一种作为荧光探针的化合物及其合成方法和应用与流程

1.本发明涉及荧光探针技术领域，具体的说，涉及了一种作为荧光探针的化合物及其合成方法和应用。


背景技术：

2.铜离子(cu
2
)是人体中含量第三丰富的过渡金属元素。它在细胞呼吸、肽酰胺化、神经递质生物合成、色素形成和结缔组织强度等方面发挥着重要的生化和生理功能。铜离子作为酶的主要代谢中心，对铜、锌超氧化物歧化酶(sod1)、细胞色素c氧化酶(cco)、铜蓝质酶(cp)、莱氨酸氧化酶(lox)、酪氨酸酶、多巴胺β羟化酶和肽酰甘氨酸α-氨基催化单加氧酶等酶的正常作用起着重要作用。但是当人体cu
2
失衡时，可能导致menkes disease(md)、wilson
′
s disease、alzheimer
′
s disease、parkinson s disease(pd)、朊病毒病等症状。因此开发一种能够深入人体组织器官且对人体无害的cu
2
检测方法，对疾病预防和治疗有着难以估量的价值。


技术实现要素：

3.本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种抑制剂药物前体化合物及其应用。
4.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种如式ⅰ所示的作为荧光探针的化合物，
[0005][0006]
本发明还提供一种式ⅰ所示的化合物的应用，该化合物作为检测铜离子的荧光检测探针。
[0007]
本发明还提供一种合成式ⅰ所示的化合物的方法，包括步骤：将5-(哌啶-1-基)噻吩-2-甲醛与4-二苯胺基苯甲醛在naoh溶液、无水乙醇的作用下，反应合成式i所示的化合物。
[0008]
基于上述，合成式ⅰ所示的化合物的方法包括步骤：向烧瓶中加入4-二苯胺基苯甲醛、5-(哌啶-1-基)噻吩-2-甲醛、naoh溶液、无水乙醇，在20℃～80℃下油浴回流反应10h～
20h合成式i所示的化合物；
[0009]
其中，4-二苯胺基苯甲醛与5-(哌啶-1-基)噻吩-2-甲醛的摩尔比为1：(0.1～0.9)，4-二苯胺基苯甲醛与naoh的摩尔比1:(3～5)。
[0010]
基于上述，合成式ⅰ所示的化合物的方法中，还包括将油浴回流反应后的物质冷却至室温后，加入蒸馏水并用乙酸乙酯萃取，再进行干燥、过滤、浓缩、柱层析的步骤。
[0011]
基于上述，合成式ⅰ所示的化合物的方法中，还包括以5-溴噻吩-2-甲醛为原料合成5-(哌啶-1-基)噻吩-2-甲醛的步骤。
[0012]
基于上述，以5-溴噻吩-2-甲醛为原料合成5-(哌啶-1-基)噻吩-2-甲醛的步骤包括：
[0013]
将5-溴噻吩-2-甲醛与蒸馏水、四氢呋喃、哌啶在氮气保护下油浴回流进行反应，冷却至室温后经萃取、干燥、浓缩，柱层析得到5-(哌啶-1-基)噻吩-2-甲醛；
[0014]
其中，5-溴噻吩-2-甲醛、哌啶的摩尔比为5.02:(10～15)。
[0015]
基于上述，合成式ⅰ所示的化合物的方法中，还包括在冰水浴条件下，向n,n-二甲基甲酰胺中加入1,2-二氯甲烷，然后恒滴加入三氯氧磷，并滴加2-溴噻吩进行加热回流反应，冷却至室温后用饱和naoh溶液调节ph至中性，最后经萃取、洗涤、干燥、过滤、浓缩、柱层析后，得到5-溴噻吩-2-甲醛的步骤；其中，n,n-二甲基甲酰胺、1,2-二氯甲烷、三氯氧磷、2-溴噻吩四者的体积比为20:30:(11～21):(0.5～3)。
[0016]
具体地，式ⅰ所示的化合物的核磁数据如下所示：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.87-7.83(m,3h),7.33-7.29(m,4h),7.16-7.09(m,7h),7.04-7.02(d,2h),6.92-6.88(d,2h),5.99-5.98(d,2h),3.29-3.26(t,4h),1.72-1.70(m,4h),1.63-1.62(m,2h).13c nmr(101mhz,cdcl3)δ187.67,162.87,151.42,146.80,137.86,135.50,131.88,129.65,129.52,125.71,125.11,124.26,120.40,114.16,104.17,51.28,25.02,23.67.hr-ms(esi):m/z calcd.for c
30h28
n2os[m h] 465.1995,found 465.1988。
[0017]
与现有技术相比，本发明具有突出的实质性特点和显著的进步，具体地说，本发明基于咔唑基设计合成的探针4b是对cu
2
具有很好识别和响应能力的探针，探针4b的荧光性质，探针本身在555nm处有荧光强峰，加入cu
2
后探针在此处的荧光完全淬灭，反应前后荧光变化了48倍，说明了探针对cu
2
具有良好的识别能力。
[0018]
进一步的，通过探针的荧光光谱可以发现，不同离子几乎不改变探针的光谱性质，cr
3
、fe
3
会在一定程度上降低荧光强度，但是并不能使探针荧光完全淬灭，而cu
2
却可以是探针荧光完全淬灭，这为区分fe
3
、cu
2
提供了一种新的方法。
[0019]
进一步的，通过紫外滴定和荧光滴定过程的线性拟合都说明探针4b对cu
2
反应具有高度灵敏性和稳定性，可以通过荧光的淬灭过程实现对cu
2
的量化检测且滴定过程中的检测限为7.32μm。
[0020]
进一步的，在ph为2-4范围内，探针本身的荧光随着ph的增加而增强。在ph为4-14范围内，ph的变化对探针本身的荧光没有影响。但在ph为8-12范围内，探针与cu
2
的反应速率减慢，反应量减少，反应后的探针不能完全淬灭；探针本身可以在ph为4-8的范围内对cu
2
产生响应，反应后探针能够完全淬灭，说明在4-8的ph范围内具有很好的响应能力。
附图说明
[0021]
图1为探针本身的紫外吸收和加入cu
2
后的响应。
[0022]
