一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法与流程

1.本技术涉及多肽活性检测技术领域，特别是涉及一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法。


背景技术：

2.亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(mthfd2)，又称为亚甲基四氢叶酸环水解酶，是一种具有亚甲基四氢叶酸脱氢酶及环化水解酶双重活性的双功能酶，在线粒体叶酸代谢中呈高表达水平。研究显示，mthfd2的活性与多种类型肿瘤的发生和发展密切相关；因此，mthfd2活性检测对肿瘤研究具有重要意义。
3.目前普遍使用的mthfd2活性检测方法是，使用催化剂nad 辅助因子和mthfd2对5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢进行催化，在常温反应30min后，最终生成nadh，使用nadh-glo detection system与生成的nadh在常温反应60min，然后，使用酶标仪检测化学发光信号；根据所检测到的化学发光信号判断nadh的量，进而判断mthfd2的活性。该方法虽然能够比较有效的检测mthfd2活性；但是，反应时间较长，需要至少90min；并且，反应条件受到化学发光试剂的性质限制，需要购买glo detection system检测试剂等。
4.因此，如何研发更简单方便，且快速的mthfd2活性检测方法，是亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本技术的目的是提供一种新的检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2抗体活性的方法。
6.本技术采用了以下技术方案：
7.本技术公开了一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法，其包括采用待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2和催化剂nad 辅助因子对反应底物5,10-亚甲基四氢叶酸进行脱氢催化反应，反应过程中，对反应产物进行340nm的紫外吸光值检测，根据检测的340nm紫外吸光值来计算反应产物中nadh的含量，并根据不同反应时间后的反应产物中nadh的含量计算待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性。
8.需要说明的是，本技术研究发现nad 在260nm的紫外吸光值比较高，而nadh在340nm紫外吸光度比较高；因此，可以直接利用以上特征，检测反应产物在340nm的紫外吸光值，以此计算反应产物中nadh的含量，从而计算亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性。可以理解，本技术的活性检测方法，只需要检测340nm的紫外吸光值即可，无需额外使用glo detection system等检测试剂，不仅节省了检测成本，也省略了nadh-glo detection system与nadh的反应时间，使得本技术的检测方法能够更简单方便，且快速的检测mthfd2活性。
9.本技术的一种实现方式中，根据检测的340nm紫外吸光值计算反应产物中nadh的含量，具体包括，采用若干个已知浓度的nadh进行340nm紫外吸光值检测，根据检测结果绘制nadh浓度与340nm紫外吸光值的拟合曲线，即获得nadh标准曲线，根据检测的反应产物的340nm紫外吸光值和nadh标准曲线计算反应产物中nadh的含量。
10.本技术的一种实现方式中，nadh标准曲线由2.5mmol/l的nadh，以2倍梯度稀释，总计获得6个已知浓度的nadh进行340nm紫外吸光值检测，根据6个nadh的检测结果绘制获得。
11.本技术的一种实现方式中，nadh标准曲线的拟合公式为y＝0.9831x-0.0361，x是nadh浓度，y是340nm的紫外吸光值。
12.本技术的一种实现方式中，根据不同反应时间后的反应产物中nadh的含量计算待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性，具体包括：
13.1)检测340nm的紫外吸光度，根据所述nadh标准曲线的拟合公式，计算mthfd2酶反应产生的nadh含量；
14.2)固定底物的浓度和nad 浓度，加入不同浓度的酶量，常温酶标仪30s动力循环检测一次340nm的紫外吸光度，后用实验组减去不含mthfd2酶的对照组，按照nadh标曲的拟合公式计算出nadh含量，取4min之内的值制作曲线；
15.3)对4min之内的不同时间对应的nadh含量进行拟合，拟合曲线的斜率为反应速度v，换算成标准单位pmol/min，制作反应酶量和反应速度的曲线图；
16.4)固定酶量和nad 浓度，改变底物5,10-亚甲基四氢叶酸的浓度，常温酶标仪30s动力循环检测一次340nm的紫外吸光度，根据步骤2)和步骤3)的计算方法得出反应速度和底物浓度的关系，换算成标准单位pmol/min/ug，制作曲线图，使用prism 7软件计算km值；以km表征待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的亲和力，km越小，亲和力越大，酶活性越强，km越大，亲和力越小，酶活性越小。
