelma)的制备方法为：加热使明胶溶解于水中，然后加入甲基丙烯酸酐，反应8-15h，接着将反应产物进行纯化，冻干，即得。
16.在一些实施方式中，甲基丙烯酸化明胶(gelma)的制备方法具体可以为：将250ml水加热至60℃，然后加入20g明胶，搅拌溶解，再加入12ml甲基丙烯酸酐，反应12h，然后将反应产物用超纯水透析3天，截留分子量：3500da，并加入活性炭进行脱色处理，然后将得到的溶液以9000rpm离心5分钟，过滤，将得到的清液在-80℃冻干，即得。
17.在一些实施方式中，水凝胶溶液中的甲基丙烯酸化透明质酸的质量体积浓度为0.5-2％，优选为1％。
18.在一些实施方式中，甲基丙烯酸化明胶溶液中的甲基丙烯酸化明胶的质量体积浓度为8-12％，优选为10％。
19.在一些实施方式中，负载艾叶提取物的介孔硅溶液的重量与水凝胶溶液的体积的比值为50-500μg/ml。
20.在一些实施方式中，光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)或2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(2959)。光引发剂的加入量为0.1％(w/v)。
[0021]
根据本发明的第二个方面，提供了上述的制备方法制备的负载艾叶提取物水凝胶。
[0022]
与现有技术相比，本发明有益效果包括：
[0023]
(1)本发明的负载艾叶提取物水凝胶，无色透明，是一种兼具加速伤口愈合、抗菌抗炎和安全性的新型水凝胶创面敷料，可应用于慢性伤口、感染等伤口。该复合水凝胶用于慢性创面不仅可隔绝创面和外界环境，使伤口不接触环境中的病原体，而且提供湿性环境，
有利于保护创面。此外该复合水凝胶具有三维多孔结构，可以吸收大量分泌物并干燥伤口，避免软组织浸泡，促进伤口愈合。而且其中含有艾叶提取物，具有抗菌抗炎、免疫调节的效果，可加快上皮再生，安全性高。
[0024]
(2)本发明先将艾叶提取物(ae)负载在介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)中，然后再载入gelma/hama水凝胶中，ae释放时，首先从msn的介孔结构扩散到gelma/hama水凝胶结构，然后再从gelma/hama水凝胶的多孔结构中逸出，在周围流体中产生浓度梯度，实现ae的持续释放，并且通过gelma/hama水凝胶的溶胀，实现ae的双重缓释。本发明能够延长艾叶作用的时间，更好地促进慢性伤口的愈合。
[0025]
(3)本发明具有稳定的流变性、适宜的力学性能、适宜的生物降解性、溶胀性和缓释性的特点，能够与皮肤形成良好粘合，适用于身体不同部位的创面。
[0026]
(4)本发明水凝胶的交联结构防止了材料的快速溶解，并在使用时提供了机械稳定性和耐用性，从而减少敷料的更换次数，减少患者在更换敷料时带来的二次伤害和疼痛。
[0027]
(5)本发明具有良好的溶胀效果，这赋予了水凝胶良好的输送营养物质和废物的能力。
[0028]
(6)本发明具有弹性固体性质和良好的稳定性，有利于保持水凝胶的完整性，保护伤口免受外界冲击。
附图说明
[0029]
图1为不同ae浓度的水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抗菌性能测试结果。
[0030]
图2为水凝胶的体外细胞毒性研究、死活细胞染色、骨架检测结果。
[0031]
图3为水凝胶对巨噬细胞表型的转化作用检测结果。
[0032]
图4为水凝胶的缓释性能检测结果。
[0033]
图5为大鼠伤口愈合情况检测结果。
[0034]
图6为水凝胶的溶胀、流变、压缩、降解性能检测结果。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明，值得说明的是，以下实施例只是为了更好地解释本发明的内容，并不对本发明保护的范围做限制。实施例中未公开的工艺步骤为现有技术。若无特殊说明，以下原料均为市购。
[0036]
以下实施例中，所用艾叶提取物(ae)的制备方法为：将5kg蕲艾用水浸没沸腾蒸馏3小时，得到50l蒸馏液、30kg剩余的药渣和药液共混物，然后将蒸馏液用50l二氯甲烷萃取，重复萃取两次，合并萃取液，得到第一萃取液，将剩余的药渣和药液共混物用30l二氯甲烷萃取，重复萃取两次，合并萃取液，得到第二萃取液，然后将第一萃取液和第二萃取液合并，得到约140l的总萃取液，再将总萃取液在40℃下进行真空浓缩至无二氯甲烷，即得。