图2为探针本身与加入cu
2
后的荧光响应。
[0023]
图3为探针本身与不同金属离子的紫外吸收和加入cu
2
后的响应结果。
[0024]
图4为探针本身与加入不同金属离子和加入cu
2
后的荧光响应。
[0025]
图5为紫外吸收滴定曲线折线图。
[0026]
图6为探针在445nm处滴定过程中紫外吸收变化的线性拟合。
[0027]
图7为荧光滴定曲线。
[0028]
图8为探针在556nm处滴定过程中荧光强度变化的线性拟合(λex＝454nm)。
[0029]
图9为同ph值对探针4b荧光发射的影响及其与cu
2
的反应能力。
具体实施方式
[0030]
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
[0031]
本实施例提供一种如式ⅰ所示de作为荧光探针的化合物
[0032][0033]
本发明还提供一种式ⅰ所示的化合物的应用，该化合物作为检测铜离子的荧光检测探针。
[0034]
本发明提供一种合成式ⅰ所示的化合物的方法，包括以下步骤：
[0035]
5-溴噻吩-2-甲醛的合成：
[0036]
冰水浴条件下向100ml双口瓶中加入20.00ml258.7 mmol的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，加入30.00ml 1,2-二氯甲烷，恒滴加入18.00ml,193.0mmol的三氯氧磷，缓慢滴加2.00ml 20.00mmol的2-溴噻吩；
[0037]
薄层色谱(tlc)跟踪反应，回流6小时停止加热，冷却至室温，搅拌下倾入300.00ml冰水中，用饱和naoh溶液调节ph至中性，待冰完全融化后用3
×
30ml二氯甲烷萃取，饱和nacl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得到有苦杏仁味的淡黄色液体2.324g(在冰箱中冷冻后成为固体)，产率71.28％。
[0038]
5-(哌啶-1-基)噻吩-2-甲醛的合成：
[0039]
在5ml双口烧瓶中加入0.9551g5.020 mmol的5-溴噻吩-2-甲醛，20.00ml蒸馏水，5.00ml四氢呋喃(thf)，1.277g,15.00mmol的哌啶，氮气保护下油浴回流，tlc跟踪检测，22小时后反应完全。冷却至室温，用3
×
40ml乙酸乙酯萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)，得到淡黄色晶体0.5404g，产率55.35％。
[0040]
(e)-1-(4-(二苯胺)苯基)-3-(5-(哌啶-1-基)噻吩-2-基)丙-2-烯-1-酮的合成：
[0041]
在5ml小烧瓶中加入0.2652g1 mmol的4-二苯胺基苯甲醛，0.09765g,0.50mmol的5-(哌啶-1-基)噻吩-2-甲醛，2.00ml,2.5mol/l的naoh溶液，1.50ml无水乙醇，60度下油浴回流，tlc(pe:ea＝5:1)跟踪检测，15小时后反应完全，冷却到室温，加入5.00ml蒸馏水，用3
×
20ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，柱层析(pe:ea＝5:1)，得到0.1064g红色固体，产率45.90％。
[0042]
具体地，式ⅰ所示的化合物的核磁数据如下所示：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.87-7.83(m,3h),7.33-7.29(m,4h),7.16-7.09(m,7h),7.04-7.02(d,2h),6.92-6.88(d,2h),5.99-5.98(d,2h),3.29-3.26(t,4h),1.72-1.70(m,4h),1.63-1.62(m,2h).13c nmr(101mhz,cdcl3)δ187.67,162.87,151.42,146.80,137.86,135.50,131.88,129.65,129.52,125.71,125.11,124.26,120.40,114.16,104.17,51.28,25.02,23.67.hr-ms(esi):m/z calcd.for c30h28n2os[m h] 465.1995,found 465.1988。
[0043]
其中，探针(e)-1-(4-(二苯胺)苯基)-3-(5-(哌啶-1-基)噻吩-2-基)丙-2-烯-1-酮(1.0
×
10-3mol
·
l-1)标准液的配置：
[0044]
准确称量4.6mg探针(e)-1-(4-(二苯胺)苯基)-3-(5-(哌啶-1-基)噻吩-2-基)丙-2-烯-1-酮于10ml小烧杯中，加入3ml色谱纯dmso使固体溶解后，用玻璃棒引流至10ml容量瓶中，用5ml色谱纯dmso洗涤小烧杯和玻璃棒3次，洗涤液转移至10ml容量瓶中，定容，摇匀，备用。
[0045]
试验验证
[0046]
1、探针(e)-1-(4-(二苯胺)苯基)-3-(5-(哌啶-1-基)噻吩-2-基)丙-2-烯-1-酮对cu
2
的识别
[0047]
1.1、光谱性质研究
[0048]
探针在ch3cn：hepes(95:5,v/v,10mm,ph＝7.4)体系中与cu
2
反应的紫外性质和荧光性质如图1、图2所示。
[0049]
从图中可以看出，探针本身在454nm处有强紫外吸收，加入10eq的cu
2
后该处的吸收峰消失，在355nm处出现一个小的肩峰。随后探究了探针4b的荧光性质，探针本身在555nm处有荧光强峰，加入cu
2
后探针在此处的荧光完全淬灭，反应前后荧光变化了48倍，说明了探针对cu
2
具有良好的识别能力。
[0050]
1.2、选择性与干扰性
[0051]
为探究探针4b对不同金属离子的选择性，探究了探针4b在紫外光谱和荧光光谱与14种金属离子的选择。如图3、图4所示，不同的金属离子na

