氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物及其脂质体

1.本发明涉及一种氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物，以及包埋该复配物的脂质体，以及其在骨关节炎的预防与治疗中的应用，属于医药制剂技术领域。


背景技术：

2.骨性关节炎(osteoarthritis，oa)是一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、畸形等。本病多见于中老年人群，好发于负重关节及活动量较多的关节。过度负重或使用这些关节，均可促进退行性变化的发生。最终导致关节畸形，严重影响患者生活质量。
3.现有技术中治疗关节炎的药物有氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐等。氨基葡萄糖硫酸盐与金属离子形成的螯合盐性质更加稳定，具有抗炎、缓解疼痛肿胀、提高关节功能等作用。
4.在目前的oa治疗方法中，局部关节内给药比口服给药更有效，因为其降低了全身毒性。但通过关节内注射给药药物停留时间短，以致关节内浓度高。二硬脂酰磷脂酰胆碱脂质体(dspc)具有抗氧化性强、降低药物毒性、缓慢释放、靶向性的优势。通过脂质体的包埋，可以达到缓慢释放药物的效果，可避免一些药物在治疗时作用时间短、治疗效果不佳的缺点。
5.多肽是一种天然的蛋白水解物，不同的多肽具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血压、降血脂、降尿酸等活性，且毒副作用小，已被广泛用于功能食品、保健品、医药等领域。
6.复配制剂是一种常见的功能食品或药物制剂形式，因可充分发挥各种成分的功能活性，且复配后可能产生协同增效作用而被广泛研究和应用。因此，将生物安全性高的氨基葡萄糖金属盐和活性多肽进行复配，有可能制备得到功能活性更高的治疗关节炎的复合物。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术，本发明提供了一种氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物，以及包埋该复配物的脂质体。本发明研究制备了几种氨基葡萄糖金属盐，筛选出抗炎效果最优的氨基葡萄糖钙盐，并进一步将氨基葡萄糖钙盐与leu-his-trp-lys-ser多肽进行复配，通过脂质体包埋将其用于骨关节炎的预防与治疗，提高对关节抗炎和软骨的保护作用。
8.本发明是通过以下技术方案实现的：
9.一种氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物，是由氨基葡萄糖钙盐、leu-his-trp-lys-ser多肽二者复配而成的，二者的质量比为1:1～3，优选1:1。
10.所述氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物的制备方法为：将氨基葡萄糖钙盐、多肽加入水中，混合混匀，得氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物溶液，浓缩、干燥，即得氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物，其中，氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物溶液中复配物的浓度为0.05％～0.5％，单位g/
ml，优选0.1％。
11.一种包埋氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物的脂质体，是由氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物与载体制备而成的脂质体，其中，氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物与载体的配比关系为：每0.02～0.20g的氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物加入200ml的载体，优选每0.04的氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物加入200ml的载体。
12.进一步地，所述载体选自二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇，二者的质量比为3～5:1，优选4:1。