[0037]
实施例1
[0038]
本实施例的负载艾叶提取物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0039]
(1)甲基丙烯酸化明胶(gelma)的制备
[0040]
将250ml超纯水加热至60℃，然后加入20g明胶，边搅拌边溶解，缓慢滴加12ml甲基
丙烯酸酐，常温下反应过夜，然后将反应产物用超纯水透析3天(mwco 3500da)，并加入活性炭进行脱色处理，然后将得到的溶液以9000rpm离心5分钟，再用神奇滤布过滤，将得到的清液在-80℃冻干，即得。通过对明胶的甲基丙烯酰化，使其具有光固化的能力。
[0041]
(2)甲基丙烯酸化透明质酸(hama)的制备
[0042]
将1g透明质酸溶解在100ml超纯水中，缓慢滴加3ml甲基丙烯酸酐，不断搅拌，常温下反应8小时，期间加入5mol/l的氢氧化钠将溶液ph保持在8.5左右，将反应产物用超纯水透析3-5日(截留分子量：8-14kda)，将透析后的液体在-80℃下冻干，即得。通过对透明质酸的甲基丙烯酰化，使其具有光固化的能力。
[0043]
(3)介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)分散体的制备
[0044]
将2g十六烷基三甲基氯化铵(ctac)和0.07g三乙醇胺(tea)加入20ml超纯水中，猛烈搅拌并加热至95℃，溶液稳定1h后，在2min内滴入1.5ml正硅酸乙酯(teos)，在95℃下继续搅拌1h，将反应产物以15000rpm离心5min，用乙醇洗涤3次以去除残留反应，之后在1％nacl/甲醇溶液中用透析袋(mwco 3500da)透析3h，去除模板剂ctac，再以15000rpm离心5min，即得。
[0045]
(4)负载艾叶提取物的介孔硅溶液(msn@ae)的制备
[0046]
在4ml msn分散体中加入1ml艾叶提取物(ae)，在37℃下搅拌24h，即得。按照介孔二氧化硅纳米颗粒的载药率计算，载药率为19.67％。
[0047]
(5)负载艾叶提取物水凝胶(gelma/hama/msn@ae水凝胶)的制备
[0048]
将gelma在去离子水中的浓度固定为10％(w/v)，然后将1％(w/v)hama溶解在gelma中，得到水凝胶溶液，将101.68μg msn@ae(其中含有20μg ae)加入1ml水凝胶溶液中，再加入0.1％(w/v)光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)，经405nm蓝光照射30s，即得。
[0049]
实施例2
[0050]
本实施例的负载艾叶提取物水凝胶的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤(5)中，加入250.19μg msn@ae(其中含有50μgae)。
[0051]
实施例3
[0052]
本实施例的负载艾叶提取物水凝胶的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤(5)中，加入508.39μg msn@ae(其中含有100μgae)。
[0053]
实施例4
[0054]
本实施例的负载艾叶提取物水凝胶的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤(5)中，加入50.84μg msn@ae(其中含有10μgae)。
[0055]
实施例5
[0056]
本实施例的负载艾叶提取物水凝胶的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤(5)中，加入127.10μg msn@ae(其中含有25μgae)。
[0057]
实施例6
[0058]
本实施例的负载艾叶提取物水凝胶的制备方法与实施例1相同，区别在于，步骤(5)中，加入1016.78μg msn@ae(其中含有200μgae)。
[0059]
对比例1
[0060]
本对比例的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0061]
(1)甲基丙烯酸化明胶(gelma)的制备
[0062]
