一种降血脂组合物的制备、活性成分的提取的制作方法

1.本发明属于药物配方领域，具体涉及一种降血脂组合物的制备、活性成分的提取。


背景技术：

2.非酒精性脂肪性肝病是一种病变主体在肝小叶以肝细胞脂肪变性为病理特征的临床综合征，也称为单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、肝硬化、甚至肝癌。据统计，近10年间非酒精性脂肪肝的患病率逐年升高且低龄化，迄今为止已经取代病毒性肝炎成为全球最常见的慢性肝病，在我国的发病率已高达25％，严重威胁人民健康。对非酒精性脂肪肝的治疗在改善生活方式的基础上，以保肝抗炎药物和胰岛素抵抗药物进行辅助治疗，近年来常用药物多烯磷脂酰胆碱已被多项临床试验证实具有明确的保肝、抗炎、抗纤维化作用，但依然存在副作用明显、治疗效果不理想等问题。而祖国传统中医药在治疗慢性肝病方面具有独特的临床疗效，这为非酒精性脂肪性肝病的治疗提供了重要的替代方法。同时，随着医学研究的不断深入，借助肠道菌群的调节治疗非酒精性脂肪肝已经成为了一种新的治疗途径。


技术实现要素：

3.本发明的目的是要提供一种采用中医药、副作用小、疗效独特的降血脂组合物的制备、活性成分的提取。
4.为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
5.一种降血脂组合物，其包括活性多糖、活性肽和益生菌，按质量百分比计算，所述活性多糖、活性肽、益生菌的质量百分比为1：0.01-2：0.002-0.04。
6.上述的一种降血脂组合物，其所述活性多糖包括山楂多糖、罗汉果多糖或者等量的山楂多糖和罗汉果多糖的组合物。
7.上述的一种降血脂组合物，其所述山楂多糖、罗汉果多糖的分子量小于等于15kd，优选的，山楂多糖分子量为1-2kd，罗汉果多糖分子量为2-3kd。
8.上述的一种降血脂组合物，其所述活性肽包括动物肝脏活性肽、金枪鱼活性肽或者等量的动物肝脏活性肽和金枪鱼活性肽的组合物。
9.上述的一种降血脂组合物，其所述动物肝脏活性肽、金枪鱼活性肽的分子量小于等于15kd，优选的，动物肝脏活性肽为牛肝脏活性肽，所述牛肝脏活性肽和金枪鱼活性肽分子量低于2kd。
10.上述的一种降血脂组合物，其所述益生菌包括乳两双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两双歧杆菌中的一种或者几种的组合物。
11.一种降血脂组合物的制备方法，其包括以下步骤：
12.1)活性多糖活性成分提取
13.取活性多糖若干量，加入该活性多糖重量5-10倍的去离子水溶解，将溶解后的活性多糖水溶液用孔径小于等于15kd的透析袋透析，收集活性多糖透析液并冻干制备成活性
多糖冻干粉备用；
14.2)活性肽活性成分提取
15.取活性肽若干量，加入该活性肽重量5-10倍的去离子水溶解，将溶解后的活性肽水溶液用孔径小于等于15kd的透析袋透析，收集活性肽透析液并冻干制备成活性肽冻干粉备用；
16.3)称取适量的活性多糖活性成分、活性肽活性成分、益生菌冻干粉和去离子水；
17.4)组合物制备
18.将活性多糖活性成分和活性肽活性成分混合均匀，加去离子水调成固含量为10-15％的浆状液体，经过冻干制成组合物粉末，在组合物粉末中加入益生菌冻干粉混合均匀，得到降血脂组合物。
19.上述的一种降血脂组合物的制备方法，其所述步骤2)活性肽采用牛肝脏活性肽时，取新鲜牛肝脏，粉碎机粉碎，加入与牛肝脏重量5-10倍的去离子水超声提取1小时，纱布过滤，滤液用透析袋透析，收集牛肝脏透析液并冻干。
20.上述的一种降血脂组合物的制备方法，其所述活性多糖选用分子量在1-2kd的山楂多糖和分子量在2-3kd罗汉果多糖，所述活性肽选用分子量低于2kd的牛肝脏活性肽和金枪鱼活性肽，所述益生菌包括乳两双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两双歧杆菌，山楂多糖、罗汉果多糖、牛肝脏活性肽、金枪鱼活性肽、乳两双歧杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、两双歧杆菌冻干粉的质量比为1：0.1-1：0.01-1：0.01-1：0.001-0.01：0.001-0.01：0.001-0.01：0.001-0.01。