13.进一步地，所述包埋氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物的脂质体的制备方法可以为：将载体加入盛有有机溶剂的容器中，溶解后旋转蒸发得到载体薄膜，然后向容器中加入氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物的水溶液，超声破碎使载体薄膜破碎并与氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物的水溶液混合混匀，然后在70～80℃下处理1.5～3小时，过膜，即得包埋氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物的脂质体(ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip)。
14.进一步地，所述有机溶剂选自甲醇、氯仿或它们的混合。
15.具体地，制备方法如下：称取200mg二硬脂酰磷脂酰胆碱，50mg胆固醇，溶于甲醇-氯仿溶液(由甲醇和氯仿组成，二者体积比为8.5:1,5)，完全溶解后，真空旋蒸，得到薄膜；倒入40ml的浓度为0.05％～0.5％的氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物水溶液(ga-ca-leu-his-trp-lys-ser)，超声使薄膜震动下来，超声破碎10min，破碎结束后于78℃水浴锅中水浴2h，过膜，即得到包埋氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物的脂质体(ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip)。
16.所述氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物在作为或制备预防或治疗骨关节炎的药物中的应用。
17.所述包埋氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物的脂质体在作为或制备预防或治疗骨关节炎的药物中的应用。
18.本发明的氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物、包埋氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物的脂质体具有较好的抗炎效果，包埋氨基葡萄糖钙盐-多肽复配物的脂质体具有抗氧化性强、稳定性好且缓慢释放的优势，可用于骨关节炎的预防与治疗，提高对关节抗炎和软骨的保护作用。
19.本发明通过脂多糖诱导小鼠巨噬细胞，构建细胞炎症模型，通过加药干预检测几种氨基葡萄糖金属盐的抗炎活性，筛选出抗炎效果最佳的氨基葡萄糖钙盐。然后对氨基葡萄糖钙盐、三种多肽以及氨基葡萄糖钙盐和多肽不同配比的复配物分别进行细胞毒性和抗炎活性研究。将氨基葡萄糖钙盐和多肽leu-his-trp-lys-ser(配比为1:1)复配物(ga-ca-leu-his-trp-lys-ser)用于二硬脂酰磷脂酰胆碱脂质体的包埋，得到包埋ga-ca-leu-his-trp-lys-ser的脂质体(ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip)并对脂质体进行相关表征和体外释药研究、细胞毒性研究，还通过体外试验检测对炎症诱导的软骨细胞的保护作用。本发明通过研究发现，ga-ca-leu-his-trp-lys-ser的抗炎效果最佳，氨基葡萄糖钙盐和多肽leu-his-trp-lys-ser在配比为1:1时，可能起到了协同增效的作用。将其通过二硬脂酰磷脂酰胆碱脂质体包埋，体外试验结果表明，ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip可实现较好的抗炎和缓慢释放药物的效果，对炎症诱导的软骨细胞变性具有保护作用。本发明的研究有望通过包埋氨基葡萄糖钙盐的脂质体用于骨关节炎的预防与治疗，可能是未来治疗骨关节
炎的一种新治疗策略。
20.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
21.图1：氨基葡萄糖钙盐红外光谱检测。
22.图2：氨基葡萄糖镁盐红外光谱检测。
23.图3：氨基葡萄糖锌盐红外光谱检测。
24.图4：氨基葡萄糖铁盐红外光谱检测。
25.图5：氨基葡萄糖钾盐红外光谱检测。
26.图6：氨基葡萄糖钠盐红外光谱检测。
27.图7：各组细胞毒性。
28.图8：各组tnf-α含量。
29.图9：各组il-6含量。
30.图10：各组no含量。
31.图11：氨基葡萄糖钙盐、多肽及各复配物(配比1:1)的细胞毒性。
32.图12：氨基葡萄糖钙盐多肽复配物(配比为1:2、1:3)的细胞毒性。
33.图13：氨基葡萄糖钙盐、多肽及不同复配物的tnf-α含量，其中，1组：空白；2组：lps；3组：多肽2；4组：多肽3；5组：多肽1；6组：钙盐；7组：钙盐多肽2(1:1)；8组：钙盐多肽3(1:1)；9组：钙盐多肽1(1:1)；10组：钙盐多肽2(1:2)；11组：钙盐多肽3(1:2)；12组：钙盐多肽1(1:2)；13组：钙盐多肽2(1:3)；14组：钙盐多肽3(1:3)；15组：钙盐多肽1(1:3)。