17.本技术的一种实现方式中，具体如下：
18.(1)当检测到340nm的紫外吸光度就可以反推mthfd2酶反应产生的nadh含量，即按照公式x＝(y 0.0361)/0.9831；(2)根据不同浓度的nadh含量对应的340nm的紫外吸光度拟合的公式，y＝0.9831x-0.0361；(3)固定底物的浓度为500μmol/l，nad 浓度为500μmol/l，加入不同浓度的酶量，常温酶标仪30s动力循环检测一次340nm的紫外吸光度，后用实验组减去不含mthfd2酶的对照组，按照nadh标曲公式计算出含量，取4min之内的值制作曲线，拟合曲线；(4)不同时间反应拟合曲线的斜率为反应速度v，然后换算成标准单位pmol/min，制作反应酶量和反应速度的曲线图；(5)固定酶量为40nmol/l，nad 浓度为500μmol/l，改变底物浓度folitixorin，从500μmol/l开始，2倍稀释，7个梯度，常温酶标仪30s动力循环检测一次340nm的紫外吸光度，根据步骤(2)和(4)的计算方法得出反应速度和底物浓度的关系，换算成标准单位pmol/min/μg，制作曲线图，然后使用prism 7软件即可计算km值。
19.需要说明的是，km是mtfhd2酶的重要特征性常数，它与酶的性质有关，而和浓度无关。km值可表示酶对底物的亲和力，km值越小，表示亲和力越大，km值越大，表示亲和力越小。
20.本技术的一种实现方式中，本技术的活性检测方法还包括，在计算获得反应产物中nadh的含量后，根据抑制率公式计算不同时间、不同浓度的抑制剂ly345899对待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的抑制率，使用prism 7软件计算ly345899的ic50，以此表征待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性。
21.本技术的一种实现方式中，催化剂nad 辅助因子的浓度为200-500μmol/l。
22.本技术的一种实现方式中，反应底物5,10-亚甲基四氢叶酸的浓度为100-500μmol/l。
23.本技术的一种实现方式中，待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的浓度为10-50nmol/l。
24.本技术的有益效果在于：
25.本技术的亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性检测方法，只需要检测5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢催化反应产物的340nm紫外吸光值，根据nadh标准曲线，即可简单方便的获得反应产物中的nadh含量，从而计算获得亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性。本技术的活性检测方法，极大的缩短了检测时间，能够更好的适用于需要快速检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的场景。
附图说明
26.图1是本技术实施例中绘制的nadh标准曲线；
27.图2是本技术实施例中不同mthfd2浓度绘制的曲线；
28.图3是本技术实施例中不同mthfd2浓度与反应速度的曲线；
29.图4是本技术实施例中不同浓度的底物folitixorin绘制的曲线；
30.图5是本技术实施例中不同浓度的ly345899抑制剂绘制的曲线。
具体实施方式
31.下面通过具体实施例对本技术作进一步详细说明。以下实施例仅对本技术进行进一步说明，不应理解为对本技术的限制。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下可以省略，或者可以由其他试剂盒、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。以下实施例中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
32.实施例
33.一、主要试剂和仪器
34.本例使用的主要试剂和仪器如表1所示。
35.表1主要试剂和仪器
36.产品名称规格型号生产厂商原厂编码recombinant human mthfd2 protein0.5mgnovusbionbp2-51979-0.5mgly 3458995mgmedchemexpresshy-101943nad 500mgmedchemexpresshy-b0445folitixorin50mg上海一飞生物e04431596孔透明培养板 nest701001酶标仪 thermovarioskan luxnadh1ggermany1.01e 10hepes500g阿拉丁h109406-500g
37.本例使用的缓冲液包括：
38.缓冲液母液：
39.10mmol/l的nadh：分子量为709.4，称量0.007094g，用无菌水溶解到1ml，分装100μl/管，冻在-20度冰箱保存。
40.20mmol/l的nad ：分子量663，称量0.01326g，用无菌水溶解到1ml，分装50μl/管，冻在-20度冰箱保存。
