一种土瓶草组织培养方法及应用与流程

1.本发明涉及食虫植物组织培养领域，具体来说是一种土瓶草组织培养方法及应用。


背景技术：

2.土瓶草(cephalotus follicularis)又名澳洲瓶子草，囊叶草，属于土瓶草科土瓶草属多年生草本植物，是一种非常特殊的低矮型食虫植物，原产于澳大利亚西南海岸一带地区的沃伦生态区、贾拉森林及埃斯佩兰斯平原等地，生长环境为沼泽和潮湿地带。土瓶草利用其华丽的外表，引诱猎物掉入瓶内，使其溺死在消化液中，最终被消化液分解，被瓶内腺体吸收。由于俏丽的外观形状，土瓶草已经被世界各地作为观赏植物引种，我国亦在21世纪初进行了引种，我国目前人工栽培主要集中在浙江、云南、四川、福建、广东等省市。
3.目前土瓶草繁殖主要有种子繁殖、分株繁殖、叶插繁殖，土瓶草开花后必须进行异花授粉才具有繁殖特性，使得自然条件下结籽率低，同时，花卉最重要的是外观性状稳定性，而异花授粉常常导致株间杂交，使得其外观性状具有较大的改变。因此，分株繁殖及叶插繁殖成为了土瓶繁殖的主流。但不论是分株繁殖还是叶插繁殖，均存在繁殖周期长，繁殖成功率低，繁殖系数低等缺点。
4.针对现有种子繁殖结籽率低，品种遗传稳定性以及分株和叶插繁殖繁殖周期长、繁殖系数低、繁殖成功率低等技术的不足，发明了一种利用现代生物技术进行土瓶草种苗繁育的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对背景技术中存在的问题，提供一种土瓶草组织培养方法及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种土瓶草组织培养方法，步骤包括：
7.(1)外植体的选择与清洁：选择土瓶草基部未形成“瓶”的普通叶作为外植体，用饱和肥皂液涮洗5～10min，自来水漂洗2～3次后，滴加1～2滴吐温-80，震摇10～15min，自来水冲淋30～40min；
8.(2)外植体的消毒：将清洁好的外植体，转移至超净台上，用75％酒精溶液消毒15～20s，无菌水涮洗3～4次，用滴加2～3滴吐温-80的0.08％升汞溶液消毒5～6min，无菌水涮洗5～6次；
9.(3)丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去伤口，并将其剪成长约1cm大小，平铺于1/2ms naa0.05～0.1mg/l 2,4-d 0.02～0.05mg/l 2-ip 0.5～0.8mg/l 活性炭0.7g/l的丛生芽诱导培养基上，在温度为25
±
2℃，光照强度2000～3000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养60～90天；
10.(4)丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，切成单芽，接种在改良ms naa0.1～
0.15mg/l kt 4.0～5.0mg/l br 0.05～0.08mg/l 活性炭0.5g/l的丛生芽增殖培养基上，在温度为25
±
2℃，光照强度2000～3000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养40～60天；
11.(5)丛生芽的生根：将通过诱导或增殖获得的丛生芽，接种在1/2改良ms naa 0.4～0.6mg/l iba0.8～1.2mg/l ga3 0.2～0.4mg/l 活性炭0.5g/l的生根培养基上，在温度为25
±
2℃，光照强度2000～3000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养30～40天；
12.发明中，改良ms培养基为在原ms配方的基础上，将其中的磷酸二氢钾调整为1600mg/l，硫酸镁调整为160mg/l，氯化钙调整为180mg/l，其余元素不变。
13.本发明的有益技术效果是：
14.1.本发明是利用现代生物技术进行土瓶草种苗的生产，属于工业化生产，不受天气、季节等影响，可在短期内大量获得种苗。
15.2.本发明是利用植物的体细胞进行扩繁，属于无性繁殖范畴，使其遗传性状能最大程度的稳定。
16.3.本发明在增殖培养基中利用一定浓度的naa和kt组合，同时添加了一定浓度的br，可使土瓶草在继代增殖培养时，增殖系数极大的提高，最高可达7。
17.4.本发明在生根时，采用一定浓度的naa和iba组合，可使生根率达88％，同时，添加了一定浓度的ga3，可诱导土瓶草在瓶内即可产生大量的“瓶”，一方面提高了驯化时的成活率，另一方面缩短了成商品植株的培植时间。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1
20.一种土瓶草组织培养方法，步骤包括：
21.1.外植体的选择与清洁：选择土瓶草基部未形成“瓶”的普通叶作为外植体，用饱和肥皂液涮洗5min，自来水漂洗2次后，滴加2滴吐温-80，震摇10min，自来水冲淋30min；
22.2.外植体的消毒：将清洁好的外植体，转移至超净台上，用75％(v/v)酒精溶液消毒15s，无菌水涮洗3次，用滴加2滴吐温-80的0.08％升汞溶液消毒5min，无菌水涮洗5次，消毒污染率为40.8％，消毒死亡率为13.2％；
23.3.丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去伤口，并将其剪成长约1cm大小，平铺于1/2ms naa 0.05mg/l 2,4-d 0.02mg/l 2-ip0.5mg/l 活性炭0.7g/l的丛生芽诱导培养基上，在温度为25
