布林西多福韦在制备抗伪狂犬病毒药物中的应用

1.本公开属于生物制药技术领域，特别涉及一种布林西多福韦在制备抗伪狂犬病毒药物中的应用。


背景技术：

2.猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)引起猪的繁殖障碍、共济失调、呼吸困难等症状的一类高接触性传染病，是生猪养殖业最重要的病毒性疾病之一。所有年龄段的猪群均易感，且成年猪多隐性感染。该病死亡率高、传播速度快。根据相关报道，2017年至今，中国共有23例经mngs确诊的感染prv的病例，其中4例死亡，死亡率为17.4％。2例植物人状态、2例呼吸机维持最低生命体征、3例昏迷状态、6例失明、6例生活仅能自理。这表明猪伪狂犬病能够传染人类，且感染后大多数患者预后较差，幸存者留下了严重的残疾和生活能力障碍。
3.相关技术中，针对伪狂犬病毒没有特效药，只能通过疫苗对猪进行预防，一旦伪狂犬病毒在猪场开始流行，将会对猪养殖业造成重大经济损害，同时也会对人类进行感染。而现有疫苗只对猪感染有预防作用，对人类等并没有预防作用，所以，开发针对该病的有效药物迫切而急需。


技术实现要素：

4.本公开实施例提供了一种布林西多福韦在制备抗伪狂犬病毒药物中的应用，可以以布林西多福韦作为治疗抗伪狂犬病毒的药物来治疗抗伪狂犬病毒。
5.所述技术方案如下：
6.本公开实施例提供了一种布林西多福韦在制备抗伪狂犬病毒药物中的应用。
7.在本公开的又一种实现方式中，所述抗伪狂犬病毒药物用于治疗与伪狂犬病毒感染相关的脑炎、视网膜炎或眼内炎中的至少一种。
8.在本公开的又一种实现方式中，还提供一种抗伪狂犬病毒的药物，所述药物包括作为有效成分的布林西多福韦。
9.在本公开的又一种实现方式中，还提供一种抗伪狂犬病毒的药物，所述药物还包括作为有效成分的布林西多福韦的立体异构体或者布林西多福韦的溶剂合物。
10.在本公开的又一种实现方式中，所述药物还包括布林西多福韦的药学上可接受的盐或布林西多福韦的药学上可接受的盐的溶剂合物。
11.在本公开的又一种实现方式中，所述药物的剂型为药学上可接受的任意一种剂型。
12.在本公开的又一种实现方式中，所述药物的剂型包括口服制剂、喷雾制剂、注射制剂中的至少一种。
13.在本公开的又一种实现方式中，所述药物用于治疗与伪狂犬病毒感染相关的脑炎、视网膜炎或眼内炎中的至少一种。
14.在本公开的又一种实现方式中，还提供一种以布林西多福韦制备的抗伪狂犬病毒药物的使用方法，所述使用方法包括：
15.将所述以布林西多福韦制备的抗伪狂犬病毒药物施加给给药对象；
16.所述布林西多福韦在所述抗伪狂犬病毒药物中含量与所述给药对象的体重比为10mg/kg。
17.在本公开的又一种实现方式中，还提供一种人体或者动物体感染伪狂犬病毒的治疗方法，所述治疗方法包括向感染伪狂犬病毒的感染者施用以上所述的药物。
18.本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
19.由于布林西多福韦能够应用于治疗抗伪狂犬病毒，所以，当人体感染伪狂犬病毒后，可以通过布林西多福韦对病毒进行抑制，以便对伪狂犬病毒的相关病症进行治疗。
附图说明
20.为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为布林西多福韦抗prv可视化效果图；
22.图2为布林西多福韦对prv病毒滴度示意图；
23.图3为布林西多福韦对prv病毒拷贝数的示意图；
24.图4为布林西多福韦药物评价cc50的示意图；
25.图5为布林西多福韦药物评价ic50的示意图；
26.图6为布林西多福韦治疗小鼠体重指示意图；
27.图7为布林西多福韦治疗小鼠实验生存曲线；
28.图8为布林西多福韦治疗小鼠组织病毒载量示意图；
29.图9为布林西多福韦治疗小鼠病理损伤示意图。
具体实施方式
30.为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。
31.本公开实施例提供了一种布林西多福韦在制备抗伪狂犬病毒药物中的应用。
