一种用于癌症治疗的多肽探针及其制备方法和应用

1.本发明涉及分子探针应用技术和癌症治疗领域，尤其涉及一种用于抑制、延缓和减轻癌症生长的多肽探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.如今，纳米药物是纳米技术与医学相结合所生成的新兴产物，作为诊断、治疗和预防肿瘤与免疫性疾病等的新型药物之一。因纳米药物经静脉注射后在肿瘤和炎症部位具有聚集性，故研究人员正在将其推广至肿瘤治疗领域。基于纳米技术的纳米药物具有多样性、靶向性、缓释性、肿瘤部位聚集性和生物相容性好的特点，因而其相较于传统药物具有更高的治疗效率。然而，当纳米药物成功地通过靶向肿瘤细胞的屏障时，在它们能够对最终的亚细胞靶点发挥治疗作用之前，还存在溶酶体陷落的关键难题。具体而言，对于大多数纳米药物而言，它们是借助于活性摄取机制被细胞内化。同时，控制纳米药物摄取的内吞作用涉及细胞膜内陷，而细胞膜内陷后形成内涵体，最终演化为溶酶体。由于溶酶体(ph≈5.0)且富含60多种水解酶，如果纳米药物在溶酶体中长期隔离，则会使纳米药物所包载的如脂质、蛋白质和核酸在囊泡循环过程中降解或丢失。
3.为了避免纳米药物被溶酶体降解，现有技术中已经报道了许多实现溶酶体逃逸的方法。例如，采用阳离子聚合物或组氨酸修饰纳米药物，利用质子海绵效应通过螯合质子引起的氯离子和水分子的流入。导致溶酶体膨胀和破裂；又如通过细胞穿透肽的修饰可以降低张力，从而在脂膜上形成一个孔，从而实现溶酶体逃逸。此外，通过在纳米药物中引入光敏剂，以在光照下产生活性氧(ros)诱导脂质过氧化，进而提高溶酶体膜的通透性，从而释放溶酶体中的物质。虽然上述修饰方法能够促使纳米药物从溶酶体中逃逸，但上述方法中纳米药物从溶酶体中逃逸的时间长，且纳米药物从溶酶体中逃逸时对细胞器破坏的影响尚未完全阐明。更为关键的是纳米药物仍然需要进入溶酶体，然后逃离溶酶体，因而无法最大效力的发挥出治疗效果。因此，需要开发能够使纳米药物绕开溶酶体降解的新策略，以最大限度地发挥药物的效用成为本领域亟待解决的技术难题。


技术实现要素：

4.基于此，本发明提出一种用于癌症治疗的多肽探针及其制备方法和应用。
5.为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
6.本发明提供的一种式i所示结构的化合物：
[0007][0008]
根据本发明的实施方案，式i所示结构的化合物由多肽pal和多肽kp部分组成。
[0009]
优选地，所述多肽kp包括两个线性肽序列(ggk(mal)gggpapra-nh2和klaklakcgkrk-nh2)，从而形成四个活性位点，第一个位点通过基质金属蛋白酶(mmp-2)反应性肽段与多肽pal-gggh部分连接；第二个位点用聚集诱导发光分子(aiegen)pytpa修饰，用于图像引导光动力疗法(pdt)；第三个位点和第四个位点确保抗菌肽klaklakklaklak和归巢肽cgkrk的活性。
[0010]
其中，klaklakklaklak抗菌肽可破坏线粒体膜，归巢肽cgkrk可以靶向特定细胞。
[0011]
本发明还提供上述如式ⅰ所示结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：包括将化合物1与具有聚集诱导发光效应的分子pytpa反应，制备得到上述如式ⅰ所示结构的化合物；
[0012]
所述化合物1具有如下结构：
[0013][0014]
根据本发明的实施方案，所述化合物1与具有聚集诱导发光效应的分子pytpa的物质的量之比为1:2-1:5。
[0015]
根据本发明的实施方案，所述制备方法可以在溶剂存在下进行。例如，先将化合物1溶于水(例如无菌水)中，将具有聚集诱导发光效应的分子pytpa溶解于二甲基亚砜中，再将两种溶液混合反应，得到式ⅰ所示结构的化合物。
[0016]
根据本发明的实施方案，所述反应可以在催化剂存在下进行。例如，在抗坏血酸钠和溴化亚铜的催化作用下进行。
[0017]
优选地，所述式i所示结构的化合物与抗坏血酸钠的物质的量之比为1：2-1:10。
[0018]
优选地，所述式i所示结构的化合物与溴化亚铜的物质的量之比为1：2-1:10。
[0019]
根据本发明的实施方案，所述反应的时间为不低于24h。
[0020]