将250ml超纯水加热至60℃，然后加入20g明胶，边搅拌边溶解，缓慢滴加12ml甲基丙烯酸酐，常温下反应过夜，然后将反应产物用超纯水透析3天(mwco 3500da)，并加入活性炭进行脱色处理，然后将得到的溶液以9000rpm离心5分钟，再用神奇滤布过滤，将得到的清液在-80℃冻干，即得。通过对明胶的甲基丙烯酰化，使其具有光固化的能力。
[0063]
(2)甲基丙烯酸化透明质酸(hama)的制备
[0064]
将1g透明质酸溶解在100ml超纯水中，缓慢滴加3ml甲基丙烯酸酐，不断搅拌，常温下反应8小时，期间加入5mol/l的氢氧化钠将溶液ph保持在8.5左右，将反应产物用超纯水透析3-5日(截留分子量：8-14kda)，将透析后的液体在-80℃下冻干，即得。通过对透明质酸的甲基丙烯酰化，使其具有光固化的能力。
[0065]
(3)水凝胶(gelma/1％hama水凝胶)的制备
[0066]
将gelma在去离子水中的浓度固定为10％(w/v)，然后将1％(w/v)hama溶解在gelma中，得到水凝胶溶液，再加入0.1％(w/v)光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)，经405nm蓝光照射30s，即得。
[0067]
对比例2
[0068]
本对比例的水凝胶的制备方法与对比例1相同，区别在于，步骤(3)中，将0.5％(w/v)hama溶解在gelma中。
[0069]
对比例3
[0070]
本对比例的水凝胶的制备方法与对比例1相同，区别在于，步骤(3)中，将2％(w/v)hama溶解在gelma中。
[0071]
对比例4
[0072]
本对比例的负载艾叶提取物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0073]
(1)甲基丙烯酸化明胶(gelma)的制备
[0074]
将250ml超纯水加热至60℃，然后加入20g明胶，边搅拌边溶解，缓慢滴加12ml甲基丙烯酸酐，常温下反应过夜，然后将反应产物用超纯水透析3天(mwco 3500da)，并加入活性炭进行脱色处理，然后将得到的溶液以9000rpm离心5分钟，再用神奇滤布过滤，将得到的清液在-80℃冻干，即得。通过对明胶的甲基丙烯酰化，使其具有光固化的能力。
[0075]
(2)甲基丙烯酸化透明质酸(hama)的制备
[0076]
将1g透明质酸溶解在100ml超纯水中，缓慢滴加3ml甲基丙烯酸酐，不断搅拌，常温下反应8小时，期间加入5mol/l的氢氧化钠将溶液ph保持在8.5左右，将反应产物用超纯水透析3-5日(截留分子量：8-14kda)，将透析后的液体在-80℃下冻干，即得。通过对透明质酸的甲基丙烯酰化，使其具有光固化的能力。
[0077]
(3)负载艾叶提取物水凝胶(gelma/hama/ae水凝胶)的制备
[0078]
将gelma在去离子水中的浓度固定为10％(w/v)，然后将1％(w/v)hama溶解在gelma中，得到水凝胶溶液，将50μg ae加入1ml水凝胶溶液中，再加入0.1％(w/v)光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)，经405nm蓝光照射30s，即得。
[0079]
为验证本发明制备的负载艾叶提取物水凝胶在抗菌、细胞毒性、缓释方面的性能，进行以下性能测试。
[0080]
1、实验过程
[0081]
(1)体外抗菌测试
[0082]
分别向24孔板中加入吸光度od＝0.1的革兰氏阴性菌(大肠杆菌e.coli)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌s.aureus)的菌悬液1.8ml，然后将对比例1制备的gelma/hama、实施例1-3制备的gelma/hama/msn@ae水凝胶分别置于24孔板的两种菌悬液中，放入37℃培养箱中共培养4h。取100μl共培养的菌悬液涂布均匀，置于37℃培养箱中培养24h，拍照计数菌落的数目。每种菌体做三个平行样。
[0083]
(2)体外细胞毒性研究
[0084]
①
细胞培养：采用dmem完全培养基(含10％肽牛血清、100mol/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，将冻存的小鼠成纤维细胞(l929)在37℃，含有5％co2培养箱中进行复苏，每48h传代一次，得到生长状态稳定的细胞，取对数生长期的细胞用于后续实验。
