一种预防口腔癌的d-柠檬烯纳米乳增效组合物及制备方法与应用

1.本发明属于抑制或预防癌细胞增生的天然药物技术领域，具体为一种预防口腔癌或阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物及制备方法与应用。


背景技术：

2.口腔是微生物进入人体的主要门户，由于其内环境和结构适宜微生物的生长，使口腔成为人体中微生物群落结构最复杂、数量最庞大的结构之一。研究发现，口腔微生物群落之间的相互作用和人体的健康有着密切关系。口腔中微生物生态失衡时，可导致各种口腔疾病的发生，如口腔炎、口腔溃疡等口腔黏膜疾病。据第四次全国口腔健康流行病学调查可知，我国不同年龄段人群（3~5岁、12~15岁、35~44岁、55~64岁、65~74岁）口腔疾病的发病率占总人口的60~98%（王兴. 第四次全国口腔健康流行病学调查报告[r]. 北京：人民卫生出版社，2018），发病率高，且极易复发，而反复发作的口腔慢性炎症可诱导出现口腔癌的癌前病变。由于病因错综复杂，发病机制尚不明确，虽有多种治疗方法，但没有特效性药物，目前主要以局部消炎、止痛、促进溃疡愈合等对症药物为主。
[0003]
口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤的总称，大部分属于鳞状上皮细胞癌，即所谓的黏膜发生变异。口腔癌诱因极为复杂，预后较差，治疗后容易复发，暂没有副作用小的药物和治疗方法。因此，预防口腔癌比治疗更显重要。与此同时，开发新的、高效、毒副作用小的口腔癌预防制剂显得越来越迫切和重要。
[0004]
研究人员普遍认为，作为癌前病变表象——口腔白斑，它的出现可增加口腔癌发生的可能性。目前，对于口腔癌的治疗，多采用手术治疗，但是，手术带来的副作用比较大，特别术后带来的容貌变化，病人难以接受。因此，通过药物预防/治疗口腔白斑癌早期病变将逐渐成为发展的主流。临床治疗口腔白斑常见药物包括维生素a与维甲酸类、β-胡萝卜素、维生素e、硒、博来霉素、cox-2抑制剂及某些中药等，这些物质在应用的过程中存在有效率低，长期服用易对肝肾产生毒性等缺点。此外一些学者研究茶色素、乳香酸、丹酚酸b、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯等天然提取物，证明对口腔癌细胞具有一定抑制作用，但是，其预防口腔白斑的形成，未发现具有统计学意义的作用。另外，一些天然提取物的生物毒理性有待进一步考察。
[0005]
d-柠檬烯，化学名称为1-甲基-4-异丙基环乙稀，分子式为c
10h16
，cas号：5989-27-5。d-柠檬烯是除蒎烯外，目前是在天然植物中最重要和分布最广的萜烯，它被美国食用香料与提取物制造商协会（fema）认定为毒性属gras（一般公认安全）级，并经美国食品和药物管理局（fda）批准可食用，联合国粮农组织（fao）和世界卫生组织（who）对d-柠檬烯的每日摄入毒理数据均将其归属于高安全性的食品添加剂原料。
[0006]
国内外大量研究表明d-柠檬烯对多种肿瘤具有抑制和逆转作用，且具有预防肿瘤发生的作用。但由于d-柠檬烯易挥发、疏水性强，不稳定，限制了其应用。
[0007]
自sobrero等人1847年报道了硝酸甘油可以经口腔黏膜吸收进入人体血液循环系
统后，1879年硝酸甘油的舌下给药剂型成功用于临床（harris d., robinson j.r. drug delivery via the mucous membranes of the oral cavity [j]. j. pharm. sci., 1992, 81(1): 1-10）。之后，许多研究者报道了越来越多的口腔黏膜给药系统。对于通过使用局部递送药物制剂以预防口腔癌来说，口腔黏膜由于其独特的解剖结构，既是一个有效的供药位点，也是一个吸收难点。口腔黏膜是衬覆于口腔表面的组织，有唾液腺开口于其表面，由外到内分别是上皮细胞、固有层和黏膜下组织构成。口腔黏膜的上皮细胞的分泌物为黏液层，其成分是含水量高达95%的连续凝胶，而细胞膜是亲脂的。因此药物通过口腔黏膜可以经细胞间途径和跨细胞途径两种。前者利于亲水性药物通过，后者利于亲脂性药物通过。
[0008]
另一方面，药物的脂溶性和分子量大小对粘附给药和黏膜的吸收有一定影响，若药物的脂溶性越大，非离子形式越多，其穿过口腔黏膜的能力越强，但药物的脂溶性太强，药物难以在唾液中达到有效水平；脂溶性太弱，则不能透过脂质屏障吸收。因此，口腔黏膜的结构决定了d-柠檬烯直接用于口腔，难以得到满意的防治效果，合理地设计d-柠檬烯适合口腔黏膜吸收的剂型和增效配合物显得非常必要。
