一种蜡样芽孢杆菌在防治和引诱橘小实蝇中的应用和橘小实蝇防治剂

1.本发明属于生物防治技术领域，具体涉及蜡样芽孢杆菌lrc38在防治和引诱橘小实蝇中的应用和橘小实蝇防治剂。


背景技术：

2.现有技术中报道的芽孢杆菌用于生物防治的内容较多，如球形芽孢杆菌对致倦库蚊的幼虫有明显的致死作用，对伊蚊毒性次之，其毒杀作用主要是由于在芽孢形成过程中产生的二元毒素蛋白决定的。再如球形芽孢杆菌可以作为蚊子的杀虫剂。又如蜂房芽孢杆菌对蜜蜂、蚊子幼虫是致命的。蜡样芽孢杆菌是鳞翅目和鞘翅目的致病菌。幼虫芽孢杆菌是蜜蜂等的病原菌。侧孢芽孢杆菌是双翅目和蛴螬的致病菌。森田芽孢杆菌和尘埃芽孢杆菌分别是蝇幼虫和烟草甲虫，果蝇等的致病菌。现有技术中报道的芽孢杆菌没有针对橘小实蝇进行生物防治的内容。
3.目前橘小实蝇的防治方法主要有物理防治方法和化学防治方法。物理防治方法可以采用引诱剂methyleugenol甲基丁香酚和诱捕器，但是这种物理防治方法诱捕时间长，费时费力。化学防治方法可以喷施80％灭蝇胺可湿性粉剂3000 倍液或5％高效氯氟氰菊酯微乳剂3000～4000倍液或2.5％高效氯氟氰菊酯水乳剂1500～2000倍液，化学防治方法喷施的药剂会对橘小实蝇寄生的果实产生污染。因此，急需加强对橘小实蝇的生物防治方法的研究。
4.现有技术研究表明昆虫肠道内细菌能够产生某类物质，该类物质能够吸引昆虫。drew(drew rai,courtice ac,teakle ds.bacterial as a natural source offood for adult fruit flies(dipetera:tephritidae)[j].oecologia,1983,60(3):279-284. 和lloyd(drew rai,lloyd ac.relationship of fruit flies(diptera:tephritidae)andthei rbacteri ato host plants[j].annals of the entomological society of america,1987, 80(5):629-636.)研究得出肠道细菌通过散发一定的气味引诱昆虫发挥类似性激素的作用。jang和nishijima(jang eb,nishijima ka.and attractancyof bacteria associated with dacus dorsalis(diptera:tephritidae).environ entomol, 1990,19:1726-1751.)从寄主植物上和橘小实蝇的肠中分离到了几种中肠属细菌 (enterobacteriaceae)，分别是阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)，六株成团肠杆菌(enterobacter agglomerans)，产酸克雷伯菌(klebsiella oxytoca)，弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)和栖冷克沃尔菌(kluyvera spp.)，同样发现它们对橘小实蝇成虫有好的引诱效果。mccollum等(maccollom gb,lauzoncr,weires jr rw,rutkowski aa.attraction of adult apple maggot(diptera: tephritidae)to microbial isolates.j econ entomol,1992,85:83-87.)报道了从草料实蝇(rhagoletis pornonella)肠道中分离出的成团肠杆菌(enterobacteragglomerans)对其寄主具有引作用。目前仍缺乏新的对橘小实蝇有引诱作用的产品。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的提供一种蜡样芽孢杆菌lrc38(bacillus cereus lrc38)在防治橘小实蝇中的应用，利用本发明提供的蜡样芽孢杆菌lrc38进行橘小实蝇成虫生物防治，方法简单、成本低、不会对果实产生污染。
[0006]
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
[0007]