34.图14：氨基葡萄糖钙盐、多肽及不同复配物的il-6含量，其中，1组：空白；2组：lps；3组：多肽2；4组：多肽3；5组：多肽1；6组：钙盐；7组：钙盐多肽2(1:1)；8组：钙盐多肽3(1:1)；9组：钙盐多肽1(1:1)；10组：钙盐多肽2(1:2)；11组：钙盐多肽3(1:2)；12组：钙盐多肽1(1:2)；13组：钙盐多肽2(1:3)；14组：钙盐多肽3(1:3)；15组：钙盐多肽1(1:3)。
35.图15：氨基葡萄糖钙盐、多肽及不同复配物的no含量，其中，1组：空白；2组：lps；3组：多肽2；4组：多肽3；5组：多肽1；6组：钙盐；7组：钙盐多肽2(1:1)；8组：钙盐多肽3(1:1)；9组：钙盐多肽1(1:1)；10组：钙盐多肽2(1:2)；11组：钙盐多肽3(1:2)；12组：钙盐多肽1(1:2)；13组：钙盐多肽2(1:3)；14组：钙盐多肽3(1:3)；15组：钙盐多肽1(1:3)。
36.图16：空白脂质体透射电镜图。
37.图17：ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip透射电镜图。
38.图18：体外释药图。
39.图19：ga-ca-leu-his-trp-lys-ser和两种脂质体的细胞毒性。
40.图20：各组cox-2含量。
41.图21：各组il-6含量。
42.图22：各组no含量。
43.图23：各组pge2含量。
44.图24：各组tnf-α含量。
45.图25：il-1β的mrna表达。
46.图26：il-6的mrna表达。
47.图27：tac1的mrna表达。
48.图28：mmp1的mrna表达。
49.图29：agg的mrna表达。
50.图30：col2α的mrna表达。
具体实施方式
51.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
52.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
53.实施例1几种氨基葡萄糖金属盐的制备及表征
54.将5g的氨基葡萄糖盐酸盐与7.5g的无水硫酸钙溶于100ml的水中，室温下搅拌2h，用氢氧化钠溶液调节ph值为6.8，然后加热至50℃反应4h；倒入烧杯中，搅拌后加入约3倍溶液体积的丙酮，静置30min，倒出上清液，加入足量的无水乙醇，用玻璃棒不断搅拌，静置，抽滤，滤饼通过无水乙醇重结晶得到固体，再进行真空干燥。
55.其它氨基葡萄糖金属盐(氨基葡萄糖硫酸锌盐，氨基葡萄糖硫酸铁盐，氨基葡萄糖硫酸镁盐，氨基葡萄糖硫酸钾盐，氨基葡萄糖硫酸钠盐)的制备方法同上。
56.对制备的几种氨基葡萄糖金属盐分别进行红外光谱表征，得到以下结果：如图1～图6所示，氨基葡萄糖钙盐在3071cm-1
、2939cm-1
、2805cm-1
、2734cm-1
出现羟基和氨基的伸缩振动吸收峰，在1668cm-1
左右处出现吸收峰，进一步佐证有结晶水的存在。氨基葡萄糖锌盐在2597.1m-1
、2561.9cm-1
、2446.6cm-1
、2142.3cm-1
出现羟基和氨基的伸缩振动吸收峰，在1661.9cm-1
左右处出现吸收峰，进一步佐证有结晶水的存在。氨基葡萄糖镁盐在2555.5cm-1
、2446.6cm-1
、2155.1cm-1
、2135.9cm-1
：出现羟基和氨基的伸缩振动吸收峰，在1533.8cm-1
出现吸收峰，进一步证明产生了结晶水。氨基葡萄糖铁盐在2593.9cm-1
、2552.3cm-1
、2443.4cm-1
、2180.8cm-1
出现羟基和氨基的伸缩振动吸收峰，在1530.6cm-1
左右处有吸收峰，证明产生了结晶水。
57.实施例2细胞毒性检测
58.选用小鼠单核巨噬细胞raw264.7进行培养，首先是96孔板培养，每孔约6000～7000个细胞，每孔加100μl的细胞培养液(gibco,dmem/f12)，放在培养箱37℃，co2浓度5％条件下培养24h，24h后将几种样品按照0.1％、0.25％、0.5％浓度(g/ml，下同)进行加药(即各氨基葡萄糖金属盐、氨基葡萄糖、氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐以及氯化钙)，每孔10μl，12h后检测450nm的吸光度，再根据细胞存活率公式分别计算不同样品的细胞毒性。
59.检测结果如图7所示，氨基葡萄糖锌盐的0.25％和0.5％浓度的细胞存活率低于80％，其他几种物质的细胞存活率均高于80％，因此选取各物质的0.1％浓度进行炎症筛选试验。
60.实施例3几种炎症因子的检测和筛选
61.为了筛选几种氨基葡萄糖金属盐的抗炎效果，将raw264.7细胞以每孔3
×
105个细