本发明通过将化合物1(多肽pk)用无菌水溶解，将pytpa用二甲基亚砜溶解，二甲基亚砜能够很好地溶解pytpa，而无菌水可以防止pk被细菌降解；溴化亚铜提供亚铜离子催化反应高效进行；而抗坏血酸钠是为了避免亚铜离子被氧化。本发明对反应的温度没有特别限定，在室温反应即可。上述反应是利用叠氮与炔基的加成来合成产物多肽聚集体探针
的。
[0021]
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括待反应结束后，对反应产物进行纯化的步骤。例如，所述纯化可以采用hplc法分离。
[0022]
优选地，所述式i化合物的合成路线如下：
[0023][0024]
根据本发明的实施方案，所述化合物1由如下方法制备得到，包括：将多肽pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)与多肽klaklakklaklakcgkrk-nh2进行反应，得到化合物1。
[0025]
优选地，多肽pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)与多肽klaklakklaklakcgkrk-nh2的物质的量之比为1:(0.5～2)，示例性为1：0.5、1：1、1：2。
[0026]
优选地，所述磷酸缓冲盐溶液的ph为7.4，反应时间为不超过于24h。
[0027]
优选地，所述制备方法可以在溶剂存在下进行。例如，先将多肽pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)溶于二甲基亚砜中，将多肽klaklakklaklakcgkrk-nh2溶解于磷酸缓冲盐中，再将两种溶液混合反应，得到化合物1。
[0028]
本发明通过将多肽pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)溶解于二甲基亚砜溶剂，将多肽klaklakklaklakcgkrk-nh2用磷酸缓冲盐溶液(ph 7.4)溶解。其中，二甲基亚砜溶剂能够很好溶解多肽，磷酸缓冲盐溶液可以防止多肽klaklakklaklakcgkrk-nh2的马来酰亚胺基团开环。上述反应是利用巯基与马来酰亚胺的迈克尔加成来合成产物多肽(化合物1)。为了避免巯基被氧化成二硫键，并确保反应充分进行，一般应控制反应时间不低于1h。
[0029]
优选地，所述多肽pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)与多肽klaklakklaklakcgkrk-nh2的反应在还原剂作用下进行。例如，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦(tcep)。
[0030]
优选地，所述还原剂与多肽pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)的物质的量之比为1:2-1:4。
[0031]
优选地，所述肽pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)与多肽
klaklakklaklakcgkrk-nh2的反应在惰性气体保护下进行。例如，所述惰性气体为氮气、氩气中的至少一种。通过在惰性气体保护下反应，可以更加有效地避免巯基被氧化。
[0032]
优选地，所述制备方法还包括待反应结束后，对反应产物进行纯化的步骤。例如，所述纯化可以采用hplc法分离。
[0033]
优选地，所述化合物1的合成路线如下：
[0034][0035]
根据本发明的实施方案，所述如式ⅰ所示结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0036]
步骤s1：将多肽pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)用二甲基亚砜溶液溶解，多肽klaklakklaklakcgkrk-nh2用磷酸缓冲盐溶液溶解，二者混合后加入三(2-羧乙基)膦(tcep)还原剂，然后在氮气保护下室温反应，通过纯化，得到化合物1(多肽中间产物pk)；
[0037]
步骤s2：将化合物1(多肽中间产物pk)溶解于水，具有聚集诱导发光效应的分子pytpa用二甲基亚砜溶解，二者混合后加入溴化亚铜和抗坏血酸钠催化剂，然后在氮气保护下室温搅拌反应，通过纯化，得到式ⅰ所示结构的化合物。