21.上述的一种降血脂组合物的制备方法，其取适量的降血脂组合物粉末，按降血脂组合物粉末总质量的20-70％加入β-环糊精，冻干后装入空胶囊中，制得降血脂胶囊剂。
22.有益效果：
23.本发明通过简单的、活性评价的方法提取活性多糖、活性肽最佳活性成分，然后将不同活性成分进行组合并复配具有降血脂、增强肝脏脂肪代谢功能的益生菌得到他们的组合物，将这种活性多糖、活性肽及益生菌组合物用于降血脂、增强肝脏脂肪代谢功能有非常显著的药效作用，比单一的使用活性多糖或活性肽或益生菌更好。
24.说明书附图
25.图1为实施例功能对比实验对大鼠体质量、肝脏指数、附睾脂肪相对含量的影响
26.图2为实施例功能对比实验对大鼠血清mda、gsh水平的影响
27.图3为实施例功能对比实验对大鼠血清sod、gpx及cat水平的影响
28.图4为实施例功能对比实验对大鼠血清nitrite和pge2水平的影响
29.图5为实施例功能对比实验对大鼠肝脏组织inos、cox-2蛋白水平的影响
30.图6为实施例功能对比实验对大鼠肝脏组织nfκb信号通路相关蛋白表达的影响
31.图7为实施例功能对比实验对大鼠肝脏组织mapks及akt信号通路相关蛋白表达的影响
具体实施方式
32.下面结合附图对发明内容作详细的解释。
33.实施例1
34.本实施例的一种降血脂组合物，包括活性多糖、活性肽和益生菌，活性多糖包括等量的山楂多糖和罗汉果多糖组合物,活性肽包括等量的动物肝脏活性肽和金枪鱼活性肽的组合物,益生菌包括乳两双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两双歧杆菌的组合物。按质量百分比计算，活性多糖、活性肽、益生菌的质量百分比为1：0.5：0.02。
35.一种降血脂组合物的制备方法，其包括以下步骤：
36.1)山楂多糖活性成分的提取
37.取山楂多糖200g，加入与2000g的水溶解，山楂多糖溶液用孔径为2kd的透析袋透析，收集分子量为1-2kd的山楂多糖透析液并冻干，制备成山楂多糖冻干粉备用。
38.2)罗汉果多糖活性成分的提取
39.取罗汉果多糖200g，加入2000g的水溶解，罗汉果多糖溶液用孔径为3kd的透析袋透析，收集分子量为2-3kd的罗汉果多糖透析液并冻干，制备成罗汉果多糖冻干粉备用。
40.3)动物肝脏活性肽活性成分的提取
41.取新鲜牛肝脏500g，粉碎机粉碎，加入3000g的水超声提取1小时，纱布过滤，滤液用孔径为2kd的透析袋透析，收集分子量为1-2kd的动物肝脏透析液并冻干，制备成牛肝脏活性肽冻干粉备用。
42.4)金枪鱼活性肽活性成分的提取
43.取金枪鱼活性肽100g，加入1000g的水溶解，金枪鱼活性肽溶液用孔径为2kd的透析袋透析，收集分子量为1-2kd的金枪鱼活性肽透析液并冻干，制备成金枪鱼活性肽冻干粉备用。
44.5)益生菌选用乳两双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两双歧杆菌。
45.6)组合物的制备
46.配方：称取分子量在1-2kd之间的山楂多糖冻干粉1g，分子量在2-3kd之间的罗汉果多糖冻干粉1g，分子量1-2kd的牛肝脏活性肽冻干粉0.5g，分子量1-2kd的金枪鱼活性肽冻干粉0.5g，乳两双歧杆菌冻干粉0.01g，植物乳杆菌冻干粉0.01g，鼠李糖乳杆菌冻干粉0.01g，两双歧杆菌冻干粉0.01g。
47.将按上述配方称取的山楂多糖冻干粉、罗汉果多糖冻干粉、牛肝脏活性肽冻干粉、金枪鱼活性肽冻干粉混合均匀，加去离子水调成固含量为10-15％的浆状液体，经过冻干制成组合物粉末，在组合物粉末中加入乳两双歧杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、两双歧杆菌冻干粉混合均匀，得到降血脂组合物。降血脂组合物用于非酒精性脂肪肝的治疗。
48.取适量的降血脂组合物粉末，按降血脂组合物粉末总质量的20-70％加入β-环糊精，冻干后装入空胶囊中，制得降血脂胶囊剂。
49.降血脂组合物的应用实验