、k

、ni

、ag

、ca
2
、mg
2
、cd
2
、co
2
、hg
2
、zn
2
、cr
3
、al
3
并不能改变探针在455nm处的吸收强度。
[0052]
当加入fe
3
后，探针455nm处的吸收强度并没有改变但在355nm处出现一个小的肩峰。加入cu
2
后，探针455nm处的吸收强度显著降低，同时在355nm处出现一个与fe
3
相似的小的肩峰。
[0053]
如图4所示为探针的荧光光谱，不同离子几乎不改变探针的光谱性质，cr
3
、fe
3
会在一定程度上降低荧光强度，但是并不能使探针荧光完全淬灭，而cu
2
却可以是探针荧光完全淬灭，这为区分fe
3
、cu
2
提供了一种新的方法。
[0054]
1.3、灵敏度实验
[0055]
为了探究荧光探针4b对cu
2
的荧光淬灭响应随cu
2
浓度的变化即浓度响应性，测试了4b溶液(10μm)与加入各种浓度的cu
2
在37℃下反应后的紫外吸收变化和荧光光谱变化。如图5和图6所示，图5为探针4b对cu
2
的紫外滴定曲线，随着cu
2
的滴加，探针的吸收强度逐渐减弱。图6为探针在445nm处探针被滴定过程的线性拟合，说明探针与cu
2
反应的稳定性。
[0056]
如图7和图8所示，图7为探针在445nm处激发时，对探针4b滴定cu
2
的过程荧光滴定图，图8为探针在滴定过程中在556nm处的性拟合图。通过检测限公式计算出最终的检测限为7.32μm。紫外滴定和荧光滴定过程的线性拟合都说明探针4b对cu
2
反应具有高度灵敏性和稳定性，可以通过荧光的淬灭过程实现对cu
2
的量化检测。
[0057]
2、ph选择性探究
[0058]
为深入拓展探针4b可能的生理应用，对探针4b的ph适应性进行研究，结果如图9所示，从图9的结果来看，在ph为2至4范围内，探针本身的荧光随着ph的增加而增强。在ph为4至14范围内，ph的变化对探针本身的荧光没有影响。但在ph为8至12范围内，探针与cu
2
的反应速率减慢，反应量减少，反应后的探针不能完全淬灭；探针本身可以在ph为4至8的范围内对cu
2
产生响应，反应后探针能够完全淬灭。
[0059]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。