32.由于布林西多福韦能够应用于治疗抗伪狂犬病毒，所以，当人体感染伪狂犬病毒后，可以通过布林西多福韦对病毒进行抑制，以便对伪狂犬病毒的相关病症进行治疗。
33.可选地，布林西多福韦的结构如下：
[0034][0035]
以上采用的布林西多福韦由军事医学科学院毒物药物研究所提供。
[0036]
布林西多福韦(brincidofovir)是具有抗双链dna(dsdna)病毒活性的广谱抗病毒药物，是一种核苷酸类似物，口服有效，为西多福韦磷酯化的前药。目前，该药物正在进行dna病毒(包括巨细胞病毒、腺病毒、单纯疱疹毒、痘苗病毒、天花或猴痘病毒)感染重症疾病和条件感染患者治疗及无症状腺病毒血症造血干细胞移植患者预防性治疗的ii/iii期临床试验，并已被美国fda批准通过治疗天花病毒可使用药物。布林西多福韦在治疗人感染prv(伪狂犬病毒)的抗病毒治疗方面同样具有广泛的前景。
[0037]
可选地，抗伪狂犬病毒药物还用于治疗与伪狂犬病毒感染相关的脑炎、视网膜炎或眼内炎中的至少一种。
[0038]
人体一旦感染伪狂犬病毒后，在临床上极易引起脑炎、视网膜炎或眼内炎，所以，抗伪狂犬病毒药物也能够用于治疗人类临床上与伪狂犬病毒感染相关的脑炎、视网膜炎或眼内炎中的至少一种。
[0039]
本实施例中，布林西多福韦也用于治疗其他动物体的伪狂犬病，比如，也可以为牛、猪、羊、犬、猫等动物的伪狂犬病。
[0040]
另一方面，本公开实施例还提供一种抗伪狂犬病毒的药物，药物包括作为有效成分的布林西多福韦。
[0041]
以上药物可以有效治疗伪狂犬病毒。
[0042]
可选地，药物还包括作为有效成分的布林西多福韦的立体异构体或者布林西多福韦的溶剂合物。
[0043]
可选地，药物还包括布林西多福韦的药学上可接受的盐或布林西多福韦的药学上可接受的盐的溶剂合物。
[0044]
药物包括以上物质，能够使得该药物施加在给药对象时，快速被给药对象吸收，以便有效地抑制伪狂犬病毒的扩散。
[0045]
可选地，药物的剂型为药学上可接受的任意一种剂型。
[0046]
将药物作为多种剂型，可以增大药物的使用范围，便于药物能够以不同形式进入到给药对象内，进而方便药物的服用。
[0047]
比如，药物的剂型包括口服制剂、喷雾制剂、注射制剂中的至少一种。
[0048]
可选地，药物用于治疗与伪狂犬病毒感染相关的脑炎、视网膜炎或眼内炎中的一种。
[0049]
本公开实施例还提供一种以布林西多福韦制备的抗伪狂犬病毒药物的使用方法，使用方法包括：
[0050]
将以布林西多福韦制备的抗伪狂犬病毒药物施加给给药对象，其中，布林西多福
韦在抗伪狂犬病毒药物中含量与给药对象的体重比为10mg/kg。
[0051]
通过将布林西多福韦按照上述比例来施加在给药对象时，可以有效的抑制伪狂犬病毒的生长，进而有效治疗伪狂犬病。
[0052]
再一方面，本公开实施例还提供一种人体或者动物体感染伪狂犬病毒的治疗方法，治疗方法包括向感染伪狂犬病毒的感染者施用以上药物。
[0053]
另外，为了清楚说明本公开实施例提供的布林西多福韦在制备抗伪狂犬病毒药物中的应用，现依据以下试验内容来进一步说明。
[0054]
再此，先对有关的名词进行解释。
[0055]
半数组织感染量(tcid50)是指病毒感染动物或细胞后，引起50％的动物或细胞发生死亡或病变的最高病毒稀释度。
[0056]
病毒滴度即病毒的毒力，或毒价。衡量病毒滴度的单位有最小致死量(mld)、最小感染量(mid)和半数致死量(ld50)，其中以ld50最常用。半数致死量是指在一定时间内能使半数试验动物致死的病毒量。
[0057]
细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
[0058]
第一方面，布林西多福韦作为抗伪狂犬病毒(prv)药物的筛选。
[0059]
首先，构建prv抗病毒药物高通量筛选模型筛选出对prv抑制作用较好的布林西多福韦。
[0060]
其中筛选条件为：96孔细胞板制备单层pk-15细胞，病毒0.01moi，药物使用浓度10μm，培养36h后。多功能酶标仪测定荧光值并计算抑制率。