[0038]
本发明还提供如式i所示结构的化合物在制备荧光探针中的应用。优选地，所述荧光探针具有线粒体靶向效果和高效的活性氧产生能力，能够用于肿瘤细胞特异性靶向治疗。
[0039]
本发明还提供一种探针，其含有如式i所示结构的化合物。
[0040]
本发明还提供上述如式i所示结构的化合物和/或探针在制备治疗癌症药品中的应用，优选在制备应用于生物体系环境下的治疗癌症药品中的应用。
[0041]
根据本发明的实施方案，所述癌症包括人脑胶质瘤。
[0042]
本发明还提供了一种试剂盒，其包含上述探针。
[0043]
本发明还提供了一种生物传感器，其包含上述探针。
[0044]
本发明的有益效果是：
[0045]
(1)本发明提供的一种用于癌症治疗的多肽探针，该多肽探针(pkp)在肿瘤微环境中高表达的mmp-2刺激下分为多肽pal部分和多肽kp两部分，其中多肽pal部分迅速进入癌细胞并在溶酶体中形成纳米纤维，而kp部分包括两个线性肽序列(ggk(mal)gggpapra-nh2和klaklakcgkrk-nh2)从而形成四个活性位点，第一个位点通过基质金属蛋白酶(mmp-2)反应性肽段plglag与pal部分连接；第二个位点用聚集诱导发光荧光分子(aiegen)pytpa修饰，用于图像引导光动力疗法(pdt)；第三和第四个位点确保抗菌肽klaklakklaklak和归巢肽cgkrk的活性，klaklakklaklak是一种抗菌肽，可破坏线粒体膜，cgkrk可在特定细胞中聚集，因而会缓慢进入癌细胞；同时由于纳米纤维会刺激蛋白磷酸酶2a(pp2a)的减少，而kp部分的内吞途径从网格蛋白介导的内吞(cme)转换为胞膜窖介导的内吞(cvme)，从而可以避免探针被困在溶酶体中并到达线粒体进而通过光动力疗法(pdt)杀死癌细胞，以实现癌症治疗的目的。本发明解决了传统纳米药物递送时效率差、且易被溶酶体降解的问题。同时本发明的多肽探针还具有传递效率高、靶向能力强等特点，可以进行pdt癌症治疗(图1)。
[0046]
(2)本发明提供的一种用于癌症治疗的多肽探针的制备方法具有工艺简单、操作方便和成本低廉等特点。
[0047]
(3)本发明提供的多肽探针表现出优异的癌症治疗效果，克服了纳米药物进入细胞后被溶酶体降解的问题；同时具有优异的聚集诱导发光效应，可以实现治疗性多肽的荧光追踪成像，且本发明探针的合成步骤简单、原料廉价易得，在癌症治疗领域中有着巨大的应用前景。
[0048]
(4)本发明的探针通过引入多肽部分，可极大地提高临床使用纳米药物的治疗效果，以应用于生物环境下的癌症治疗，特别是应用于人脑胶质瘤的治疗，具有很好的细胞内化能力和优异的治疗效果，在治疗癌细胞死亡方面具有良好的作用，并促进个性化治疗的发展，因而在癌症治疗领域有着巨大的应用前景。
附图说明
[0049]
图1为本发明改变细胞内吞途径，从网格蛋白介导的内吞(cme)转化为胞膜窖介导的内吞(cvme)，从而避免被困在溶酶体中并到达线粒体进而通过光动力疗法破坏线粒体膜并杀死癌细胞的示意图。
[0050]
图2为本发明的一种用于癌症治疗的多肽探针的合成路线图。
[0051]
图3为本发明实施例1提供的多肽探针的质谱表征图。
[0052]
图4为本发明实施例1提供的多肽探针pkp经mmp-2酶切后形成lag-kp的质谱表征图。
[0053]
图5为本发明实施例1提供的多肽探针pkp经mmp-2酶切前、后形貌变化透射电镜照片图。
[0054]
图6为本发明实施例1提供的多肽探针生成活性氧(ros)能力的试验结果图。
[0055]
图7为本发明实施例1提供的多肽探针孵育人脑胶质瘤细胞u87 mg的共聚焦显微照片图。
[0056]
图8为本发明实施例1提供的多肽探针改变细胞内吞途径的试验结果图；
[0057]
图9为本发明实施例1提供的多肽探针在细胞内和溶酶体的共定位试验的结果图。
[0058]
图10为本发明实施例1提供的多肽探针能够减少细胞内蛋白磷酸酶2a(pp2a)的实验结果图。
[0059]
图11为本发明实施例1提供的多肽探针和人脑胶质瘤细胞u87 mg共孵育后的生物透射电镜照片图。
[0060]
图12为本发明实施例1提供的多肽探针在细胞水平上治疗效果的结果图。
[0061]
