一种黑磷-半胱氨酸纳米复合物及其合成方法和应用

1.本发明属于无创成像技术领域，具体涉及一种黑磷-半胱氨酸纳米复合物及其合成方法和应用。


背景技术：

2.光学相干断层扫描(optical coherence tomography，oct)：一种基于低相干光干涉的高速、无创、高分辨率的三维成像技术，可以在微米级分辨率下对生物组织的细胞和亚细胞水平进行微观结构评估。
3.光热光学相干层析成像(photothermal optical coherence tomography，pt-oct)：oct技术的一种变体，在额外的激光照射下，通过温度变化引起组织中光学相变的变化。
4.造影剂(contrast media)：为增强影像观察效果而注入(或服用)到人体组织或器官的化学制品。
5.光热疗法(photothermal therapy，ptt)：一种微创的局部治疗方式，主要依靠光吸收剂(也称为光敏剂)吸收能量，并在射频、微波、近红外照射或可见光等电磁辐射的刺激下将其转化为热量，从而对肿瘤进行热消融达到治疗目的。
6.量子点(quantum dots，qds)：半导体纳米粒子，大小范围通常在1.5至10.0纳米之间。其光学和电子(光电子)特性受大小和成分的影响，属于量子力学范畴。
7.在癌症诊断的手段中，无创成像技术引起了人们巨大的研究兴趣。其中光学相干层析成像(optical coherence tomography,oct)是一种基于低相干光干涉的高速、无创、高分辨率的三维成像技术，可以在微米级分辨率下从细胞和亚细胞水平上评估生物组织的微观结构。光热光学相干层析成像(photothermal optical coherence tomography，pt-oct)是由oct技术发展而来的一种变体，在额外的激光照射下，通过温度变化诱导组织的光学相变。然而，目前用于pt-oct的造影剂，例如用金合成的造影剂，存在一些生物安全性问题。因此，具有生物相容性和生物降解性的新型pt-oct探针备受关注。
8.黑磷(bp)是一种新型二维材料，具有0.3～2.0ev的层依赖带隙，比石墨烯更适用于电子和光电子领域。最近，黑磷量子点(bpqds)由于其在紫外和近红外区域的广泛光吸收，已被用作光热和光动力癌症治疗的生物兼容光响应纳米制剂。bp或bpqds可以很容易地被氧气和水降解，因此具有更好的生物安全性。但这一特性导致bpqds在肾脏排泄迅速，在血液循环中降解过快，限制了其生物医学应用。因此，人们迫切需要能够增强bpqds稳定性的一种平台。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种黑磷-半胱氨酸纳米复合物的合成方法，该方法合成的黑磷-半胱氨酸纳米复合物作为bpqds纳米载体，能稳定存在于水或血液中，并且在生理环境中可以安全降解。
10.本发明的目的还在于提供上述合成方法合成的黑磷-半胱氨酸纳米复合物。
11.本发明的最后一个目的在于提供上述黑磷-半胱氨酸纳米复合物在oct造影剂或药物载体方面的应用。
12.本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种黑磷-半胱氨酸纳米复合物的合成方法，包括以下步骤：
13.(1)将黑磷(bp)粉末分散在n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)中得黑磷-n-甲基-2-吡咯烷酮混合溶液，先在高功率下间歇式超声处理，再在低功率超声条件下和冰浴条件下对黑磷-n-甲基-2-吡咯烷酮混合溶液进行过夜处理，然后将产物离心，取含有黑磷量子点(bpqds)的上清液，将上清液离心去除n-甲基-2-吡咯烷酮，再用二甲基亚砜(dmso)冲洗沉淀，将沉淀用二甲基亚砜重悬，即得黑磷量子点(bpqds)悬液；
14.(2)将l-胱氨酸二甲酯二盐酸盐((h-cys-ome)2·
2hcl)和三乙胺溶解于二甲基亚砜中，再加入癸二酰氯的二甲基亚砜溶液，搅拌混匀，接着加入冷乙醚沉淀，干燥，得到疏水的半胱氨酸-聚二硫酰胺聚合物(cys-pdsa，也可以称为cys-8e，8代表二元酸重复单元中的亚甲基数目)；
15.(3)将步骤(1)中的黑磷量子点(bpqds)悬液、步骤(2)中制备的疏水的半胱氨酸-聚二硫酰胺聚合物(cys-pdsa)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)溶解于二甲基亚砜中混匀，得黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)粗品，将粗品经分散和离心纯化，即制得黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)。