[0061]
抑制率越大则表明待筛选药物抗prv作用越强，对比对照组和实验组的抑制率，确定筛选药物对prv的抑制作用。从大量药物中筛选出对prv增殖抑制作用较好的布林西多福韦。
[0062]
接着，布林西多福韦作用感染有prv毒株的细胞(其中该毒株预先设有荧光标记)，感染细胞为0.01moi(感染复数，感染时病毒与细胞数量的比值)，布林西多福韦的浓度为10μm，培养36h后，荧光显微镜拍照。
[0063]
prv毒株为伪狂犬病毒hsd-1/2019毒株，由华中农业大学提供。prv毒株附有荧光标记，当细胞感染prv毒株后，可以通过荧光来进行确认。细胞为pk-15细胞。
[0064]
本实施例中，采用的细胞生长培养液组成为：89％的dmem培养基、10％的胎牛血清和1％的双抗于无菌环境中配置，存于4℃冰箱中。
[0065]
采用的细胞维持培养液组成为：96％的dmem培养基、3％的胎牛血清和1％的双抗，配置后过滤除菌，存于4℃冰箱中。
[0066]
以上prv稀释液根据病毒原液的半数组织感染量(tcid50)及实验具体要求使用细胞维持培养液进行稀释。
[0067]
通过荧光显微镜拍照，可视化确认布林西多福韦对prv的抑制作用。
[0068]
图1为布林西多福韦抗prv可视化效果图，结合图1，图1中左侧图为上述布林西多福韦作用于感染prv后的pk-15细胞，可以看到pk-15细胞的荧光标记大大减小。图1中中间图为感染prv后pk-15细胞(空白组，未添加布林西多福韦)，从此图可以看到，pk-15细胞在增值时，荧光标记也大大增多，说明病毒数也在跟随增加。图1中右侧图为pk-15细胞未感染
prv，且同时添加布林西多福韦，从此图可以看到的，pk-15细胞在增值时，并未有荧光出现。由此可以说明，布林西多福韦能较好的抑制prv毒株hsd-1/2019毒的增值。而对比的两个实验组中，基本观察不到荧光。
[0069]
然后，测定布林西多福韦作用prv毒株后的半数组织感染量(tcid50)。
[0070]
布林西多福韦作用prv毒株，病毒0.01moi，药物使用浓度10μm，培养36h后放入-80℃冰箱冻融3次，收集病毒液。96孔微量培养板中每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2～3
×
105个/ml。根据预估毒价，在病毒管中用维持液将prv毒株hsd-1/2019作连续10倍倍比稀释，从10-5
～10-8
，每个稀释度接种一纵列共8孔，每孔100μl。设置两纵排的正常细胞对照(100μl维持液 100μl细胞悬液)；逐日观察并记录结果(待5-7天之后)，用karber法计算tcid50。
[0071]
结合图2，图2中横坐标表示布林西多福韦作用pk-15细胞前后时细胞的感染病毒的数目。黑色柱状图代表布林西多福韦作用pk-15细胞前的感染病毒的细胞数目，灰色柱状图代表布林西多福韦作用pk-15细胞后的感染病毒的细胞数目。纵坐标为病毒滴度，以lg(tcid50/0.1)表示。根据对比可以看到，布林西多福韦用药组prv病毒滴度由10
6.12
下降至10
1.85
，可说明布林西多福韦对prv毒株hsd-1/2019增值有较好抑制作用
[0072]
再接着，测定布林西多福韦作用prv毒株hsd-1/2019后的病毒拷贝数。
[0073]
将pk-15细胞接种于细胞六孔培养板中，加入细胞生长培养液，待细胞长至70-80％使用。
[0074]
分组方式为布林西多福韦用药组、病毒对照组和空白对照组。将感染复数0.01moi的病毒液接种于细胞六孔培养板中，于37℃中吸附1h，然后移除病毒稀释液，用pbs清洗2-3次，于37℃，5％co2中培养36h。将上述细胞培养板从培养箱中取出，pbs清洗3次，-80℃冰箱冻融3次，收集病毒液提取dna，利用taqman探针荧光定量方法检测各样品的ct值，并计算病毒拷贝数。
[0075]
本发明实施例中fq-pcr所使用的探针(探针5’带有一个荧光基团，3’带有一个荧光淬灭基团)，引物如表1所示。