[0085]
②
将对比例1制备的gelma/hama、实施例2～6制备的gelma/hama/msn@ae水凝胶用pbs溶液冲洗，再往水凝胶中加入300μl的deme完全培养基浸润，放入在37℃，含有5％co2培养箱中，培养5分钟后将deme培养基除去，为细胞创造良好的生长环境。
[0086]
③
将培养的l929细胞用0.25％胰酶消化悬浮后，离心去除胰酶，在每个水凝胶试样中加入400μl含10000个/ml细胞的培养基连续培养5天，以不加任何样品只添加1ml细胞悬液为空白对照。实验设置第1、3、5天三个时间点，每孔加入300μl以deme培养基稀释的1：10的cck-8溶液，在含有5％co2的37℃恒温二氧化碳培育箱中孵育1h，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度(od)，按照公式计算细胞存活率：
[0087]
细胞存活率(％)＝od实验组/od对照组
×
100％
[0088]
(3)死活细胞染色
[0089]
制备活死染色工作液(2μm calcein am,8μm pi)，充分混匀；将l929细胞分别在gelma、对比例1制备的gelma/hama、实施例2制备的gelma/hama/msn@ae水凝胶上面孵育到一定时间点后，加入活死染色工作液，取出载细胞支架用1
×
pbs清洗3次；然后加入工作液室温孵育20分钟；1
×
pbs清洗1次；加入抗荧光淬灭剂后立即用olympus fv3000扫描激光共聚焦显微镜采集图片，分析细胞活死。钙黄素am标记活细胞发出绿色荧光，碘化丙啶(pi)标记死细胞发出红色荧光。
[0090]
(4)骨架检测
[0091]
将l929细胞分别在gelma、对比例1制备的gelma/hama、实施例2制备的gelma/hama/msn@ae水凝胶上面孵育到一定时间点后，取出载细胞支架用1
×
pbs清洗3次；4％多聚甲醛中固定0.5小时；1
×
pbs清洗5分钟/次，3次；0.5％triton-x-100处理10分钟，1
×
pbs清洗5分钟/次，3次；加入鬼笔环肽避光孵育0.5小时；1
×
pbs清洗5分钟/次，3次；加入dapi避光孵育10分钟；1
×
pbs清洗5分钟/次，3次；加入抗荧光淬灭剂于4℃避光保存。免疫荧光染色结果分析：用olympus fv3000扫描激光共聚焦显微镜采集图片，分析细胞生长情况。
[0092]
(5)对巨噬细胞表型的转化作用
[0093]
将raw 264.7细胞接种于含1
×
104个/孔dmem的6孔板中，37℃培养过夜，培养箱内含5％co2。分别将灭菌的gelma、对比例1制备的gelma/hama、实施例1～3制备的gelma/hama/msn@ae水凝胶浸泡在含lps的dmem中，然后与细胞共培养，将不含水凝胶的样品作为对照组。
[0094]
为了研究raw 264.7巨噬细胞不同表型相关蛋白的表达，将raw 264.7巨噬细胞用
含1％pmsf的ripa裂解缓冲液在冰上裂解20min，进行western blot分析。用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳。将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，在4℃下与不同的一抗孵育过夜，在22℃时用辣根过氧化物酶偶联的二抗处理1h。用增强的化学发光试剂(beyotime，江苏，中国)显影斑点，并通过x射线胶片检测信号。用ipp6.0软件对蛋白质表达水平进行定量。
[0095]
(6)缓释性能
[0096]
将对比例4制备的gelma/hama/ae、实施例2制备的gelma/hama/msn@ae水凝胶浸泡在10ml pbs中，在37℃下100rpm搅拌培养，在特定时间点收集1ml上清液，置换1ml新鲜pbs。在λ＝345nm处，用紫外光谱仪测量ae浓度。
[0097]
(7)大鼠伤口愈合测试
[0098]
选用14只200-250克sprague dawley雌性大鼠，术前腹腔注射3％戊巴比妥(45-60mg/kg)麻醉大鼠。老鼠背部用脱毛膏脱毛，并用碘伏消毒。在大鼠背部造成4个直径12毫米的圆形全厚皮肤损伤，每个伤口距离两厘米。然后，分别用无菌医用棉纱布、对比例1制备的gelma/hama水凝胶、实施例2制备的gelma/hama/msn@ae水凝胶、市售水胶体敷料覆盖伤口，于术后第3、7、10、14天观察伤口愈合情况。每3天更换一次伤口水凝胶。