图13为本发明实施例1提供的多肽探针在肿瘤生物模型中试验治疗效果的结果图。
具体实施方式
[0062]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。
[0063][0064]
下面结合实施例对本发明提供一种用于癌症治疗的多肽探针及其制备方法与应用进行详细说明。
[0065]
实施例1：
[0066]
1、多肽探针的合成(如图2)：
[0067]
在10ml圆底烧瓶中，加入pal(palggghgplglagggkgggpapra-nh2)(29.3mg,15μmol),klaklakklaklakcgkrk-nh2(20.9mg,10μmol),三(2-羧乙基)膦(1.4mg,5μmol)，二甲基亚砜2ml，磷酸缓冲盐溶液2ml，在氮气氛围保护下，室温搅拌反应24h，得到粗产物，经高效液相色谱以2ml/min的速度纯化，溶剂b从20％到100％的梯度洗脱50分钟，其中溶剂a为水(含0.1％三氟乙酸溶液)，溶剂b为乙腈(含0.1％三氟乙酸溶液)。纯化后冷冻干燥，得到中间产物多肽pk(20.5mg,产率:51％)。
[0068]
在10ml圆底烧瓶中加入pytpa(6.8mg,10μmol),中间产物多肽pk(20.3mg,5μmol),溴化亚铜(1.5mg,10μmol)，抗坏血酸钠(2.0mg,10μmol)，二甲基亚砜2ml，纯水2ml，在氮气氛围保护下，室温搅拌反应24h，得到粗产物，经高效液相色谱以2ml/min的速度纯化，溶剂b从20％到100％的梯度洗脱50分钟，其中溶剂a为水(含0.1％三氟乙酸溶液)，溶剂b为乙腈(含0.1％三氟乙酸溶液)。纯化后冷冻干燥，得到产物多肽探针pkp(12.1mg,产率:52％)。
[0069]
本实施例制得的多肽探针pkp经高分辨质谱表征，结果如图3所示，图中结果证实了该探针制备成功。
[0070]
hrms(esi)m/z:[m 4h]
4
计算值：1163.9493，实测值：1164.2028；[m 5h]
5
计算值：931.3609，实测值：931.5638；[m 6h]
6
计算值：776.3020，实测值：776.4714；[m 7h]
7
计算值：665.5456，实测值：665.6905；[m 8h]
8
计算值：582.4783，实测值：582.7300；[m 9h]
9
计算值：517.8704，实测值：518.0941；[m 10h]
10
计算值：466.1841，实测值：466.2856。
[0071]
2、多肽探针经mmp-2酶切前后形貌变化的测定实验：
[0072]
对实施例1制备得到的多肽探针在mmp-2酶切前后的透射电子显微镜成像前。首先，我们通过质谱对多肽探针pkp是否可以被mmp-2酶切进行了表征。具体方法如下：
[0073]
(1)在mmp-2中加入缓冲液(0.05％聚氧乙烯十二烷基醚，0.05％氯化钙，0.79％三(羟甲基)氨基甲烷，1.17％氯化钠，ph 7.4)配制成0.25mg/ml的溶液，并加入2.5mm 4-乙酸汞基苯胺，然后在37℃下水浴2h使得mmp-2酶活化；
[0074]
(2)将多肽探针溶液(1.0mm)与步骤(1)中活化后的mmp-2酶溶液混合，使得多肽探针和mmp-2的最终浓度分别为100μm和0.1mg/ml，然后将其置于37℃水浴锅中培养8h；
[0075]
将步骤(2)制得的混合溶液通过高效液相色谱进行分离纯化，经冷冻干燥后得到mmp-2刺激后形成的多肽产物kp部分和pal，并对其进行质谱表征，结果如图4所示。图中结果表明：本发明的探针成功被mmp-2酶切，并得到多肽产物kp部分。
[0076]
接下来，我们对多肽探针pkp在mmp-2酶切前后的产物进行透射电子显微镜成像，具体方法如下：
[0077]
首先，将实施例1中的多肽探针pkp以及上述经过mmp-2在37℃水浴锅中培养8h的pkp探针分别滴在铜网上，持续1分钟，然后再用滤纸去除多余的液体。接下来，分别将10μl磷钨酸溶液(质量浓度1％)滴在铜网上，以分别使样品染色1分钟，之后用移液器去除大部分磷钨酸溶液，并用去离子水清洗铜网三次，最后将铜网置于透射电子显微镜下进行成像。探针pkp经mmp-2刺激响应前、后的形貌变化如图5所示，图中结果表明：多肽探针(pkp)在肿瘤微环境中高表达的mmp-2刺激下会分为多肽pal和多肽kp两部分，其中多肽pal部分会迅速进入癌细胞并在溶酶体中形成纤维状。