胞接种在12孔板中，放置于培养箱培养12h，培养12h后将细胞培养液吸出，加入配制好的1μg/ml脂多糖溶液(lps)，构建炎症模型。其中，空白组吸出培养液后，不加脂多糖溶液，加入不含血清和双抗的细胞培养液。每孔按照顺序分别加入0.1％浓度各样品进行加药(即各氨基葡萄糖金属盐、氨基葡萄糖、氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐以及氯化钙)干预，孵育12h后，每孔取300μl用于几种炎症因子的检测。
62.几种炎症因子的检测结果如图8、9、10所示，结果显示，氨基葡萄糖钙盐的tnf-α、no、il-6含量相比其它几种物质，均是最低，构成显著差异。
63.实施例4氨基葡萄糖钙盐、三种多肽以及氨基葡萄糖钙盐和多肽不同配比复配物的细胞毒性研究
64.本发明团队从南美白对虾蛋白水解物中发掘到具有抗氧化活性的三种多肽leu-his-trp-lys-ser(多肽1)(如seq id no.1所示)、tyr-asp-leu-cys-ile(多肽2)(如seq id no.2所示)和pro-ala-arg-leu(多肽3)(如seq id no.3所示)，采用固相合成法合成该三种多肽，并与氨基葡萄糖钙盐进行复配(将氨基葡萄糖钙盐、多肽加入水，混合混匀，即得；考察三个配比关系，即氨基葡萄糖钙盐与多肽的质量比为1:1、1:2、1:3；考察三个浓度，即0.1％、0.25％、0.5％，指水溶液中复配物的浓度，单位g/ml)，用于细胞毒性和抗炎活性实验研究。
65.选用小鼠单核巨噬细胞raw264.7进行培养，首先是96孔板培养，每孔约6000～7000个细胞，每孔加100μl细胞培养液，放在培养箱37℃，co2浓度5％条件下培养24h，24h后将几种样品按照0.1％、0.25％、0.5％浓度进行加药，即：氨基葡萄糖钙盐、多肽1、多肽2、多肽3、氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物(配比1:1)、氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物(1:2)、氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物(1:3)、氨基葡萄糖钙盐-多肽2复配物(配比1:1)、氨基葡萄糖钙盐-多肽2复配物(1:2)、氨基葡萄糖钙盐-多肽2复配物(1:3)、氨基葡萄糖钙盐-多肽3复配物(配比1:1)、氨基葡萄糖钙盐-多肽3复配物(1:2)、氨基葡萄糖钙盐-多肽3复配物(1:3)，每孔10μl，12h后检测450nm的吸光度，再根据细胞存活率公式分别计算不同样品的细胞毒性。
66.检测结果如图11、12所示，0.1％、0.25％和0.5％浓度的几种物质的细胞存活率均高于80％，均无细胞毒性。
67.实施例5氨基葡萄糖钙盐、三种多肽以及氨基葡萄糖钙盐和多肽不同配比复配物的抗炎活性研究
68.将raw264.7细胞以每孔3
×
105个细胞接种在12孔板中，放置于培养箱培养12h，培养12h后将细胞培养液吸出，加入1μg/ml脂多糖溶液，构建炎症模型。其中，空白组吸出培养液后，不加脂多糖溶液，加入不含血清和双抗的细胞培养液。每孔按照顺序分别加入0.1％浓度各样品(同实施例4)进行加药干预，孵育12h后，每孔取300μl用于几种炎症因子(tnf-α、no、il-6)的检测。
69.检测结果如图13、14、15所示，氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物(配比1:1)的三种促炎因子含量相比其他几种物质均最低，构成显著差异。
70.对三个多肽的抗炎活性与氨基葡萄糖钙盐进行了比较研究，研究发现三个多肽均具有一定的抗炎活性，但均低于氨基葡萄糖钙盐。且三个多肽与氨基葡萄糖钙盐按照不同配比复配后的抗炎活性均有提升，其中复配比为1:1(9组)的多肽1与氨基葡萄糖钙盐复配
物(ga-ca-polypeptide1)的抗炎效果最佳，明显优于其它各组，具有显著差异。氨基葡萄糖钙盐与特定序列的多肽复合使用，可产生类似氨糖多肽的作用，推测具有协同增效作用，可提升产品的抗炎活性。
71.实施例6脂质体制备及表征
72.采用薄膜水合法制备脂质体：称取200mg二硬脂酰磷脂酰胆碱，50mg胆固醇溶于10ml的甲醇-氯仿溶液(8.5ml:1.5ml)，超声20min，完全溶解后，55℃真空旋蒸，得到薄膜；倒入40ml的浓度为0.1％(单位g/ml)的氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物的水溶液(ga-ca-leu-his-trp-lys-ser)，超声使薄膜震动下来，超声破碎10min，破碎结束后于78℃水浴锅中水浴2h，过膜，即得到包埋氨基葡萄糖钙盐-多肽1复配物的脂质体(ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip)。
73.用相同的实验方法制备得到空白脂质体(liposomes)。