50.8周龄spf级sd雄性大鼠(200～220g)60只。动物饲养温度20～25℃，相对湿度40％～50％，昼夜明暗交替时间12h/12h，所有大鼠普通饲料适应性喂养1周后，随机选取10只大鼠为对照组，食用普通饲料，剩余大鼠为高脂组，食用高脂饲料，28周末进行葡萄糖耐量试验，发现高脂组大鼠糖耐量显著降低，且在此基础上随机取5只观察其肝脏组织病理变化。
51.造模成功后按照体质量将高脂组大鼠随机分为5组，每组10只，分别为模型组、活性多糖(分子量在1-2kd之间的山楂多糖与分子量在2-3kd之间的罗汉果多糖的质量比为1:
1)组、活性肽(分子量低于2kd的牛肝脏活性肽与分子量低于2kd的金枪鱼活性肽的质量比为1:1)组、益生菌(乳两双歧杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌冻干粉、两双歧杆菌冻干粉的质量比为1:1:1:1)组及活性肽、活性多糖、益生菌组合物组。
52.空白组给予普通饲料，其余各组大鼠给予高脂饲料，干预周期为10周。其中，灌胃活性多糖或活性肽或益生菌或活性多糖、活性肽、益生菌组合物的剂量为50mg/kg/d、50mg/kg/d、10mg/kg/d、50mg/kg/d；剩余大鼠进行0.5ml生理盐水灌胃，每天同一时间点进行灌胃；干预结束后，禁食12h，采用10％水合氯醛麻醉处死后，取血液样本，取附睾脂肪和肝脏，样本保留备用。
53.指标测定：
54.体质量、肝湿重、附睾脂肪重量测定：记录大鼠体质量，处死后立即取附睾脂肪并称重，用预冷生理盐水冲洗肝脏组织，称量，并计算脏器指数[脏器指数＝脏器质量(g)/体质量(g)]。
[0055]
肝功能和血脂水平指标的检测：处死大鼠后经腹主动脉取血，4℃，3000r/min离心10min取血清，严格按照试剂盒说明书操作，检测血清tg、tc、hdl、ldl、alt、ast、alp含量及mda、sod、no、il-6、il-1β、tnf-α、pge2水平。
[0056]
western blot检测大鼠肝脏组织中nfκb、mapks及akt信号通路相关蛋白水平：取肝脏组织100mg，加入1ml的蛋白裂解液，用弯眼科剪剪碎组织，使用机械匀浆机匀浆后，12000
×
g，4℃离心5min，取上清，采用bca法测定蛋白浓度。各样品配平浓度后煮沸变性，电泳，电泳结束后转膜，将pvdf膜至于5％的脱脂牛奶中室温封闭60min，封闭结束后至于pbst中洗涤3次，每次10min，然后孵一抗4℃过夜。置于pbst中洗涤3次，每次10min，孵育二抗，再洗涤3次，进行显影曝光。显影结果用image j软件进行灰度值分析。
[0057]
实验结果：
[0058]
参照图1，与空白组相比，高脂组大鼠38周末体质量、肝脏指数和附睾脂肪相对含量显著增加增加(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.01)。而与模型组相比，活性肽、活性多糖、益生菌组合物组体质量、肝脏指数和附睾脂肪相对含量均降低(p＜0.05，p＜0.05，p＜0.01)。
[0059]
表1活性肽、活性多糖、益生菌组合物对大鼠血脂tg、tc、ldl-c、hdl-c的影响
[0060][0061]
由表1可看出，与空白组相比，模型组大鼠血清tg、tc、ldl-c水平均升高(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.01)，hdl-c水平降低(p＜0.01)；而与模型组相比，各干预组大鼠tg、tc、ldl-c水平均降低，其中活性肽、活性多糖、益生菌组合物组tg、tc、ldl-c降低最明显(p＜0.05，p
＜0.01，p＜0.01)。hdl-c水平在活性肽、活性多糖、益生菌组合物组升高最明显(p＜0.01)。
[0062]
表2活性肽、活性多糖、益生菌组合物对大鼠肝脏功能指标(ast、alt、alp、ldh)的影响
[0063][0064][0065]