16.在该黑磷-半胱氨酸纳米复合物的合成方法中：
17.优选的，步骤(1)中所述黑磷粉末与所述n-甲基-2-吡咯烷酮的用量关系为1mg：1ml～2ml。
18.优选的，步骤(1)中在高功率下间歇式超声处理包括：用功率为700～800w的超声细胞破碎仪超声6～7h，超声探头工作3～5s，间隔3～5s。
19.优选的，步骤(1)中在低功率超声条件下的超声细胞破碎仪的功率为250～350w，过夜处理时间为12～14h。
20.优选的，步骤(1)中将产物离心时，离心机转速为7000～8000rpm，离心时间为20～30min，将上清液离心时，离心机转速为13000～14000rpm，离心时间为45～60min。
21.优选的，步骤(2)中所述l-胱氨酸二甲酯二盐酸盐((h-cys-ome)2·
2hcl)、三乙胺和癸二酰氯的摩尔比为2：3：1～3。
22.优选的，步骤(3)中所述黑磷量子点(bpqds)悬液、疏水的半胱氨酸-聚二硫酰胺聚合物(cys-pdsa)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)的质量份配比为2：1：1～2。
23.优选的，步骤(3)中在剧烈搅拌下，将黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)粗品滴入水中分散，得分散液，然后将分散液离心纯化，即制备得黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)。
24.优选的，步骤(3)中剧烈搅拌时的搅拌器转速为1200～1400rpm。
25.进一步的，步骤(3)中将黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)冷冻干燥后，制得黑磷-半胱氨酸纳米颗粒(bpqd/cys-8e nps)。
26.本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种黑磷-半胱氨酸纳
米复合物，采用上述任一项方法制备获得。
27.本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的黑磷-半胱氨酸纳米复合物在oct造影剂或药物载体方面的应用。
28.本发明具有以下有益效果：
29.(1)本发明开发了一种新的纳米材料复合物，第一次设计并开发了疏水的半胱氨酸-聚二硫酰胺(cys-pdsa)聚合物作为bpqds纳米载体，该产物能稳定存在于水或血液中，并且在生理环境中可以安全降解；
30.(2)本发明合成的黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)可以用作oct造影剂，凭借黑磷优良的光热特性，利用bp纳米材料作为造影剂，对肿瘤进行pt-oct成像；
31.(3)本发明合成的黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)可以用作肿瘤光热治疗，黑磷量子点有很高的光热转换效率；
32.(4)本发明合成的黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)可以用作药物载体，cys-pdsa遇到谷胱甘肽(glutathione，gsh)会发生还原反应，使黑磷-半胱氨酸纳米复合物释放出包裹在内的黑磷量子点和抗肿瘤药物，从而达到光热治疗与化疗的协同作用。
附图说明
33.图1为实施例1中bpqds和bpqd/cys-8e nps的tem图、粒径分布图、afm图、拉曼谱和uv-vis谱；
34.图2为实施例2中bpqd/cys-8e nps的稳定性，其中(a)相同数量bpqds(20μg/ml)的bpqds和bpqd/cys-8e在水中存储后第0天和第8天的照片(左:bpqds，右:bpqd/cys-8e)，20μg/ml的(b)bpqd/cys-8e nps和(c)bpqds在水中保存不同时间后的紫外可见光谱，(d)nir诱导不同浓度bpqd/cys-8e水分散体的产热情况，(e)bpqd/cys-8e溶液在5次近红外激光开/关循环下的温度曲线，(f)高效液相色谱法测定bpqd/cys8e/ptx(紫杉醇)的ptx释放谱；