[0076]
表1 fq-pcr所使用的引物及探针序列
[0077][0078]
图3为布林西多福韦对prv病毒拷贝数的示意图，结合图3，图3中横坐标分别为表示布林西多福韦作用pk-15细胞前后时细胞的感染病毒的数目。左侧柱状图代表pk-15细胞的感染病毒的细胞数目，右侧柱状图代表经过布林西多福韦作用后的pk-15细胞的感染病毒的细胞数目。纵坐标为病毒拷贝数。结果表明，布林西多福韦具有良好的抑制prv增殖活性，病毒基因组拷贝数降低了超过250倍。
[0079]
第二方面，布林西多福韦在体外对伪狂犬病毒的抗病毒作用。
[0080]
首先，采用cck-8方法进行布林西多福韦对pk-15细胞毒性cc50测定。以含3％fbs
的细胞维持液作为溶剂，将布林西多福韦进行稀释，得到浓度为5μm、10μm、20μm、40μm、80μm共计5个浓度的布林西多福韦稀释液。
[0081]
待pk-15细胞长至70-80％时，按不同浓度加入细胞孔，每组设置3个重复孔。
[0082]
36h后加入10％cck-8，作用1h后于450nm处检测其吸光度值。按照测定的吸光度值计算抑制率。
[0083]
抑制率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]
×
100％。
[0084]
用graghpad8.0软件的非线性回归分析计算药物cc50值。通过计算得出布林西多福韦的cc50值为22.32μm，说明在本实验中使用的10μm的布林西多福韦为安全剂量，对pk-15细胞毒性较小(可参见图4)。
[0085]
图4中横坐标为布林西多福韦的浓度，纵坐标为细胞活性，图4中可以看到，随着药物浓度的增加，细胞活性逐渐减小。结合上述计算布林西多福韦的cc50值为22.32μm，可以知道10μm小于22.32μm为安全剂量。
[0086]
接着，测定布林西多福韦对prv的半数抑制浓度(ic50)。
[0087]
以含3％fbs的细胞维持液作为溶剂，将布林西多福韦进行稀释，得到浓度为0.16μm、0.32μm、0.63μm、1.25μm、2.5μm共计5个浓度的布林西多福韦稀释液。
[0088]
待pk-15细胞长至70-80％时，按不同浓度加入细胞孔，每组设置3个重复孔，同时加入病毒滴度为0.01moi prv毒株。待细胞完全病变后再等待4h，加入10％cck-8，作用1h后于450nm处检测其吸光度值。
[0089]
按照测定的吸光度值计算抑制率。抑制率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]
×
100％。用graghpad8.0软件的非线性回归分析计算药物ic50值。
[0090]
通过计算得出布林西多福韦的ic50值为0.5739μm，(参见图5)。图5中横坐标为布林西多福韦的浓度，纵坐标为prv的抑制率，当纵坐标的抑制率为50％时，可以知道布林西多福韦远远小于1μm，即布林西多福韦在较低的浓度即能对prv的增殖较好的抑制作。
[0091]
本实施例中，还通过药物选择指数si对布林西多福韦进行评价，药物选择指数可以评价布林西多福韦对prv的抑制效果是否安全。
[0092]
可以通过计算公式计算药物选择指数si，si＝cc50/ic50。
[0093]
布林西多福韦的药物选择指数为41.0370，较高的药物选择指数说明药物较为安全。即以布林西多福韦制备抗伪狂犬病毒的药物非常安全。
[0094]
第三方面，布林西多福韦在体内对伪狂犬病毒的抗病毒作用。
[0095]
首先，对prv毒株进行扩增。
[0096]
扩增方法如下：培养pk-15细胞，80％～90％铺满细胞单层时，dmem洗涤细胞，接种0.1moi滴度的prv毒株hsd-1/2019，37℃孵育1h，弃去病毒液，加入含2％fbs的细胞培养液，37℃，5％co2培养，待细胞病变达到80％～90％时，收取细胞，-80℃反复冻融3次，4℃，8000rpm，离心5min，取上清，并将上清液于-80℃冻存。
[0097]