[0009]
茶树油是从桃金娘科（myrtaceae）白千层（melaleucal l.）的新鲜枝叶中提取的，并经水蒸气蒸馏得到的天然芳香精油，是一种由100多种不同组分组成的混合物，主要种类有单萜类、倍半萜及其衍生物。茶树油组分随茶树品种、生产批次存在差异。本发明所使用茶树油主要成分含量均符合国际标准化组织（iso 4730-2017）规定。茶树油在皮肤渗透促进、消炎抗菌、免疫增强、肿瘤抑制均具有药用价值。
[0010]
目前，国内外有关d-柠檬烯可诱导癌细胞凋亡的研究及文献较多，但未见茶树油协同增效d-柠檬烯预防口腔癌前病变的报道。


技术实现要素：

[0011]
针对目前国内外预防口腔癌的药物普遍存在不同程度的毒副作用，而且，采用d-柠檬烯防治癌细胞，普遍存在药效低和稳定性差的问题。本发明目的是提供一种预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物及其制备方法与应用。
[0012]
本发明是采用如下技术方案实现的：一种预防口腔癌的d-柠檬烯纳米乳增效组合物，包括如下组分：抗癌活性物0.4~10%，增效剂0.1~5%，油相0.25~5%，表面活性剂1~20%，助表面活性剂1~10%，其余为去离子水或蒸馏水。
[0013]
其中：所述抗癌活性物为98%含量的纯天然提取物d-柠檬烯，优选的重量百分比为0.5~2%。所述增效剂为主要成分含量符合国际标准化组织（iso 4730-2017）规定的茶树油，优选的重量百分比为0.1~1%。所述油相为链甘油三酯、橄榄油或者大豆油；所述表面活性剂为吐温-80、吐温-60、吐温-20、司盘类或者聚氧乙烯醚（el-35），优选为吐温-80和el-35；所述助表面活性剂为聚乙二醇、丙二醇或者乙醇，优选为1,2-丙二醇。
[0014]
通过实验证明，未添加油相的纳米乳液不稳定，粒径随着时间变化快速增长，体系中添加适量的油相虽不能完全使纳米乳的粒径停止增长，但可降低纳米乳粒径增长速度，有助于纳米乳体系的稳定，因此，本发明配方中添加有一定量的油相。配方中油相为中链甘油三酯（mct）、橄榄油、大豆油等，优选为mct，依据如下实验确定。
[0015]
实验：称量d-柠檬烯和茶树油各0.5g，以el-35和吐温-80（各6g，即质量比1:1）为混合表面活性剂，1,2-丙二醇（6g）为助表面活性剂，分别以mct、橄榄油、大豆油（均为1g）为油相，将这些物料混合，搅拌条件下，缓慢滴加去离子水30ml制备植物源精油纳米乳，对纳米乳进行粘度测量，结果如表1所示。含有油相的纳米乳比不含油相纳米乳体系粘度大，体系总质量相同条件下，选择流动性较佳的mct作为油相。
[0016]
表1 不同种类油相形成纳米乳的粘度测量结果进一步的，剂油比，即sor值：所有表面活性剂（表面活性剂 助表面活性剂）的质量与所有油相（油相 d-柠檬烯 增效剂）的质量之比为1:1~9:1，优选为4:1。
[0017]
进一步的，表面活性剂与助表面活性剂的质量比km为7:1~1:1，优选3:1~2:1，最佳为3:1。
[0018]
sor值与km值由水相、全部油相（油相、抗癌活性物、增效剂）和表面活性剂（表面活性剂、助表面活性剂）构成的伪三元相图所得。
[0019]
上述d-柠檬烯纳米乳增效组合物的制备方法，如下：（1）先将d-柠檬烯、增效剂、油相、表面活性剂与助表面活性剂按照重量比例放置在容器内，在100~2000r/min条件下搅拌10~120min，得混合物；（2）去离子水或蒸馏水按重量比称量后，在搅拌条件下，将去离子水或蒸馏水缓慢滴入上述混合物中，滴加完毕后，搅拌30~120min，制成粒径为10~100nm的纳米乳液，即为本发明所述预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物产品。
[0020]
上述d-柠檬烯纳米乳增效组合物也可以通过高压均质法制备：将d-柠檬烯增效纳米乳组合物各物料按重量百分比分别置入高压均质机内，在工作压力为200~1500par的条件下，均质10~120min，制成粒径为10~100nm的纳米乳液，即为本发明所述预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物产品。
[0021]
发明人通过实验证明，茶树油对d-柠檬烯具有协同增效作用，尤其对口腔癌前病变（白斑）预防作用较为显著。所以，本发明所述的d-柠檬烯纳米乳增效组合物能够作为预防口腔癌或阻止口腔癌前病变进展的药物，以及涉及口腔保健与卫生方面制备预防口腔癌或阻止口腔癌前病变的漱口水的应用。