35.图3为实施例3中基于bpqd/cys-8e nps的光热oct成像，其中(a)pt-oct系统的示意图，(b)含有不同浓度bpqd/cys-8e nps的2％(w/v)琼脂糖凝胶的pt-oct b型扫描图，(c)注射了bpqd/cys-8e nps的小鼠肿瘤在0、8、12、24和48h后的典型pt-oct b型扫描，(d)注射了bpqd/cys-8e nps24 h后的肿瘤pt-oct图像以及在不同深度(300、450、600、750、900、1050、1200和1350μm)肿瘤相应截面的pt-oct图像(比例尺：1mm)，(e)肿瘤区域的三维pt-oct图像的俯视图(比例尺：1mm)；
36.图4为实施例4中bpqd/cys-8e nps的体外抗肿瘤作用，其中(a)hepg2细胞、h1650细胞、nih-3t3细胞和4t1细胞与bpqd/cys-8e nps(bpqds浓度为0、2、5、10、20、50和100μg/ml)孵育24h后的相对活力情况，(b)各种处理后的hepg2细胞的相对存活率；
37.图5为实施例5中体内抗肿瘤实验，其中(a)小鼠治疗后的肿瘤生长曲线(第一组：对照，第二组：对照 激光，第三组：ptx(紫杉醇)，第四组：bpqd，第五组：bpqd/cys8e 激光，第六组：bpqd/cys-8e/ptx 激光)，(b)各组小鼠的平均体重。(c)不同组别小鼠的肿瘤照片。小鼠在治疗结束时(第18天)的照片。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解
和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
39.实施例1
40.本实施例提供的黑磷-半胱氨酸纳米复合物的合成方法，包括以下步骤：
41.(1)将30mg的黑磷(bp)粉末分散在30ml的n-甲基-2-吡咯烷酮(n-methyl-2-pyrrolidone,nmp)中，用超声细胞破碎仪超声6h，工作条件为：超声探头工作5s，间隔4s，功率为750w；接着将功率改为300w，在冰浴条件下对上述溶液进行过夜(约12h)处理，随后让产物离心，7000rpm，20min；轻轻倒出含有黑磷量子点(bpqds)的上清液；让上清离心，13000rpm，45min，去除nmp，最后用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,dmso)反复冲洗沉淀，用dmso重悬待进一步使用，即获得黑磷量子点(bpqds)悬液；
42.(2)将l-胱氨酸二甲酯二盐酸盐((h-cys-ome)2·
2hcl)(10mmol)和三乙胺(15mmol)溶解于dmso(20ml)中，缓慢加入癸二酰氯(10mmol)的dmso溶液(10ml)，将溶液搅拌15min，得到均匀的混合物，然后加入250ml的冷乙醚沉淀两次，真空干燥，得到疏水的半胱氨酸-聚二硫酰胺聚合物(cysteine-based poly-(disulfide amide)polymers,cys-pdsa，也可以称为cys-8e)；
43.(3)将80μl bpqds悬液(dmso，1mg/ml)、20μlcys-pdsa(20mg/ml)和20μl1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-poly(ethyleneglycol)，20mg/ml)溶解于dmso中形成均匀的溶液，得黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)粗品，在搅拌器剧烈搅拌(1200rpm)下，将粗品滴入水中(4ml)，得分散液，然后将分散液转移到离心过滤器中，离心纯化3次以备后续使用，制得黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)。
44.将黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)冷冻干燥后，制得黑磷-半胱氨酸纳米颗粒(bpqd/cys-8enps)。
45.步骤(1)中黑磷量子点(bpqds)悬液的透射电子显微镜(tem)分析(图1中a图)显示，黑磷量子点(bpqds)悬液中的bpqds是相对单分散的。