接着，对扩增后prv毒株的病毒滴度进行测定。
[0098]
方法如下：将pk-15铺于96孔板中，待细胞融合度达到80～90％，使用dmem洗涤细胞，将prv进行10倍倍比稀释(10-1-10-9
)，并接种细胞，100μl/孔，每个稀释度重复3孔。37℃，5％co2培养5-7d，每天观察细胞病变(cpe)，记录细胞病变，运用reed-muench统计法计算病毒的tcid50。
[0099]
然后，通过测定prv毒株hsd-1/2019对小鼠的半数致死量(ld50)来确定攻毒剂量。
[0100]
例如，采取40只balb/c小鼠被随机分为5组，每组8只小鼠，每组小鼠分别注射104tcid50、103tcid50、102tcid50、101tcid50和0tcid50的prv毒株hsd-1/2019。
[0101]
每天记录每组小鼠的死亡情况，两周后利用reed-muench统计学方法得出prv毒株hsd-1/2019的ld50为101.88，以6.5ld50为攻毒剂量。
[0102]
通过小鼠攻毒保护实验研究布林西多福韦在体内对伪狂犬病毒的抗病毒作用。
[0103]
本实验以balb/c小鼠为研究对象，分离感染人的prv毒株hsd-1/2019经感染小鼠建立动物模型进行攻毒保护试验。
[0104]
将20只6周龄balb/c小鼠(体重17g
±
2g，雌性)随机分为4组，分别为布林西多福韦治疗组、阿昔洛韦治疗组、病毒对照组和空白对照组。除空白组小鼠以外，各组小鼠通过注射0.1ml的500tcid50的prv。
[0105]
使用布林西多福韦和阿昔洛韦10mg/kg/d剂量，治疗5天。空白组给予同体积的生理盐水。实验期间记录死亡时间、死亡率、临床症状、病毒载量和组织病理损伤。死亡率和临床症状结果表明，空白组小鼠全部正常，无临床症状和死亡出现。
[0106]
图6为布林西多福韦治疗小鼠体重指示意图，参见图6，图6中横坐标为病毒感染天数，纵坐标为各组对应的小鼠的体重，结合图6，可以看到病毒对照组小鼠在攻毒后第3天开始出现搔痒症状，陆续有小鼠死亡，第7天该组小鼠全部死亡(可参见图7中曲线b)。阿昔洛韦治疗组第6天出现临床症状，第8天全部死亡。布林西多福韦治疗组小鼠第5天部分出现轻微搔痒症状，第7天症状消失，至14天实验期结束，布林西多福韦治疗组所有小鼠全部存活(可参见图7中曲线a)。
[0107]
接着，对小鼠组织脏器病毒载量测定。每组小鼠濒临死亡时处死，采集病毒载量较高的组织的脑和肺，检测组织脏器中病毒载量。
[0108]
根据绝对荧光定量的测试结果表明，布林西多福韦治疗组中的病毒载量明显比病毒对照组的低。阿昔洛韦治疗组的病毒载量与病毒对照组无显著差异；其中空白对照组的组织中未检测到病毒载量。
[0109]
图8为布林西多福韦治疗小鼠组织病毒载量示意图，参见图8，图8中纵坐标为病毒拷贝数，左侧柱状图为病毒对照组小鼠中的脑组织的病毒载量，右侧柱状图的病毒对照组小鼠中的肺组织的病毒载量，可见肺组织的病毒载量大于脑组织的病毒载量。
[0110]
对小鼠组织进行病理切片实验。
[0111]
小鼠解剖后，用剪刀取下脏器病变部位。将组织块放于4％甲醛中固定24h以上；将固定好的脏器，用刀片修整为约6mm
×
6mm
×
1mm的切面整齐的小块，并将其放入新的4％甲醛里，再次固定。依次进行冲水、脱水、透明及浸蜡、包埋、切片、展片及粘片、烤片等步骤；最后进行he染色、封片和使用光学显微镜观察切片，并进行拍照。
[0112]
图9为布林西多福韦治疗小鼠病理损伤示意图，参见图9，图9中左侧为病毒对照组中的小鼠的病理损伤，中间为布林西多福韦治疗组中的小鼠的病理损伤，右侧为阿昔洛韦治疗组中的小鼠的病理损伤。结果显示布林西多福韦治疗组中小鼠的肺和脑的组织完整性均好于未给药组。
[0113]
上述试验表明，布林西多福韦能抑制感染人的prv毒株hsd-1/2019在balb/c小鼠体内的增殖。
[0114]
以上所述仅为本公开的可选实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。