由表2可看出，与空白组相比，模型组大鼠血清ast、alt、alp、ldh水平均显著升高(p＜0.01，p＜0.01，p＜0.01，p＜0.01)；与高脂组相比，各干预组大鼠ast、alt、alp、ldh水平均降低，其中活性肽、活性多糖、益生菌组合物组ast、alt、alp、ldh降低最明显(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.01，p＜0.01)。
[0066]
表3活性肽、活性多糖、益生菌组合物对大鼠血脂炎症因子(il-6、il-1β、tnf-α)的影响
[0067][0068]
由表3可看出，与空白组相比，模型组大鼠血清炎症因子(il-6、il-1β、tnf-α)水平均升高(p＜0.01，p＜0.01，p＜0.01)；而与高脂组相比，各干预组大鼠炎症因子(il-6、il-1β、tnf-α)水平均降低，其中活性肽、活性多糖、益生菌组合物组炎症因子(il-6、il-1β及tnf-α)降低最明显(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.01)。
[0069]
参照图2，与空白组相比，模型组大鼠血清mda水平均升高(p＜0.01)，gsh水平降低(p＜0.01)；而与模型组相比，各干预组大鼠mda水平均降低，其中活性肽、活性多糖、益生菌组合物组mda降低最明显(p＜0.01)。gsh水平在活性肽、活性多糖、益生菌组合物组升高最明显(p＜0.05)。
[0070]
参照图3，与空白组相比，模型组大鼠血清sod、gpx及cat降低(p＜0.01，p＜0.01，p＜0.05)；而与模型组相比，各干预组大鼠sod、gpx及cat水平均升高，其中活性肽、活性多
糖、益生菌组合物组sod、gpx及cat升高最明显(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.01)。
[0071]
参照图4，与空白组相比，模型组大鼠血清nitrite和pge2水平均升高(p＜0.01，p＜0.01)；而与模型组相比，各干预组大鼠nitrite、pge2水平均降低，其中活性肽、活性多糖、益生菌组合物组nitrite、pge2降低最明显(p＜0.01，p＜0.01)。
[0072]
参照图5可看出，与空白组相比，模型组大鼠肝脏组织inos、cox-2蛋白表达升高(p＜0.01，p＜0.01)；与模型组相比，各干预组大鼠inos、cox-2表达水平降低，其中活性肽、活性多糖、益生菌组合物组inos、cox-2表达降低最明显(p＜0.01，p＜0.05)。
[0073]
由图6可看出，与空白组相比，模型组大鼠肝脏组织p-ikkα/β、p-iκbα和p65(核)蛋白表达升高(p＜0.01，p＜0.01，p＜0.01)；与模型组相比，各干预组大鼠p-ikkα/β、p-iκbα和p65(核)表达被抑制，其中活性肽、活性多糖、益生菌组合物组p-ikkα/β、p-iκbα和p65(核)表达抑制最明显(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.05)。
[0074]
由图7可看出，与空白组相比，模型组大鼠肝脏组织p-erk、p-jnk、p-p38和p-akt蛋白表达升高(p＜0.01，p＜0.01，p＜0.01，p＜0.01)；与模型组相比，各干预组大鼠p-erk、p-jnk、p-p38和p-akt表达被抑制，其中活性肽、活性多糖、益生菌组合物组p-erk、p-jnk、p-p38和p-akt表达抑制最明显(p＜0.01，p＜0.01，p＜0.05，p＜0.05)。
[0075]
本发明通过简单的、活性评价的方法提取活性多糖、活性肽最佳活性成分，然后将不同活性成分进行组合并复配具有降血脂、增强肝脏脂肪代谢功能的益生菌得到他们的组合物，将这种活性多糖、活性肽及益生菌组合物用于降血脂、增强肝脏脂肪代谢功能有非常显著的药效作用，比单一的使用活性多糖或活性肽或益生菌更好。
[0076]
实施例2
[0077]
本实施例与实施例1的不同之处在于，活性多糖选用山楂多糖，活性肽选用动物牛肝脏活性肽，益生菌包括乳两双歧杆菌、植物乳杆菌，按质量百分比计算，活性多糖、活性肽、益生菌的质量百分比为1：0.01：0.002。
[0078]
本实施例的制备方法，包括以下步骤：
[0079]
1)山楂多糖活性成分的提取