本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌lrc38(bacillus cereus lrc38)在防治橘小实蝇中的应用。
[0008]
优选的，所述蜡样芽孢杆菌lrc38以蜡样芽孢杆菌lrc38菌液的形式提供；所述蜡样芽孢杆菌lrc38菌液由蜡样芽孢杆菌lrc38利用lb液体培养基进行培养获得。
[0009]
优选的，所述活化培养的温度优选为35～38℃，更优选为37℃；所述活化培养的转速优选为200～250rpm，更优选为220rpm；所述活化培养的时间优选为 20～26h，更优选24h。
[0010]
优选的，所述蜡样芽孢杆菌lrc38菌液优选为直接饲喂橘小实蝇，所述饲喂时蜡样芽孢杆菌lrc38菌液中的蜡样芽孢杆菌lrc38的浓度至少为 104cfu/ml。
[0011]
本发明提供了一种橘小实蝇防治剂，所述橘小实蝇防治剂的活性成分优选为蜡样芽孢杆菌lrc38，所述橘小实蝇防治剂中蜡样芽孢杆菌lrc38含量优选为≥104cfu/ml。
[0012]
优选的，所述橘小实蝇防治剂中蜡样芽孢杆菌lrc38含量≥104cfu/ml。
[0013]
本发明还提供了一种蜡样芽孢杆菌lrc38(bacillus cereus lrc38)在引诱橘小实蝇中的应用。
[0014]
优选的，所述蜡样芽孢杆菌lrc38的引诱成分通过顶空固相微萃取富集获得。
[0015]
优选的，所述蜡样芽孢杆菌lrc38的引诱成分包括2,4-二(1,1-二甲基)
‑ꢀ
苯酚、n
6-(4-甲氧基苯甲酰基)腺苷、乙酸、n'-[3-(1-羟基-1-苯乙基)苯基] 酰肼、甲氧基苯基丙酮肟、壬醛、2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基丙基)
‑ꢀ
苯酚、2,6,10-三甲基十四烷、十四烷、吲哚和n-苯甲酰基-l-酪氨酰二正丙胺。
[0016]
本发明的有益效果：本发明的目的提供一种蜡样芽孢杆菌lrc38在防治橘小实蝇中的应用。实施例结果表明：实施例1饲喂含有抗生素的蔗糖溶液及蜡样芽孢杆菌lrc38菌液处理下橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为(5.20
±
0.41)d；橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(5.85
±
0.42)d。实施例2饲喂蔗糖溶液及蜡样芽孢杆菌lrc38菌液的橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为(5.05
±
0.44)d，饲喂蔗糖溶液 蜡样芽孢杆菌lrc38的橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(5.40
±
0.48) d。对比例1只饲喂20％蔗糖溶液橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为s＝(7.45
±
0.70) d，橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为s＝(7.35
±
0.66)d。对比例2只饲喂加有抗生素的20％蔗糖溶液的橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为(7.45
±
0.70)d；橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(7.65
±
0.58)d。对比例3饲喂蔗糖溶液 肠杆菌科细菌处理下的橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为(13.75
±
0.62)d；橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(13.65
±
0.69)d。对比例4饲喂蔗糖溶液 抗生素 肠杆菌科细菌处理下橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为(12.40
±
0.64)d；橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(12.85
±