[0099]
(8)溶胀率测试
[0100]
将gelma、对比例1-3制备的gelma/hama水凝胶分别放在pbs溶液中，在给定的时间点，用称重纸去除地表多余水分后对样品进行称重。水凝胶的溶胀率计算公式为:溶胀率＝(w
t-w0)/w0×
100％，其中w
t
和w0分别表示时间t和0时水凝胶的重量。
[0101]
(9)流变测量
[0102]
采用ta流变仪进行动态应变扫描，测定gelma、对比例1-3制备的gelma/hama水凝胶的储能模量(g’)和损耗模量(g”)的变化曲线，在室温下进行了剪切频率为0.1～10hz的流动扫描实验，并在应变为1％的条件下记录了固定频率为1hz的粘弹性区域，以评价水凝胶的剪切粘度行为。
[0103]
(10)压缩试验
[0104]
分别将gelma、对比例1-3制备的500μl圆柱形gelma/hama水凝胶(高度为6mm，直径为12mm)在压应变速率固定在0.05mm/s，应变水平达到最大值的60％的条件下测试压缩模量。
[0105]
(11)体外生物降解
[0106]
分别将gelma、对比例1-3制备的300μl gelma/hama水凝胶样品在37℃下浸泡在含0或1000u/ml溶菌酶的pbs溶液中，在特定时间点从溶液中取出样品，用超纯水冲洗3次。样品经冷冻干燥后称重。降解率按以下公式计算:降解率(％)＝(w
0-w
t
)/w0×
100％，其中w
t
和w0分别对应于冻干水凝胶在时间t和0时的重量。
[0107]
2、实验结果
[0108]
(1)抗菌性能
[0109]
图1是不同ae浓度的水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抗菌性能测试结果，从图中可以看出，gelma/hama对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌效果非常有限；gelma/hama/msn@ae水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌效果优于gelma/hama，并且随着gelma/hama/msn@ae水凝胶中艾叶提取物含量的增加，gelma/hama/msn@ae水凝胶对大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌效果也随之增强。
[0110]
(2)体外细胞毒性研究结果
[0111]
如图2a所示，在0-100μg/ml ae浓度范围内，msn@ae没有显示细胞毒性。根据抗菌活性和细胞毒性的评价结果，选择50μg/ml ae作为复合水凝胶的最佳浓度。
[0112]
(3)死活细胞染色结果
[0113]
如图2b所示，所有水凝胶组的细胞呈现出高活性和增殖活性。特别是第5天，gelma/hama/msn@ae组细胞活力较高(为129.3
±
6.8％)，对l929细胞的增殖有明显的促进作用。
[0114]
活/死细胞染色结果如图2c所示，接种于gelma/hama/msn@ae水凝胶中的l929细胞呈绿色荧光，表明大部分细胞是活的。
[0115]
(4)骨架检测结果
[0116]
如图2d所示，在gelma/hama/msn@ae水凝胶上生长的l929细胞在第5天比gelma水凝胶有更多的伸长和更厚的肌动蛋白丝。
[0117]
(5)对巨噬细胞表型的转化作用检测结果
[0118]
如图3所示，wb分析显示，gelma/hama/msn@ae水凝胶处理组诱导型一氧化氮合酶(inducible reaction，inos)的表达明显低于无水凝胶处理组和gelma/hama组，而抗炎巨噬细胞(anti-inflammatory macrophage，cd206)m2表型标志物的表达则相对上调。结果表明，gelma/hama/msn@ae水凝胶通过促进巨噬细胞从m1到m2的表型转化，有助于炎症反应的消退，并可能抑制创面愈合过程中的炎症反应。
[0119]
(6)缓释性能
[0120]