46.通过对图1中b图中100个bpqds进行统计分析，可知其横向尺寸为2.8
±
0.5nm(图1中c图)。
47.bpqds的高分辨率tem(hrtem)图像(图1中d图)显示，bpqds结晶良好，晶格条纹为0.34nm，属于bp晶体的(021)晶面。
48.bpqds的原子力显微镜(afm)图像(图1中e图和图f图)显示，bpqds的高度范围为1.3～2.5nm。
49.bpqds及bpqd/cys-8e nps(测量的时候用悬液)的uv-vis-nir光谱(图1中h图)显示，bpqds和bpqd/cys-8e nps在uv-nir区域均表现出典型的宽吸收带，适合于光热治疗。
50.bpqds和bpqd/cys-8e nps的拉曼光谱(图1中i图)显示，两者都有三个明显的峰，对应一个面外声子模式和两个面内声子模式(和)，这表明了bp纳米结构的晶体特征。电感耦合等离子体-质谱法测bpqds的包封率和包封率分别为15.1％和90.38％。当量子点数量减半时，封装效率达到97.8％。
51.实施例2
52.实施例1中制备的黑磷-半胱氨酸纳米复合物(bpqd/cys-8e)粗品分散在水溶液中的颜色和在808nm波长的近红外光吸收与裸露的bpqds几乎相同(图2中a图-c图)，而bpqd/
cys-8e nps在水溶液中的稳定性优于bpqds(图2中a图)。
53.将(20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)bpqd/cys-8e分散液暴露在808nm(2w/cm2)连续波光纤耦合二极管近红外激光器中10分钟，以测量bpqd/cys-8e的近红外光吸收，从而评估bpqd/cys-8e的光热效应。
54.图2中d图显示了浓度依赖的bpqd/cys-8e nps的快速温升过程，当溶液浓度为80μg/ml时，10min后溶液温度升高59℃。相比之下，近红外激光照射同样时长后，水只增加了3.5℃。bpqd/cys-8e nps在5次重复的近红外激光开/关循环下也表现出了优异的光热稳定性(图2中e图)。与此同时，cys-8e表现出良好的药物装载效率和敏感的gsh响应型ptx释放(图2中f图)。
55.实施例3
56.如图3中a图所示，采用超辐射发光二极管(1310nm)和泵激光器(532nm)分别作为oct光源和光热激发光源，研制了轴向分辨率为13.8μm、横向分辨率为17.5μm的pt-oct成像系统。
57.图3中b图为浓度分别为0、6.25、12.5、25、50和100μg/ml的含有bpqd/cys-8enps(冷冻干燥后用天平称量)的2％(w/v)琼脂糖凝胶的pt-oct图像。结果表明，随着琼脂糖凝胶中bpqds浓度的增加，pt-oct信号明显增加，其强度与纳米颗粒浓度之间呈线性关系，范围为0～100μg/ml。
58.然后，建立4t1乳腺癌balb/c小鼠模型。雌性balb/c小鼠购自中山大学实验动物中心，在中山大学实验动物中心批准的准则下使用。将2
×
106个4t1细胞悬浮在100μl pbs中，皮下注射到每只雌性balb/c小鼠的右背部。当携带4t1肿瘤的小鼠其肿瘤体积达到150mm3时，对其进行治疗。
59.将纳米颗粒通过静脉注射到小鼠体内，在不同时间点将小鼠放置于pt-oct系统中进行成像。图3中c图为在肿瘤组织被注入bpqd/cys-8e的0、8、12、24、48h后的pt-oct b型扫描图，从组织内部的光热信号可观察到肿瘤对纳米粒的摄取具有时间依赖性，且在注射24h后信号最强。随后，通过500次连续b-扫描，获得扫描区域(～3
×
3mm)的重建3d pt-oct图像，从而可以估计纳米材料在肿瘤中的立体分布(图3中d图)。图3中e图为注射bpqd/cys-8e nps后各时间点肿瘤3dpt-oct图像的俯视图。在第0h时仅观察到模糊图像，随着循环时间的增加，肿瘤组织的微观结构变得愈加清晰，直到24h达到最大清晰度。在24h时可以清楚地观察肿瘤组织的微血管，这揭示了纳米粒子主要积累在肿瘤微环境。
60.上述数据显著体现bpqd/cys-8e nps在pt-oct生物成像中的潜力。
61.实施例4
62.采用cck-8细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,cck-8)检测bpqd/cys-8enps(实施例1制备的)在人肝癌(hepg2)细胞、人类非小细胞肺癌(h1650)细胞、小鼠成纤维细胞(nih 3t3)和小鼠乳腺癌(4t1)细胞中的安全性。结果表明，即便bpqds在细胞内的浓度达到100μg/ml，其对两种类型的细胞均无明显毒性作用(图4中a图)。