[0080]
取山楂多糖200g，加入与1000g的水溶解，山楂多糖溶液用孔径为15kd的透析袋透析，收集分子量为10-15kd的山楂多糖透析液并冻干，制备成山楂多糖冻干粉备用。
[0081]
2)动物肝脏活性肽活性成分的提取
[0082]
取新鲜牛肝脏500g，粉碎机粉碎，加入5000g的水超声提取1小时，纱布过滤，滤液用孔径为15kd的透析袋透析，收集分子量为10-15kd的动物肝脏透析液并冻干，制备成牛肝脏活性肽冻干粉备用。
[0083]
3)益生菌选用乳两双歧杆菌、植物乳杆菌。
[0084]
4)组合物的制备
[0085]
配方：称取分子量在10-15kd之间的山楂多糖冻干粉1g，分子量10-15kd的牛肝脏活性肽冻干粉0.01g，乳两双歧杆菌冻干粉0.001g，植物乳杆菌冻干粉0.001g。
[0086]
将按上述配方称取的山楂多糖冻干粉、牛肝脏活性肽冻干粉混合均匀，加去离子水调成固含量为10％的浆状液体，经过冻干制成组合物粉末，在组合物粉末中加入乳两双歧杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉混合均匀，得到降血脂组合物。降血脂组合物用于非酒精性脂肪肝的治疗。
[0087]
取适量的降血脂组合物粉末，按降血脂组合物粉末总质量的20％加入β-环糊精，冻干后装入空胶囊中，制得降血脂胶囊剂。
[0088]
实施例3
[0089]
本实施例与实施例2的不同之处在于，活性多糖选用罗汉果多糖、活性肽选用金枪鱼活性肽，益生菌选用鼠李糖乳杆菌、两双歧杆菌，按质量百分比计算，活性多糖、活性肽、益生菌的质量百分比为1：2：0.04。
[0090]
本实施例的制备方法包括：
[0091]
1)罗汉果多糖活性成分的提取
[0092]
取罗汉果多糖200g，加入1500g的水溶解，罗汉果多糖溶液用孔径为3kd的透析袋透析，收集分子量为2-3kd的罗汉果多糖透析液并冻干，制备成罗汉果多糖冻干粉备用。
[0093]
2)金枪鱼活性肽活性成分的提取
[0094]
取金枪鱼活性肽200g，加入1500g的水溶解，金枪鱼活性肽溶液用孔径为5kd的透析袋透析，收集分子量为3-5kd的金枪鱼活性肽透析液并冻干，制备成金枪鱼活性肽冻干粉备用。
[0095]
5)益生菌选用鼠李糖乳杆菌、两双歧杆菌。
[0096]
6)组合物的制备
[0097]
配方：称取分子量在2-3kd的罗汉果多糖冻干粉1g，分子量3-5kd的金枪鱼活性肽冻干粉2g，鼠李糖乳杆菌冻干粉0.02g，两双歧杆菌冻干粉0.02g。
[0098]
将按上述配方称取的罗汉果多糖冻干粉、金枪鱼活性肽冻干粉混合均匀，加去离子水调成固含量为10-15％的浆状液体，经过冻干制成组合物粉末，在组合物粉末中加入鼠李糖乳杆菌冻干粉、两双歧杆菌冻干粉混合均匀，得到降血脂组合物。降血脂组合物用于非酒精性脂肪肝的治疗。
[0099]
进一步地，本发明的活性多糖包括山楂多糖、罗汉果多糖或者等量的山楂多糖和罗汉果多糖的组合物。制备活性多糖活性成分时，可以用孔径为15kd，10kd，5kd，3kd，2kd，1kd的透析袋透析，分别收集分子量为15-10kd，10-5kd，5-3kd，3-2kd，2-1kd，低于1kd的活性多糖透析液并冻干，制备成活性多糖冻干粉待用。
[0100]
进一步地，本发明的活性肽包括动物肝脏活性肽、金枪鱼活性肽或者等量的动物肝脏活性肽和金枪鱼活性肽的组合物。制备活性肽活性成分时，可以用孔径为15kd，10kd，5kd，3kd，2kd，1kd的透析袋透析，分别收集分子量为15-10kd，10-5kd，5-3kd，3-2kd，2-1kd，低于1kd的活性肽透析液并冻干，制备成活性肽冻干粉待用。
[0101]
进一步地，本发明益生菌可以选用乳两双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两双歧杆菌中的任意一种，或者几种的组合物。
[0102]
进一步地，本发明的活性多糖、活性肽、益生菌的质量百分比为1：0.01-2：0.002-0.04。
[0103]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。