[0022]
本发明的意义在于：首次发现和证明，d-柠檬烯和茶树油在科学配合的恰当组合下，添加油相及表面活性剂，制备成纳米乳液，作为药物进行口腔局部使用，具有高效黏膜吸收的特点，即：d-柠檬烯与茶树油组成的增效纳米乳组合物对预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展具有显著增效作用。
[0023]
本发明设计科学、合理，具有很好的实际应用价值。
附图说明
[0024]
图1表示正常地鼠颊囊黏膜（对照组）。
[0025]
图2表示每周3次涂抹0.5% dmba后的地鼠颊囊黏膜，连续15周，可见组织水肿、增生变厚，一些地鼠出现了癌前病变（白斑）（模型组）。
[0026]
图3表示每周3次涂抹0.5% dmba，d-柠檬烯增效纳米乳每天涂抹2次，当天涂抹dmba时，间隔6小时后涂抹d-柠檬烯增效纳米乳1次，连续15周后地鼠颊囊与正常组无异（预防组-2）。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
[0028]
实施例1：0.5%有效含量的可预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物。
[0029]
一种可预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物配方（重量百分比）如下：抗癌活性物：
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0.4%；增效剂：
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0.1%；油相：
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0.25%；表面活性剂：
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2%；助表面活性剂：
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1%；其余为：
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去离子水或蒸馏水。
[0030]
其中，抗癌活性物为98%含量的纯天然提取物d-柠檬烯；增效剂为主要成分含量符合国际标准化组织（iso 4730-2017）规定的茶树油；油相为中链甘油三酯（mct）；表面活性剂为吐温-80；助表面活性剂为1,2-丙二醇。
[0031]
具体制备方法如下：1、先将d-柠檬烯、增效剂、油相、表面活性剂与助表面活性剂按照重量比例放置在容器内，在1500r/min条件下搅拌60min得混合物；2、去离子水或蒸馏水按重量比称量后，在搅拌条件下，将去离子水或蒸馏水缓慢滴入上述混合物中，滴加完毕后，搅拌30min，即制得预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯增效纳米乳组合物产品。
[0032]
实施例2：2%有效含量的可预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物。
[0033]
一种可预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物配方（重量百分比）如下：抗癌活性物：
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1%；增效剂：
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1%；油相：
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1%；表面活性剂：
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9%；助表面活性剂：
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3%；其余为：
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去离子水或蒸馏水。