63.图4为本实施例中bpqd/cys-8e nps的体外抗肿瘤作用，其中(a)图为hepg2细胞、h1650细胞、nih-3t3细胞和4t1细胞与bpqd/cys-8e nps(bpqds浓度为0、2、5、10、20、50和100μg/ml)孵育24h后的相对活力情况。(b)图为各种处理后的hepg2细胞的相对存活率。
64.将hepg2细胞和4t1细胞与纳米粒子孵育4h后，用808nm激光(2w/cm2)照射3min，然
后用cck-8法检测细胞活力。在图4中b图可以观察到三种治疗方式呈现药物剂量依赖性的抗癌效果，单纯受到激光照射的细胞存活率没有受到太大影响，光热加药物治疗的癌细胞存活率最小，这表明两种治疗之间有良好的协同作用。
65.通过流式细胞术分析，bpqd/cys-8e/ptx(ptx指的是紫杉醇)nps在相同药物浓度和激光照射24h(图4中c图)后的化疗-光热联合治疗效果也得到了证实。
66.实施例5
67.4t1携带肿瘤的小鼠被随机分为6组(每组n＝6)，尽量减少各组之间重量和肿瘤大小的差异，然后给小鼠尾部静脉注射100μl ptx、bpqd(实施例1中步骤(1)制备获得)、bpqd/cys-8e(实施例1中步骤(3)制备获得)、bpqd/cys-8e/ptx(将ptx是直接加入bpqd/cys-8e复合物的溶液，通过物理搅拌混合制得)，各组情况如下组成：pbs(对照，第一组)，激光(第二组)，ptx(第三组)，bpqd 激光(第四组)，bpqd/cys-8e 激光(第五组)，bpqd/cys-8e/ptx 激光(第六组)。100μl生理盐水含有ptx(1mg/kg)、bpqd(5mg/kg)、bpqd/cys-8e(bpqd浓度为5mg/kg)，bpqd/cys-8e/ptx(bpqd浓度为5mg/kg，ptx浓度为1mg/kg)的生理盐水被静脉注射到小鼠体内。对于第一组和第二组，小鼠用相同体积的pbs处理。4h后，用808nm的近红外激光照射小鼠，激光照射3min，功率密度为2w/cm2，各组balb/c小鼠在24h激光治疗后被采集肿瘤。
68.图5为实施例5中体内抗肿瘤实验，其中(a)小鼠治疗后的肿瘤生长曲线(第一组：对照，第二组：对照 激光，第三组：ptx，第四组：bpqd，第五组：bpqd/cys8e 激光，第六组：bpqd/cys-8e/ptx 激光)。(b)各组小鼠的平均体重。(c)不同组别小鼠的肿瘤照片。小鼠在治疗结束时(第18天)的照片。
69.被采集的肿瘤可用电子卡尺测量大小，各种治疗后的相对肿瘤体积曲线如图5中a图所示，据此判断bpqd/cys-8e/ptx 激光治疗组的小鼠体内抗肿瘤效果最佳，肿瘤逐渐缩小，完全治愈，只留下黑色结痂，更重要的是，未观察到肿瘤复发(图5中c图)，在18天的观察期内，i组和ii组小鼠的肿瘤生长迅速；与对照组相比，经ptx治疗的小鼠肿瘤的生长速度相当，这表明所给予ptx的剂量不足以抑制肿瘤生长；对于使用裸露的bpqds的小鼠，肿瘤生长没有得到有效抑制，这可能是由于在体内给药过程中裸露的bpqds部分降解；v组肿瘤最初被有效清除，但由于肿瘤细胞消融不完全，肿瘤有一定程度复发。
70.本发明通过引入抗癌药物紫杉醇，可以把纳米复合物、紫杉醇结合起来和单纯用紫杉醇做肿瘤治疗做对比，即第六组(bpqd/cys-8e/ptx 激光)和第三组(ptx)的比较，事实证明第六组的抗癌效果优于第三组，因此，本技术制备的材料bpqd/cys-8e为肿瘤的复合治疗提供了一种可借鉴的方式。
71.为了确定黑磷纳米复合物是否会使小鼠产生不良反应，每隔一天监测小鼠体重，如图5中b图所示，在18天的观察期内没有发现明显的体重下降。
72.因此，本发明通过在bpqds外做一层cys-pdsa修饰，利用bpqds的光热性质和cys-pdsa的化学性质，可以实现肿瘤的光热治疗与化疗协同作用。实际上，除了用cys-pdsa修饰bpqds，也可以用其他含有二硫键的化合物修饰，比如胱胺、3,3'-二硫代二丙酸，2,2'-二硫代二乙二醇等，只要能提高生物相容性以及被谷胱甘肽还原即可。
73.以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任
何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。