[0078]
3、多肽探针在溶液里生成ros能力的测定实验：
[0079]
实施例1制备的多肽探针在pbs缓冲液体系中的ros生成能力，具体实验方法如下：
[0080]
配制浓度为5μm的多肽探针的pbs溶液(ph 7.4)，并加入100μm 9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(abda)ros指示剂，然后在白光强度为20mw cm-2
照射下每30秒测试一次溶液的荧光发射光谱，持续5分钟，在不同的光照时间内，记录abda在378nm处的吸光度。测试结果如图6所示，表明多肽探针具有良好的光动力效果。
[0081]
4、多肽探针在细胞中内化能力的测定试验：
[0082]
将实施例1制备的多肽探针pkp与人脑胶质瘤细胞u87 mg共孵育，然后进行共聚焦显微镜成像，具体实验方法如下：
[0083]
首先，将人脑胶质瘤细胞u87 mg以1
×
105密度传代到含有dulbecco's modified eagle medium(dmem)生长培养基的玻璃底细胞培养皿中。培养24h后，用pbs洗涤细胞两次。然后在玻璃底细胞培养皿中加入1ml 5μm多肽探针，并在37℃、5％二氧化碳培养箱中培养1h、4h、12h和24h。待培养结束后，取出培养玻底皿，去除上清液，之后用pbs轻轻洗涤细胞两次，并在光学成像前浸没在dmem生长介质中，并使玻璃底培养皿进行荧光共聚焦成像，结果如图7所示。细胞荧光成像仪器所用为zeiss lsm 880共聚焦显微镜，激发波长为488nm。实验结果可以看出，在共聚焦显微镜成像中呈现明显的红色荧光，这表明探针可被细胞吸收，由此表明本发明多肽探针具有良好的细胞内化的能力。
[0084]
5、多肽探针改变细胞内吞途径的实验：
[0085]
将人脑胶质瘤细胞u87 mg以1
×
105密度传代到含有dmem生长培养基的玻璃底细
胞培养皿中，分为四组对照实验，其中一组作为空白组(blank，不添加抑制剂)，另外三组分别各自加入三种抑制剂chlorpromazine(cpz抑制网格蛋白介导的内吞)10μg/ml、eipa(抑制巨胞饮)10μg/ml和filipin(抑制胞膜窖介导的内吞)1μg/ml，并在37℃、5％二氧化碳培养箱中共同培养30分钟。随后再加入5μm pkp或者经过mmp-2酶切后的产物kp部分，经培养24h后，用pbs洗涤细胞两次。待培养结束后，取出玻璃底培养皿，去除上清液，之后用pbs轻轻洗涤细胞两次，并在光学成像前浸没在dmem生长介质中，并使玻璃底培养皿进行荧光共聚焦成像(图8上)，同时计算出抑制剂对细胞内吞的抑制率为(1-不同组的荧光强度/空白组的荧光强度)
×
100(图8下)。实验结果如图8所示，pkp在filipin的作用下，荧光强度明显减少，抑制率可以达到52％；而kp部分在cpz的作用下，荧光强度明显减少，抑制率可以达到46％。这些结果说明：本发明的多肽探针pkp在pal形成的纤维的作用下有效改变了细胞的内吞通路，即使探针由网格蛋白介导的内吞(cme)转化为胞膜窖介导的内吞。
[0086]
6、多肽探针在细胞内和溶酶体的共定位实验：
[0087]
将人脑胶质瘤细胞u87 mg以1
×
105密度传代到含有dmem生长培养基的玻璃底细胞培养皿中，然后在玻璃底细胞培养皿中均加入1ml 5μm pkp多肽探针或者经过mmp-2酶切后的产物kp部分培养24h，随后用lysotracker(一种红色溶酶体荧光探针)100nm共孵育30分钟，经培养后，用pbs洗涤细胞两次，待培养结束后，取出培养玻底皿，去除上清液，之后用pbs轻轻洗涤细胞两次，并在光学成像前浸没在dmem生长介质中，并使培养玻底皿进行荧光共聚焦成像，实验结果如图9所示，图中结果说明：本发明pkp在pal纤维的作用可以避免进入溶酶体而直接进入线粒体。
[0088]
7、多肽探针在细胞内影响pp2a的实验：
[0089]
将人脑胶质瘤细胞u87 mg以1
×