41.1mol/l的kcl：分子量74.55，称量3.7275g，用无菌水溶解到50ml。
42.1mol/l的mgcl2：分子量203.3，称量2.03g，用无菌水溶解到10ml。
43.250mmol/l的hepes：分子量238.30，称量1.19g，用无菌水溶解到10ml，调节ph8.0。
44.0.2mol/l的nah2po
4 2h2o：分子量156.01，称量0.312g，用无菌水溶解到10ml。
45.0.2mol/l的na2hpo
4 12h2o：分子量358.14，称量3.5814g，用无菌水溶解到50ml。
46.配置10ml 200mmol/l的磷酸缓冲液：取0.2mol/l的nah2po
4 2h2o缓冲液530μl，0.2mol/l的na2hpo
4 12h2o缓冲液9.47ml，ph8.0。
47.配置2
×
mtfhd2 assay buffer 10ml：250mmol/l的hepes 4ml、1mol/l的kcl 2ml、1mol/l的mgcl
2 0.01ml、200mmol/l的磷酸缓冲液2.5ml、ddh2o1.49ml。
48.二、酶活性检测实验
49.1.制作nadh标准曲线
50.采用浓度为2.5mmol/l的nadh标准品，以2倍梯度稀释，稀释五次，获得6个梯度的nadh标准品；每个梯度的nadh标准品各取90μl，用酶标仪检测340nm的紫外吸光值，绘制nadh标准曲线。
51.nadh标准曲线如图1所示，图1中，横坐标为nadh的浓度，单位为；纵坐标为340nm的紫外吸光值。图1的结果显示，nadh浓度与340nm紫外吸光值具有很好的线性关系，拟合公式为y＝0.9831x-0.0361，x是nadh浓度，y是340nm的紫外吸光值，两者的相关系数为r2＝0.9986。
52.2.mthfd2不同酶量绘制曲线
53.配制反应液，使得反应液中底物folitixorin的浓度为500μmol/l、nad 的浓度为500μmol/l，反应液中加入2
×
mtfhd2 assay buffer 50μl；并且，控制mthfd2的加入量，使得反应液中mthfd2的浓度分别为50nmol/l、40nmol/l、30nmol/l、20nmol/l、10nmol/l，反应液总体积为100μl。即分别配制了反应液中mthfd2的浓度分别为50nmol/l、40nmol/l、30nmol/l、20nmol/l、10nmol/l的五个反应液体系，用于绘制不同酶量的反应曲线；并设计不添加mthfd2的反应液体系作为对照，即mthfd2的浓度为0nmol/l作为对照。
54.将反应液置于常温20-30℃反应30min，用酶标仪动力学循环在340nm检测紫外吸光值，每30s检测一次，收集数据，绘制曲线。不同mthfd2浓度绘制的曲线如图2所示。图2中横坐标是时间(min)，纵坐标是产物中nadh的浓度(nmol/l)。图2的结果显示，
55.0nmol/l y＝(-7e-15)x 36.721 r2＝-1e-16
56.10nmol/l y＝0.9392x 49.026 r2＝0.9942
57.20nmol/l y＝2.326x 49.485 r2＝0.9949
58.30nmol/l y＝3.0109x 52.354 r2＝0.9948
59.40nmol/l y＝5.3369x 84.976 r2＝0.9976
60.50nmol/l y＝2.6989x 61.409 r2＝0.9862
61.根据图2的结果，取图2各曲线的斜率值，绘制反应速度与不同酶量之间的曲线，结
果如图3所示。图3中横坐标是酶量，即mthfd2浓度(nmol/l)，纵坐标为反应速度v(pm/min)。图3的结果显示，mthfd2浓度为40nmol/l时，反应速度最快。
62.三、计算mtfhd2酶的米氏常数km
63.配置不同浓度底物folitixorin的反应液，从反应液中folitixorin的浓度为500μmol/l开始，2倍梯度稀释，总计稀释六次，获得7个梯度浓度底物folitixorin的反应液，反应液中mthfd2浓度为40nmol/l，nad 的浓度为500μmol/l，反应液总体积为100μl。用酶标仪动力学循环在340nm检测紫外吸光值，每30s检测一次，收集30min数据，绘制曲线，计算最大反应速率一半对应的底物浓度km。结果如图4所示。
64.图4的结果显示，km＝160μmol/l。km是mtfhd2酶的重要特征性常数，它与酶的性质有关，而和浓度无关。km值可表示酶对底物的亲和力，km值越小，表示亲和力越大，km值越大，表示亲和力越小。
65.四、ly345899对mtfhd2和底物folitixorin作用抑制的ic50
66.配置不同浓度ly345899的反应液，从反应液中ly345899的浓度为10μmol/l开始，2倍梯度稀释，总计稀释五次，获得6个梯度浓度ly345899的反应液。反应液中mthfd2浓度为40nmol/l，nad 的浓度为250μmol/l。先是ly345899和mtfhd2，nad 的反应液反应10min，再加入终浓度250μmol/l的底物folitixorin，用酶标仪动力学循环在340nm检测紫外吸光值，每2min检测一次，收集20min数据，绘制曲线，结果如图5所示。图5中，各曲线分别是反应时间2分钟、4分钟、6分钟、8分钟的曲线；横坐标为ly345899浓度的对数，纵坐标为抑制率(％)。