0.80)d。实施例结果还表明蜡样芽孢杆菌lrc38对橘小实蝇具有引诱作用。综上，本发明的蜡样芽孢杆菌lrc38菌株可以加快橘小实蝇死亡，明显缩短橘小实蝇寿命，且相比于现有技术中的物理和化学方式防治橘小实蝇方法简单、成本低、不会对橘小实蝇寄生果实产生污染，同时对橘小实蝇具
有引诱作用，为利用微生物防治橘小实蝇提供新思路。
具体实施方式
[0017]
本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌lrc38(bacillus cereus lrc38)在防治橘小实蝇中的应用。
[0018]
在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌lrc38优选以蜡样芽孢杆菌lrc38菌液的形式提供；所述蜡样芽孢杆菌lrc38菌液优选由蜡样芽孢杆菌lrc38利用lb 液体培养基进行培养获得。
[0019]
在本发明中，所述lb液体培养基的组分优选为每1000ml蒸馏水中含有 10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠和16g琼脂粉。在本发明中，所述lb液体培养基的ph值优选为7～8，进一步优选为7.1～7.6，更优选为7.2。
[0020]
在本发明中，所述培养的温度优选为35～38℃，更优选为37℃；所述培养的转速优选为200～250rpm，进一步优选为210～240rpm，更优选为220rpm；所述培养的时间优选为20～26h，进一步优选为21～25h，更优选24h。
[0021]
在本发明中，所述防治优选包括将蜡样芽孢杆菌lrc38菌液直接饲喂橘小实蝇，所述饲喂时蜡样芽孢杆菌lrc38菌液中的蜡样芽孢杆菌lrc38的浓度优选至少为104cfu/ml。在本发明中，所述饲喂时的饲喂量优选为每组橘小实蝇每天2～3ml。
[0022]
在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌lrc38菌液直接饲喂橘小实蝇之前，优选的饲喂橘小实蝇含有抗生素的无菌的蔗糖水溶液96h，所述抗生素优选为环丙沙星和哌拉西林。所述抗生素溶液中，环丙沙星的浓度优选为10mg/ml，哌拉西林的浓度优选为200mg/ml。在本发明中，所述蔗糖水溶液中，蔗糖的质量百分含量优选至少为20％。所述无菌的蔗糖水溶液优选采用过滤除菌的方式获得。本发明对所述蔗糖的来源没有特殊限定，采用常规市售的产品即可。本发明对所述抗生素的来源也没有特殊限定，采用常规市售的产品即可。
[0023]
在本发明中，饲喂橘小实蝇含有抗生素的无菌的蔗糖溶液96h是为了使饲喂的抗生素杀死橘小实蝇肠道的即定菌群，然后再通过饲喂所述蜡样芽孢杆菌 lrc38菌液验证对橘小实蝇寿命的影响。本发明蔗糖水溶液的作用是为了保证橘小实蝇的基本的营养，同时保证饲喂条件统一，后续实验数据的准确。
[0024]
本发明还提供了一种橘小实蝇防治剂，所述橘小实蝇防治剂的活性成分优选为蜡样芽孢杆菌lrc38，所述橘小实蝇防治剂中蜡样芽孢杆菌lrc38含量优选为≥104cfu/ml。
[0025]
本发明还提供了一种蜡样芽孢杆菌lrc38(bacillus cereus lrc38)在引诱橘小实蝇中的应用。
[0026]
在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌lrc38的引诱成分优选通过顶空固相微萃取富集获得。在本发明中，所述顶空固相微萃取的方法优选为在顶空瓶中加入 10ml细菌菌液，锡箔纸封口后，使100μmpdms萃取头40℃下萃取60min。在本发明中，所述pdms萃取头在应用之前优选进行无菌处理。
[0027]
在本发明中，气质联用技术的条件优选为色谱条件：hp-5ms(50m
×
0.2mm， 0.33μm)；载气：he；流量：1ml/min；进样口温度：210℃；采用程序升温：50℃，保持2min，以4℃/min升温至210℃，保持5min，不分流进样。质谱条件：电离方式：ei源，能量70ev；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；质量范围：35～550m/z；电子倍增器电压：
1200v。
[0028]