105密度传代到含有dmem生长培养基的玻璃底细胞培养皿中，然后将u87 mg细胞与多肽探针pkp(1ml 5μm)或者经过mmp-2酶切后的产物kp部分一起培养24h，之后在4％多聚甲醛中固定10分钟，然后用pbs清洗细胞三次，并用1％聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)渗透10分钟，接下来，用pbs清洗细胞三次，并用1％牛血清白蛋白孵育30分钟，此外，使细胞在室温下与pp2a的一抗孵育1h，用pbs洗涤后，将细胞与相应的荧光二抗(dylight 649)在室温下孵育1h，最后，用pbs洗涤细胞三次，并用激光共聚焦显微镜成像，细胞荧光成像仪器所用为zeiss lsm 880共聚焦显微镜，激发波长为633nm。结果如图10所示，图中结果说明：多肽pal可以有效减少细胞内pp2a的形成。
[0090]
8、多肽探针对癌症治疗的实验：
[0091]
8.1实施例1制备的多肽探针与人脑胶质瘤细胞u87 mg共孵育后的生物透射电镜成像，具体实验方法如下：
[0092]
将人脑胶质瘤细胞u87 mg以1
×
105密度传代到含有dmem生长培养基的玻璃底细胞培养皿中，然后将u87 mg细胞与多肽探针pkp(1ml 5μm)一起培养24h，之后在3％戊二醛中过夜固定24h，然后用pbs(0.01m)洗涤细胞三次，并进一步用含1％锇酸的pbs固定2h，用pbs溶液洗涤后，用梯度系列的乙醇(30％，50％，70％，80，85，90％)脱水15分钟，95％丙酮脱水15分钟，100％丙酮脱水两次15分钟，随后，使用丙酮/epon 812树脂混合物(2:1)渗透12h，然后，将u87 mg细胞转移到明胶胶囊中，在60℃下固化48h，将u87 mg细胞切片，并用formvar膜(300目)连接到铜网格上，最后，将切片分别用2％醋酸铀和2％柠檬酸铅染色30分钟。并使用透射电子显微镜仪器进行观察，实验结果如图11所示，通过生物透射电镜成像
分析，在与pkp孵育的肿瘤细胞中观察到纳米纤维的形成和线粒体膜的破坏，说明纤维的形成刺激了pkp多肽探针有效的到达线粒体而不是被溶酶体包裹，因而具有优异的定位效果，进而可杀伤癌细胞，具有良好的治疗效果。
[0093]
8.2多肽探针在细胞水平上治疗效果的试验：
[0094]
首先，将人脑胶质瘤细胞u87 mg以1
×
104密度传代到96孔板中，24h后，分别将2μm、5μm、10μm、20μm的多肽探针pkp溶液或者经过mmp-2酶切后的产物kp部分以及磷酸盐缓冲液(pbs)加入96孔板中，每个浓度设置5个复孔；孵育12h后，暴露于白光(light，200-1000nm，200mw/cm-2
)下10分钟，继续培养12h，然后将mtt试剂(溶解在磷酸盐缓冲盐水中，5mg/ml)加入每个孔中。将细胞进一步培养4h。然后除去每个孔中的培养基，并用150ml二甲亚砜替换。将96孔板轻轻震荡15分钟，然后通过酶标仪记录570nm处的吸光度(od)，相对细胞存活率计算如下：细胞存活率＝(od
样品
/od
空白
)
×
100，结果如图12所示。从图12中结果可以看出，多肽探针对人脑胶质瘤细胞u87 mg具有很好的治疗效果，可对癌细胞进行有效杀伤。在20μm的浓度条件下，人脑胶质瘤细胞u87 mg存活率低于20％。
[0095]
8.3多肽探针在肿瘤生物模型中治疗效果的试验：
[0096]
雌性balb/c裸鼠(4周龄，体重约20g)购自中国北京维生河实验动物技术有限公司。动物护理和处理程序与华中科技大学同济医学院伦理委员会评价和批准的指南一致。小鼠瘤周注射u87 mg细胞(3
×
106)，第15天，将荷瘤裸鼠每隔一天在肿瘤周围皮下分别注射100μl磷酸盐缓冲液(pbs)溶液、溶于pbs中的多肽探针pkp(200μm)或者经过mmp-2酶切后的产物kp部分(200μm)，24h后，将小鼠暴露于白光(light，200-1000nm，200mw/cm-2
)下10分钟，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积为(肿瘤长度)
×
(肿瘤宽度)2/2，相对肿瘤体积计算为v/v0(v0为治疗开始时的肿瘤体积)。实验结果如图13所示，图中结果表明：本发明的探针pkp对于生物体内肿瘤也具有良好的治疗效果。
[0097]
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
[0098]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。