67.图5的结果显示，在8min之内，实验的重复性和一致性比较好，反应速度比较快。因此，本例的活性检测方法，可以通过检测8min内的ic50，表征待测mtfhd2的活性，即本例的检测方法只需要8分钟即可完成检测。
68.使用prism 7软件计算8min之内的ic50，结果如表2所示。
69.表2 8min内ic50的统计结果
70.时间(min)2468平均值ic50(μmol/l)0.65550.64430.71080.65040.66525r20.99430.99930.99980.9999 71.抑制率计算公式＝100％*[(阳性对照-实验孔)/(阳性对照-阴性对照)]
[0072]
阳性对照：含有mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，250μmol/l的底物folitixorin，40nmol/l mthfd2，水。
[0073]
实验孔：含有mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，250μmol/l的底物folitixorin，40nmol/l mthfd2，水，以及不同浓度的ly345899。
[0074]
阴性对照：含有mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，250μmol/l的底物folitixorin，水。
[0075]
表2的结果显示，平均ic50＝665nmol/l，和文献报道的ic50＝663nmol/l非常接近，因为每个实验条件操作不同，偏差2％左右都是正常的，因此可以认为ly345899对mtfhd2的抑制ic50是一致的，证明本例活性检测方法可行。
[0076]
五、样本检测
[0077]
采用本例的检测方法，对5个mthfd2样本进行活性检测；同时，采用常规方法，利用
glo detection system检测试剂对相同的5个mthfd2样本进行检测，检测结果如表3所示。
[0078]
本例的具体检测方法如下：
[0079]
(1)在96孔板中，实验组加入mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，40nmol/l mthfd2，水，10μmol/l ly345899，体积100μl，2倍稀释，7个梯度，2个重复。阳性对照：含有mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，40nmol/lmthfd2，水。阴性对照：含有mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，水。反应液总体积100μl，常温反应10min。
[0080]
(2)加入100μmol/l的底物folitixorin，用酶标仪动力学循环30s检测一次340nm的紫外吸收值。
[0081]
(3)根据反应产物中nadh的含量计算待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性的方法处理数据。
[0082]
利用glo detection system检测试剂具体检测方法如下：
[0083]
(1)在96孔板中，实验组加入mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，40nmol/l mthfd2，水，10μmol/l ly345899，体积100μl，2倍稀释，7个梯度，2个重复。阳性对照：含有mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，40nmol/lmthfd2，水。阴性对照：含有mtfhd2 assay buffer，250μmol/l nad ，水。总体积100μl，常温反应10min。
[0084]
(2)加入100μmol/l的底物folitixorin，常温反应30min。
[0085]
(3)加入nad(p)h-glo
tm
detection system分装好的试剂，常温反应60min。
[0086]
(4)用酶标仪检测化学发光。
[0087]
(5)根据反应产物中nadh的含量计算待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性的方法处理数据。
[0088]
表3不同检测方法获得的mthfd2的ic50活性结果，单位nmol/l
[0089]
样本编号本例方法活性检测结果常规方法活性检测结果1675.7665.52670.7667.23668.5664.34669.2668.65668.5669.3
[0090]
表3的结果显示，本例的mthfd2活性检测方法，其检测结果与常规的glo detection system试剂的检测结果一致；说明本例的活性检测方法，仅仅通过检测反应体系中的340nm紫外吸光值，即可准确有效的检测mthfd2活性。本例的mthfd2活性检测方法，省略了glo detection system试剂反应步骤和时间，更简单、方便、快速。
[0091]
以上内容是结合具体的实施方式对本技术所作的进一步详细说明，不能认定本技术的具体实施只局限于这些说明。对于本技术所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。