一种通过光交联短肽定向固定化酶的方法

1.本技术属于酶工程领域，具体设计一种通过光交联短肽定向固定化酶的方法


背景技术：

2.酶是一种具有高催化效率和特异性的生物催化剂，但游离酶的低稳定性和难以回收再利用等缺点限制了其工业应用。固定化酶已被用来克服上述游离酶的缺点，但随机固定化会遮盖酶活性位点，造成酶活力的急剧下降。而定向固定化酶技术因避开酶活性位点结合于载体表面而受到广泛的关注。采用定向固定化的方法固定化酶，可使酶特定位点直接或间接与载体结合，酶活性位点位于载体外侧，天然构象基本保持不变，有利于底物进入到酶活性位点，定向固定化可以使蛋白质在载体表面的取向和构象达到统一，有利于保护酶的催化功能。近年来，定向固定化酶技术在酶工程中发挥着巨大作用，在保留酶活力，改善酶的稳定性及重复使用性等方面取得了非常有益的效果。
3.光作为一种新型的引导交联反应的工具，其触发的交联反应在非物理接触下可精准控制，提供了较高的时间和空间分辨率，优化了交联反应的体系。光敏分子被分为三大类化合物：二苯甲酮类、二氮嗪类和芳香叠氮化合物。在特定波长的光照下能发生结构的变化，从而引导交联反应。波长为365nm的紫外光便能触发二苯甲酮类的光交联反应。在紫外光照射下，结构中的“酮羰基”经历n到π*的转变形成二自由基，此状态可以从附近活化的“碳氢键”中吸收氢原子并重组形成共价复合物，完成交联反应。光交联反应具有高效、无毒和普适性强的优点，作为一种快速、简单和时空可控的交联方法已广泛地应用于化学、生物、医学和材料等不同研究领域。