±
2℃，光照强度2000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养90天，丛生芽诱导率为84.6％；
24.4.丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，切成单芽，接种在改良ms naa0.1mg/l kt 4.0mg/l br 0.05mg/l 活性炭0.5g/l的丛生芽增殖培养基上，在温度为23℃，光照强度2000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养60天，增殖系数为6.4；
25.5.丛生芽的生根：将通过诱导或增殖获得的丛生芽，接种在1/2改良ms naa 0.4mg/l iba 0.8mg/l ga3 0.2mg/l 活性炭0.5g/l的生根培养基上，在温度为23℃，光照
强度2000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养30天，生根率为86.9％；
26.其中，改良ms培养基为在原ms配方的基础上，将其中的磷酸二氢钾调整为1600mg/l，硫酸镁调整为160mg/l，氯化钙调整为180mg/l，其余元素不变。
27.实施例2
28.1.外植体的选择与清洁：选择土瓶草基部未形成“瓶”的普通叶作为外植体，用饱和肥皂液涮洗8min，自来水漂洗3次后，滴加2滴吐温-80，震摇12min，自来水冲淋35min；
29.2.外植体的消毒：将清洁好的外植体，转移至超净台上，用75％(v/v)酒精溶液消毒20s，无菌水涮洗3次，用滴加3滴吐温-80的0.08％升汞溶液消毒5min，无菌水涮洗6次，消毒污染率为36.1％，消毒死亡率为16.9％；
30.3.丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去伤口，并将其剪成长约1cm大小，平铺于1/2ms naa 0.08mg/l 2,4-d 0.04mg/l 2-ip0.6mg/l 活性炭0.7g/l的丛生芽诱导培养基上，在温度为25℃，光照强度2500lux，日照光12h的光暗交替环境下培养70天，丛生芽诱导率为81.8％；
31.4.丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，切成单芽，接种在改良ms naa0.13mg/l kt 4.5mg/l br 0.06mg/l 活性炭0.5g/l的丛生芽增殖培养基上，在温度为25℃，光照强度2500lux，日照光12h的光暗交替环境下培养50天，增殖系数为6.4；
32.5.丛生芽的生根：将通过诱导或增殖获得的丛生芽，接种在1/2改良ms naa 0.5mg/l iba 1.0mg/l ga3 0.3mg/l 活性炭0.5g/l的生根培养基上，在温度为25℃，光照强度2500lux，日照光12h的光暗交替环境下培养40天，生根率为89.0％。
33.其中，改良ms培养基为在原ms配方的基础上，将其中的磷酸二氢钾调整为1600mg/l，硫酸镁调整为160mg/l，氯化钙调整为180mg/l，其余元素不变。
34.实施例3
35.1.外植体的选择与清洁：选择土瓶草基部未形成“瓶”的普通叶作为外植体，用饱和肥皂液涮洗10min，自来水漂洗3次后，滴加2滴吐温-80，震摇15min，自来水冲淋40min；
36.2.外植体的消毒：将清洁好的外植体，转移至超净台上，用75％酒精溶液消毒20s，无菌水涮洗4次，用滴加3滴吐温-80的0.08％升汞溶液消毒6min，无菌水涮洗6次，消毒污染率为33.3％，消毒死亡率为18.1％；
37.3.丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去伤口，并将其剪成长约1cm大小，平铺于1/2ms naa 0.1mg/l 2,4-d 0.05mg/l 2-ip0.8mg/l 活性炭0.7g/l的丛生芽诱导培养基上，在温度为27℃，光照强度3000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养90天，丛生芽诱导率为83.1％；
38.4.丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，切成单芽，接种在改良ms naa0.15mg/l kt 5.0mg/l br 0.08mg/l 活性炭0.5g/l的丛生芽增殖培养基上，在温度为27℃，光照强度3000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养60天，增殖系数为6.9；
39.5.丛生芽的生根：将通过诱导或增殖获得的丛生芽，接种在1/2改良ms naa 0.6mg/l iba 1.2mg/l ga3 0.4mg/l 活性炭0.5g/l的生根培养基上，在温度为27℃，光照强度3000lux，日照光12h的光暗交替环境下培养40天，生根率为84.9％；
40.其中，改良ms培养基为在原ms配方的基础上，将其中的磷酸二氢钾调整为1600mg/l，硫酸镁调整为160mg/l，氯化钙调整为180mg/l，其余元素不变。
41.最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。