图4是ae在gelma/hama和gelma/hama/msn中的释放对比图，从图中可以看出，gelma/hama/ae水凝胶中的ae经历了爆发性释放。载药后8h释放率约为48.1％，48h后释放量缓慢并达到平台期，累计释放率约为93.9％。而gelma/hama/msn@ae水凝胶中ae的释放明显延长。约9.3％的ae在8h内被持续释放，ae释放曲线接近零级动力学释药曲线。表明本发明的gelma/hama/msn@ae水凝胶具有很好的缓释效果，能够延长艾叶作用的时间。
[0121]
(7)大鼠伤口愈合情况
[0122]
如图5a所示，随着时间的推移，所有组的皮肤缺损都缩小了。gelma/hama水凝胶组、gelma/hama/msn@ae水凝胶组和市售水胶体组均能显著促进创面愈合，而纱布组对创面愈合的促进作用较弱。gelma/hama/msn@ae组的全层皮肤缺损在第14天几乎闭合，其次是gelma/hama组和水胶体组，纱布组最慢，如图5b中伤口面积的量化所示。
[0123]
第3天，纱布、gelma/hama水凝胶、gelma/hama/msn@ae水凝胶和市售水胶体的创面大小分别为96.1
±
8.1％、82.1
±
8.0％、69.3
±
10.2％和77.4
±
8.9％。术后7天，gelma/hama/msn@ae组创面面积为25.7
±
2.6％，明显低于对照组44.6
±
25.0％。第10天，gelma/hama/msn@ae水凝胶在促进创面愈合方面表现出优势，创面接近闭合，而纱布组、gelma/hama组和市售水胶体组的创面面积分别为11.7
±
0.8％、9.9
±
1.1％和9.2
±
0.7％。
[0124]
综上所述，gelma/hama/msn@ae水凝胶的创面尺寸最小，说明所制备的水凝胶能够达到预期的效果，有效地抑制炎症，表现出较好的创面收缩效果。
[0125]
(8)溶胀性能
[0126]
如图6a所示，所有水凝胶的溶胀能力在5h后几乎达到饱和，并达到平衡溶胀。
gelma凝胶、gelma/0.5％hama、gelma/1％hama、gelma/2％hama水凝胶的溶胀率分别为5.7
±
0.5％、9.0
±
0.4％、12.6
±
0.7％和16.0
±
0.9％。表明gelma/hama混合物具有良好的吸水能力。
[0127]
(9)流变性能
[0128]
如图6b和图6c所示，当振荡剪切应变固定在1％时，储能模量(g’)均大于损耗模量(g”)，说明水凝胶的凝胶化速度较快。在0.1～10hz频率范围内，g’的变化几乎是恒定的，且仍大于g”，说明水凝胶具有弹性固体性质和良好的稳定性。
[0129]
(10)压缩分析
[0130]
如图6d所示，约60％的压缩力能够破坏gelma水凝胶，gelma/1％hama水凝胶的压缩模量最高，高达381.9kpa，约为单纯凝胶的1.3倍，与人体皮肤的真皮相似。但进一步增加hama浓度会增加凝胶的脆性。此外，gelma/1％hama水凝胶的破坏应变虽然降低到47％，但仍然可以压缩到40％而不断裂。因此，选择1％的hama作为获得复合水凝胶的适宜浓度。
[0131]
(11)降解结果
[0132]
如图6e和图6f所示，随着培养时间的延长，所有水凝胶均出现明显的质量损失。另外，无溶菌酶的pbs样品质量降解速度不如溶菌酶快。gelma水凝胶在10天内完全降解。随着hama含量的增加，降解速率逐渐降低。
[0133]
综上所述：
[0134]
(1)本发明的gelma/hama/msn@ae水凝胶是一种兼具加速愈合、抗菌抗炎和安全性的新型水凝胶创面敷料，应用于伤口中，起到促进伤口愈合及抗炎抗菌的作用。
[0135]
(2)本发明具有稳定的流变性、适宜的力学性能、适宜的生物降解性、溶胀性和缓释性的特点，能够与皮肤形成良好粘合，适用于身体不同部位的创面。
[0136]
(3)本发明水凝胶的交联结构防止了材料的快速溶解，并在使用时提供了机械稳定性和耐用性，从而减少敷料的更换次数，减少患者在更换敷料时带来的二次伤害和疼痛。
[0137]
(4)本发明具有良好的溶胀效果，这赋予了水凝胶良好的输送营养物质和废物的能力。
[0138]
(5)本发明具有弹性固体性质和良好的稳定性，有利于保持水凝胶的完整性，保护伤口免受外界冲击。
[0139]
以上所述的仅是本发明的一些具体实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造性构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。