74.对两种脂质体分别进行透射电镜扫描，粒径和电位的检测，结果如图16、17所示，制备的脂质体呈现圆形，较均匀。两种脂质体的粒径大小分别为61.5
±
0.47nm、87.4
±
0.85nm。电位大小分别为-45.4mv、-17.2mv。
75.实施例7体外释放研究
76.通过透析法对ga-ca-leu-his-trp-lys-ser和ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip(实施例6制备)进行体外释放研究。将两种物质分别量取10ml于透析袋中，两端扎紧，除去气泡。放入37℃的ph 7.0的200ml的pbs溶液中，维持37℃，于0.5、1、1.5、2、2.5、3、6、9、12、18、24、30、36、48、60、72h时间点进行取样，分别补加等温等体积的透析介质。将取出的透析液分别进行离心、过滤后测吸光度，代入标准曲线计算浓度，计算累积释放量，绘制释放曲线。
77.结果如图18所示，由图18可知，ga-ca-leu-his-trp-lys-ser在最初的3h内释放率达到(96.2
±
2.12)％，基本完全释放。而ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip释放曲线呈现出一开始短暂快速释放，24h之后缓慢释放的趋势。在24h时释放率为(46.3
±
3.09)％。
78.实施例8生物相容性研究
79.细胞毒性：分别对0.1％、0.25％、0.5％、1％、2.5％浓度ga-ca-leu-his-trp-lys-ser、ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip、liposomes采用cck-8法进行细胞毒性检测。将小鼠关节软骨细胞以每孔约7000个细胞，每孔加100μl细胞培养液，放在培养箱37℃，co2浓度5％条件下培养24h，24h后将几种样品按照不同浓度(0.1％、0.25％、0.5％、1％、2.5％)进行加药，每孔10μl，12h后检测450nm的吸光度，再根据细胞存活率公式分别计算不同样品的细胞毒性。结果如图19所示，结果显示，几种物质的细胞存活率均高于80％，三种物质均无细胞毒性。
80.实施例9ga-ca-polypeptide1和两种脂质体对促炎因子表达水平的影响
81.通过培养小鼠关节软骨细胞，构建炎症模型，分别检测ga-ca-leu-his-trp-lys-ser和两种脂质体0.1％浓度对5种炎症因子(cox-2，il-6，no，pge2，tnf-α)表达水平的影响。将小鼠关节软骨细胞以每孔4
×
104/孔接种在6孔板中，于培养箱(温度37℃、co2浓度5％)培养24h，除对照组外其余孔分别加入1ml脂多糖(1μg/ml)，再放置于培养箱中孵育，构建炎症模型。每孔按照顺序分别加入0.1％浓度各样品进行加药干预，孵育12h后，于不同段分别进行取样(其中，tnf-α取样时间为12h，no和il-6取样时间为16h，cox-2和pge2取样时
间为18h)用于几种炎症因子的检测。
82.结果如图20～24所示，结果表明，ga-ca-leu-his-trp-lys-ser组的几种炎症因子的表达量最低，其次是ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip组，构成显著差异。这是由于脂质体具有缓慢释放的特性。在几种炎症因子相应的取样时间段内，包封的氨基葡萄糖钙盐复配物释放较缓慢。这和之前体外释药曲线相符合。
83.实施例10实时荧光定量分析检测几种因子的mrna表达
84.首先提取不同组细胞(实施例9中加药干预后培养得到的细胞)的rna，然后通过cdna逆转录转化成dna，通过qrt-pcr分析il-1β，il-6，tac1，mmp1，agg和col2α转录水平的表达。
85.il-1β，il-6，tac1，mmp1四种因子在正常关节软骨细胞中含量少，炎症反应出现会使其含量上升。结果如图25～30所示，结果显示，ga-ca-leu-his-trp-lys-ser组4种因子的含量最低，其次是ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip组，构成显著差异。agg和col2α两种因子在正常软骨细胞中含量较多，当炎症反应出现时，会显著减少两种因子的含量。结果显示，ga-ca-leu-his-trp-lys-ser两种因子的含量最高，其次是ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip组，构成显著差异。由于脂质体的包埋，ga-ca-leu-his-trp-lys-ser-lip缓慢释放，因此几种因子的表达与ga-ca-leu-his-trp-lys-ser组有差异。结果表明，氨基葡萄糖-多肽1复配物脂质体可实现抗炎和缓慢释放药物的效果，对炎症诱导的软骨细胞变性具有保护作用。
86.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。