技术实现要素：

4.为克服现在酶固定化方法中存在的缺陷，本发明提供了一种通过光交联短肽定向固定化酶的方法，根据酶的结构计算模拟设计出与之亲和的光交联短肽，光交联短肽在紫外光照下实现酶的定向固定化。该方法包括以下步骤：
5.(1)远离酶的活性位点进行光交联短肽的设计；
6.(2)将设计好的光交联短肽连接在载体上；
7.(3)酶溶液与(2)中得到的载体混合进行吸附反应；
8.(4)将(3)中得到的混合物进行紫外光照处理，产物经沉淀，洗涤后得到光交联定向固定化酶。
9.进一步地，步骤(1)中所选择的酶分子，包括却不限于蔗糖异构酶。作为优选，蔗糖异构酶来源于pantoea dispersa uq68j。
10.进一步地，步骤(1)中所选择的模拟软件，包括单不限于gromacs。作为优选，通过软件gromacs和pocasa程序，避开蔗糖异构酶的活性中心，选择出蔗糖异构酶的目标固定区域。
11.进一步地，步骤(1)中选择auto dock与moe软件设计与蔗糖异构酶目标固定区域
具有高亲和力的短肽。作为优选，短肽序列为h2n-vniggx-cooh，x为光敏性二苯甲酮类非天然氨基酸，包括但不限于4-l-苯甲酰基苯丙氨酸。
12.进一步地，步骤(2)中所述载体为表面带有环氧基团的材料，包括但不限于环氧树脂。作为优选，环氧树脂载体的材料为聚丙烯酸甲酯，粒径为0.2-200μm。
13.进一步地，步骤(2)中的连接反应包括：将0.5～5mg的短肽溶解于磷酸盐缓冲溶液中，缓冲液浓度为10～100mm，ph为7.5～10.0；短肽溶液与环氧树脂在管中混合，树脂表面环氧基团与短肽的摩尔质量比为5～50。作为优选，混合后的反应时间为10-20h，反应温度为20～30℃。连接反应完成后收集得到经短肽修饰的载体。
14.进一步地，步骤(3)中吸附反应的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，浓度为10～100mm，ph为5.0～6.5。作为优选，酶溶液初始浓度为0.5～10mg/ml，载体的质量为5～20mg，吸附反应时间为2～10h。
15.进一步地，步骤(4)中紫外光照的波长为350～365nm，功率为25w～120w，照射时间为1～30min。反应结束后，收集固定化酶并洗涤，得到光交联定向固定化酶。
16.本发明的方法具有下列优点和积极效果：
17.1)可定向控制固定化酶在载体表面的方向
18.2)固定化酶能保留相比于游离酶的高酶活力
19.3)固定化酶的热稳定性有极大的提高
20.4)固定化酶的重复使用性能高
21.5)固定化工艺流程简单易操作，环保高效。
附图说明
22.图1为载体连接光交联短肽的hplc分析；
23.图2为本发明的光交联反应示意图；
24.图3为固定化酶的ftir检测光谱；
25.图4为固定化酶的热稳定性；
26.图5固定化酶的重复使用性。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明做详细说明，但并不构成对本发明的限制。
28.实施例1：蔗糖异构酶(si)的目标固定区域的选择及光交联短肽的设计
29.蔗糖异构酶的三维结构从protein data bank(pdb)(https：//www.rcsb.org/)数据库中获得，pdb id为4g18。使用pocasa程序搜索蛋白质表面的空洞和口袋，考虑到短肽结合位点应该远离活性中心并具有正确的空间位置，由残基r339-g359及残基p456-l557形成的区域被选为亲和短肽配基的目标结合区域。使用auto dock与moe软件设计与蔗糖异构酶具有高亲和力的短肽。应用auto dock软件将20个常见氨基酸与蔗糖异构酶目标结合区域进行对接操作。格点间距被设为同时格点中心为x＝-37.788，y＝46.928，z＝45.369。格点参数设为对接所得构象数目为300。随后，以蔗糖异构酶整个蛋白结构为目标区域，使用moe软件进行备选亲和短肽配基的对接筛选。最终得到合适的光交联短肽vniggx(vg)。
30.实施例2：环氧树脂表面修饰光交联短肽
31.将2mg的短肽溶解于2ml磷酸盐缓冲溶液(ph 8.0，10mm)中，随后与10mg环氧树脂(ep)在管中混合(ep表面环氧基团与vg的摩尔质量比为10)。混合物在25℃的水浴恒温振荡器中连续反应12h，避光处理。反应完成后静置使载体沉淀分离，并用缓冲溶液反复洗涤3次，收集沉淀得到经vg修饰的载体。随后利用盐酸溶液(1m)对上述载体和ep的表面剩余环氧基进行开环处理，得到ep-vg和ep*。采用高效液相色谱法(hplc)检测环氧树脂表面修饰的vg含量。结果见图1。从hplc分析可以得出，ep表面成功修饰光交联短肽。vg的连接率达到80
±
5％，连接量为0.14
±
0.02mmol/g。
32.实施例3：光交联定向固定化酶的制备
33.将si溶解于磷酸盐缓冲溶液(ph 6.0，10mm)中，配制成5mg/ml初始酶溶液。分别取10mg的ep-vg(2份)、ep*分散于5ml酶溶液中，在0℃、70rpm条件下振荡吸附反应10h，分别得到非定向吸附固定酶(ep*-si)和定向吸附固定酶(ep-vg-si)。随后将其中一份ep-vg-si在波长365nm、功率120w的紫外光条件下照射3min，得到定向光交联固定化酶(ep-vg-si hv)。光交联示意图见图2。反应结束后，收集固定化酶并用缓冲液反复洗涤3次，于4℃保存待用。使用傅立叶变换红外光谱(ftir)检测载体和固定化酶的表面化学结构的变化。将冷冻干燥的样品与溴化钾粉末混合研磨，进行压片处理后，利用ftir进行测定，扫描范围为4000-400cm-1
。结果见图3。vg的特征峰为3060cm-1
、1670cm-1
和1545cm-1
。由图3可知vg连接在ep表面后其-c＝o吸收峰从1670cm-1
蓝移到1722cm-1
。光交联定向固定化酶ep-vg-si hv的-c＝o吸收峰峰值降低，且其1670cm-1
处峰值也随之降低，表明-c＝o与c-h在光照后发生反应而减少，vg与si光交联成功使得si固定于载体表面。
34.实施例4：固定化酶的热稳定性及重复使用性测试
35.将游离酶与固定化酶样品置于45℃水浴锅中，在70rpm条件下分别热处理不同的时间(0h，2h，4h，6h，8h)，按照3，5-二硝基水杨酸法(dinitrosalicylic acid，dns)测定反应后样品异麦芽酮糖的含量并计算样品不同热处理时间后的残余酶活力。以0h的催化活性为100％，以计算剩余酶活性的百分比。结果见图4，固定化酶活力的降幅明显小于游离酶，在温育2h后ep-vg-si hv的酶活力在90％以上，且温育4h后能保持40％的初始活性。表明相较于游离酶，该定向固定化技术可以提高酶的抗热应力破坏性。
36.采用循环测定酶活力的方法研究固定化酶的重复使用性。将固定化酶分散于0.1ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(ph 6.0，10mm)制得固定化酶溶液，在恒温水浴振荡器中于35℃和70rpm的条件下催化蔗糖的异构化持续反应10min。反应完成后静置使其沉淀，取出全部上清液并立即检测其酶活性。而静置得到的固定化酶(沉淀物)用缓冲溶液反复清洗，以除去未反应的底物和产物。将洗涤后的固定化酶重新分散于0.1ml缓冲溶液中，加入底物进行下一次的催化反应。将上述操作重复11次，连续检测固定化酶在循环多次后的残余酶活力。结果见图5，重复利用11次后，ep-vg-si hv的催化活性仍保持在50％以上，远高于ep-vg-si(40％)和ep-si(30％)。表明发明中光交联短肽的定向吸附作用较好的保留了酶的活性，且进行紫外光辐照后，酶与载体的光交联共价结合提高了ep-vg-si hv的重复使用性。
37.综上所述，本发明结合分子对接和分子动力学模拟理性设计了与远离酶活性区域有较高亲和性的光交联短肽，采用紫外光照的方法使酶以共价键的形式牢固结合在载体表
面，在保留酶活力的情况下，实现了酶制剂的分离和回收以及热稳定性的提高，延长了酶制剂的使用寿命，其良好的重复使用性和稳定性在应用中可以显著降低酶的成本，在生产操作上具有较高的工业价值。本发明的固定化工艺流程简单高效，反应条件易于操作控制，且不添加化学交联剂，对环境友好。因此该技术适合应用于工业化生产。