[0034]
其中，抗癌活性物为98%含量的纯天然提取物d-柠檬烯；增效剂为主要成分含量符合国际标准化组织（iso 4730-2017）规定的茶树油；油相为中链甘油三酯（mct）；表面活性剂为吐温-80与el-35的1:1混合物；助表面活性剂为1,2-丙二醇。
[0035]
具体制备方法如下：1、先将d-柠檬烯、增效剂、油相、表面活性剂与助表面活性剂按照重量比例放置在容器内，在1000r/min条件下搅拌60min得混合物；2、去离子水或蒸馏水按重量比称量后，在搅拌条件下，将去离子水或蒸馏水缓慢滴入上述混合物中，滴加完毕后，搅拌30min，即制得预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯增效纳米乳组合物产品。
[0036]
上述d-柠檬烯纳米乳增效组合物预防口腔癌前病变的实验方法和结果如下：（1）实验方法：选取6~8周龄、体重18~20g的中国地鼠若干，采用涂抹法将0.5% 二甲基苯并蒽（dmba）以每周3次的频率用棉签涂抹于中国地鼠右侧颊囊。第5周时发生非典型增生，第9周时有炎症反应并产生溃疡，第15周颊囊出现白斑、充血等癌前病变表现。分4组进行实验，处理如下，并连续观察。
[0037]
对照组：9只，无任何处理。
[0038]
模型组：9只，每周3次涂抹0.5% dmba。
[0039]
预防组-1：9只，每周3次涂抹0.5% dmba，d-柠檬烯纳米乳增效组合物每天涂抹2次，当天涂抹dmba时，间隔6小时后涂抹d-柠檬烯增效纳米乳（该配方中抗癌活性物的质量配比为2%，且不含增效剂，其余成分配比与实施例2相同）1次。
[0040]
预防组-2：8只，每周3次涂抹0.5% dmba，d-柠檬烯增效纳米乳每天涂抹2次，当天涂抹dmba时，间隔6小时后涂抹d-柠檬烯增效纳米乳（实施例2）1次。
[0041]
表2 d-柠檬烯纳米乳增效组合物预防口腔癌实验结果（2）实验结论：实验过程中粘有实施例2的棉签涂抹地鼠口腔黏膜后，黏膜干燥的很快，提示药物具有高效透皮吸收效率，同时发现将实施例2以灌胃的形式给药并不能预防口腔黏膜癌前病变，说明本发明所述d-柠檬烯纳米乳增效组合物的首过效应较大，非常适合口腔黏膜局部给药。综合来看，本实施例2制备的d-柠檬烯纳米乳增效组合物可比单组分d-柠檬烯纳米乳显著提升口腔癌的预防效能（如图3所示）。
[0042]
实施例3：10%有效含量的可预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬
烯增效纳米乳。
[0043]
一种可预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物配方（重量百分比）如下：抗癌活性物：
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7%；增效剂：
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3%；油相：
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3%；表面活性剂：
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17.333%；助表面活性剂：
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8.667%；其余为：
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去离子水或蒸馏水。
[0044]
其中，抗癌活性物为98%含量的纯天然提取物d-柠檬烯；增效剂为主要成分含量符合国际标准化组织（iso 4730-2017）规定的茶树油；油相为橄榄油；表面活性剂为吐温-80；助表面活性剂为peg-400。
[0045]
具体制备方法：将d-柠檬烯纳米乳增效组合物各物料按重量百分比分别置入高压均质机内，在工作压力为800par的条件下，均质30min，即制得预防口腔癌前病变/阻止口腔癌前病变进展的d-柠檬烯纳米乳增效组合物产品。
[0046]
本发明产品主要用于预防口腔癌或阻止口腔癌前病变进展，可直接使用，也可根据需要稀释使用。
[0047]
以上仅为本发明的具体实施例，但并不局限于此。任何以本发明为基础解决基本相同的技术问题，或实现基本相同的技术效果，所作出地简单变化、等同替换或者修饰等，均属于本发明全拉要求书的保护范围内。