在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌lrc38的引诱成分优选包括2,4-二(1,1
‑ꢀ
二甲基)-苯酚、n
6-(4-甲氧基苯甲酰基)腺苷、乙酸，n'-[3-(1-羟基-1-苯乙基)苯基]酰肼、甲氧基苯基丙酮肟、壬醛、2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基丙基)-苯酚、2,6,10-三甲基十四烷、十四烷、吲哚和n-苯甲酰基-l-酪氨酰二正丙胺。
[0029]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的蜡样芽孢杆菌lrc38(bacillus cereus lrc38)在防治和引诱橘小实蝇中的应用和橘小实蝇防治剂进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0030]
实施例1
[0031]
(1)供试菌株
[0032]
本试验选用蜡样芽孢杆菌lrc38(bacillus cereus lrc38)(identification ofcultivable bacteria in the intestinal tract of bactrocera dorsalis from three differentpopulations and determination of their attractive potential.wang hongxiu；pestmanagement science,2014-01-24)。
[0033]
(2)应用的培养基
[0034]
lb液体培养基的组分为10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，16g琼脂粉和蒸馏水1000ml。
[0035]
(3)蜡样芽孢杆菌lrc38菌液制备
[0036]
蜡样芽孢杆菌lrc38菌株保存于-70℃冰箱中，实验时，接种于lb液体培养基中，于37℃，220rpm条件下活化培养24h获得蜡样芽孢杆菌lrc38菌液。
[0037]
(4)蜡样芽孢杆菌lrc38菌液饲喂橘小实蝇
[0038]
羽化后的橘小实蝇40只，40只橘小实蝇的雌雄性别比例为1:1。用含有抗生素(10mg/ml环丙沙星、200mg/ml哌拉西林)的无菌的蔗糖质量百分含量为20％的蔗糖水溶液(后文简称蔗糖溶液)喂养96h。96h后开始饲喂蜡样芽孢杆菌lrc38菌液。橘小实蝇饲养条件为光暗比(l:d)为16:8，饲养温度为25℃，饲养的湿度为60％rh，每个处理设3个重复。每组橘小实蝇每天饲喂的蔗糖溶液为5ml，每组橘小实蝇每天饲喂的蜡样芽孢杆菌lrc38菌液为5ml。
[0039]
饲喂的食物溶液盛在装有适量脱脂棉、直径为5cm的灭菌平皿里，每天更换一次饲喂液，直至饲喂的实蝇全部死亡为止。以上操作均在无菌的情况下进行，每天分别记录死亡的雌蝇数和死亡的雄蝇数。
[0040]
实施例2
[0041]
每组橘小实蝇只饲喂蔗糖溶液和蜡样芽孢杆菌lrc38，其他步骤同实施例 1。
[0042]
对比例1
[0043]
每组橘小实蝇只饲喂蔗糖溶液，其他步骤同实施例1。
[0044]
对比例2
[0045]
每组橘小实蝇只饲喂加有抗生素的蔗糖溶液，其他步骤同实施例1。
[0046]
对比例3
[0047]
每组橘小实蝇只饲喂蔗糖溶液和肠杆菌科细菌，肠杆菌科细菌为霍氏肠杆菌、阪岐肠杆菌、阿氏肠杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、弗氏柠檬
酸杆菌、分散泛菌的活化培养菌液混合物，其他步骤同实施例1。
[0048]
对比例4
[0049]
每组橘小实蝇只饲喂加有抗生素的蔗糖溶液和肠杆菌科细菌菌液，肠杆菌科细菌为霍氏肠杆菌、阪岐肠杆菌、阿氏肠杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、分散泛菌的活化培养菌液混合物，其他步骤同实施例1。
[0050]
应用例1
[0051]
对实施例1～2和对比例1～4的橘小实蝇的半数死亡时间，结果见表1。
[0052]
表1实施例1～2和对比例1～4的橘小实蝇的半数死亡时间
[0053][0054]
实施例1：饲喂含有抗生素的蔗糖溶液及蜡样芽孢杆菌lrc38菌液处理下橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为(5.20
±
0.41)d；橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(5.85
±
0.42)d。
[0055]
实施例2：饲喂蔗糖溶液及蜡样芽孢杆菌lrc38菌液的橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为(5.05
±
0.44)d，饲喂蔗糖溶液 蜡样芽孢杆菌lrc38的橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(5.40
±
0.48)d。
[0056]
对比例1：只饲喂20％蔗糖溶液雌虫的半数死亡时间为s＝(7.45
±
0.70)d，雄虫的半数死亡时间为s＝(7.35
±
0.66)d。
[0057]
对比例2：只饲喂加有抗生素的20％蔗糖溶液的雌虫的半数死亡时间为 (7.45
±
0.70)d；雄虫的半数死亡时间为(7.65
±
0.58)d。
[0058]
对比例3：饲喂蔗糖溶液 肠杆菌科细菌处理下的橘小实蝇雌虫的半数死亡时间为(13.75
±
0.62)d；橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(13.65
±
0.69)d。
[0059]
对比例4：饲喂蔗糖溶液 抗生素 肠杆菌科细菌处理下雌虫的半数死亡时间为(12.40
±
0.64)d；橘小实蝇雄虫的半数死亡时间为(12.85
±
0.80)d。
[0060]
综上可知，蔗糖溶液和抗生素对橘小实蝇的寿命无不利影响，饲喂蜡样芽孢杆菌lrc38菌液的橘小实蝇死亡显著加快且寿命明显缩短，饲喂肠杆菌科细菌菌液的橘小实蝇死亡时间平缓，实蝇寿命更长。本发明的蜡样芽孢杆菌lrc38 (bacillus cereus lrc38)可用于橘小实蝇的防治，且相比于现有技术中的物理和化学方式防治橘小实蝇方法简单、成本低、不会对橘小实蝇寄生果实产生污染。
[0061]
实施例3
[0062]
通过固相微萃取的方法富集实施例1中获得的蜡样芽孢杆菌lrc38菌液的挥发化学物质，以及气相色谱-质谱联用仪gc-ms测定挥发性化学物质的吸收峰，通过分析软件分析对应化学物质。
[0063]
顶空固相微萃取(spme)：将蜡样芽孢杆菌lrc38菌液10ml倒入顶空瓶中，占顶空瓶体积75％，用锡箔纸封口，将萃取头刺破锡箔纸，插入萃取瓶中，使100μmpdms萃取头暴露在样品上层空气中，40℃下萃取60min。萃取挥发成分前，pdms萃取头应当在气相色谱进样口(250℃)热解析5min，进行无菌处理。
[0064]
gc-ms分析：
[0065]
a.色谱条件：hp-5ms(50m
×
0.2mm，0.33μm)；载气：he；流量：1ml/min；进样口温度：210℃；采用程序升温：50℃，保持2min，以4℃/min升温至210℃，保持5min，不分流进样。
[0066]
b.质谱条件：电离方式：ei源，能量70ev；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；质量范围：35～550m/z；电子倍增器电压： 1200v。
[0067]
结果见表2。
[0068]
表2蜡样芽孢杆菌lrc38菌液挥发成分分析
[0069][0070]
根据表2的结果可知，蜡样芽孢杆菌lrc38菌液的挥发性成分分析得出共有10种物质，酚类占35.34％，醛类占3.75％，主要包括2,4-二(1,1-二甲基)
‑ꢀ
苯酚、n
6-(4-甲氧基苯甲酰基)腺苷、乙酸，n'-[3-(1-羟基-1-苯乙基)苯基] 酰肼、甲氧基苯基丙酮肟、壬醛、2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基丙基)
‑ꢀ
苯酚、2,6,10-三甲基十四烷、十四烷、吲哚、n-苯甲酰基-l-酪氨酰二正丙胺。 2,4-二(1,1-二甲基)-苯酚含量占32.87％，推测上述物质对引诱橘小实蝇起到重要作用。
[0071]
综上所述，蜡样芽孢杆菌lrc38对橘小实蝇有引诱作用，可制备橘小实蝇引诱剂，最终为利用微生物防治橘小实蝇提供新思路。
[0072]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。