不含RNA的动物血清的制作方法

不含rna的动物血清
技术领域
1.本发明涉及细胞生物学领域，特别是细胞培养补充剂领域。一般而言，本发明涉及一种血清，优选是胎牛血清，其核糖核酸(rna)被减少或具有低于检测极限的最小rna含量，本发明还涉及一种用于从血清中去除rna的方法。这种rna减少的血清可用于分析细胞培养物的rna表达，而不会干扰动物血清中通常存在的rna的分析。


背景技术：

2.细胞培养是基础和生物医学体外研究的主要工具之一，包括将来自非常不同类型的动物(从昆虫到哺乳动物)的细胞，保存在温度、湿度和二氧化碳百分比的受控条件下。为了使细胞保持活力并持续分裂，细胞培养物保存在含有适量盐的液体培养基中，以使细胞发挥其最基本的代谢功能(swain p.basic techniques and limitations in establishing cell culture:a mini review.adv anim vet sci(2014)doi:10.14737/journal.aavs/2014/2.4s.1.10and arora m.cell culture media:a review.mater methods(2013)doi:10.13070/mm.en.3.175)。
3.体外细胞培养的一个重要成分是血清，因为它含有高含量的生长因子、脂质、蛋白质和其他使细胞保持不断分裂的必要因子。通过这种方式，将血清作为营养补充剂添加到维持细胞培养的合成液体培养基中。用于此目的的血清，来源可以是来自人、马或牛，世界范围上最广泛使用的则是胎牛血清(sfb)(arora m.cell culture media:a review.mater methods(2013)doi:10.13070/mm.in.3.175.)。
4.除了上述成分外，sfb还含有高含量的核酸，其中最丰富的是具有多种生物学功能形式的rna，例如转运rna(trna)、核醣体rna(rrna)、小分子rna(mirna)、piwi关联rna(pi-rna)、核仁rna(snorna)等(chen x,et al.cell res.2008oct；18(10):997-1006)。一些不同类型的rna包含在细胞外囊泡(ve)中，而其他类型的rna包含在细胞外囊泡中(keerthikumar s.et al.j mol biol.2016feb 22；428(4):688-692)。
5.ve是直径为50-400nm的微结构，由脂质双层组成，包含蛋白质、各种类型的生物功能rna和一些小分子。ve由其亚群所组成，这些亚群的直径和组成它们的分子含量彼此不同，其中外泌体50-120nm直径的ve是研究最广泛的(colombo m.et al.annu rev cell dev biol.2014；30:255-89)。ve一个重要方面是，它们已被证明能够在体外和体内将其内容物转移到受体细胞；因此，它们被认为是一种细胞间通讯系统，可能在新陈代谢以及癌症和糖尿病等疾病的发展中具有重要意义(muralidharan-chari v.et al.j cell sci.2010may 15；123(pt 10):1603-11and bobrie a.et al.traffic.2011dec；12(12):1659-68)。
6.培养细胞的研究证明，sfb的ve能够将其rna内容物转移到人和鼠的细胞系中；强调在使用sfb时，牛rna在细胞培养物中的可能转移。这一发现揭示，自从迄今为止发现mirna以来，关于检测和分析mirna表达的科学文献很可能是牛rna与手头上研究中来自物种细胞系的混合物。迄今为止，对于牛rna的检测及其在细胞培养物中的可能功能，干扰程度的大小尚不清楚。主要原因是超过70％的奶牛mirna与其他哺乳动物的mirna相同，包括
人类的(wei z.et al.sci rep.2016aug 9；6:31175)。
7.从这个意义上说，wei等人描述了sfb含有各种类型的rna，包括蛋白质编码rna和调节rna，包括信使rna、小分子rna(mirna)、核醣体rna和小核rna，即使在应用超速离心后，仍高达70％的rna可保留在血清中过程。
8.wei等人指出sfb特有的rna与来自细胞培养物的rna一起被分离出来，这可能会在随后的rna分析中造成干扰或误解，这就是为什么需要使用不含rna的血清来进行此类研究的原因(tosar jp.j extracell vesicles.2017jan 12；6(1):1272832)。
9.为了减少可能的干扰或误解，由于用于细胞培养的血清中存在内源性ve，已经开发了几种方法来消除血清中的ve。
10.从这个意义上说，美国专利9,005,888描述了由动物细胞产生的ve的分离方法和产生ve含量降低的血浆或血清的方法，表明在应用该方法后，一些最初存在的mirna无法通过定量pcr(qpcr)检测到。然而，美国专利9,005,888中描述的方法有几个缺点，包括使用含有聚乙二醇(peg)的沉淀溶液，其残留物保留在处理过的血清中，进而可被视为污染物元素。
11.例如，已经描述了的peg可以诱导异核生物的形成，即细胞融合以获得多核细胞(davidson rl,gerald ps.somatic cell genet.1976mar；2(2):165-76.)，因此留在sfb中的peg可以改变细胞的生物学功能，从而在分子生物学实验中产生改变的结果。
12.除此之外，不能排除血清中剩余的peg会影响通过常规方法(例如trizol)提取rna，并且美国专利9,005,888中描述很少或检测不到rna是由于由peg引起的伪影所影响，而不是rna本身被去除。
13.值得注意的是，正如wei等人所述，大部分血清rna不包含在ve内，而是包含在其外部。这极大地限制了使用peg处理的血清时，细胞培养物中没有rna污染的确定性。同样地，尽管使用peg沉淀方法也可以从血清中沉淀出高浓度的蛋白质，但尚不清楚是否可以完全去除循环rna相关蛋白复合物，这对于ve含量来说是外源性的(tosar et al.)。
14.同样重要的是要指出，美国专利9,005,888中描述的方法所需要的步骤和血清操作危害到其无菌条件，这可能会迫使需要包含一个额外的步骤以便在血清经peg处理后，使其恢复到无菌状态；这是为了在无菌细胞培养中使用sfb，这将增加在没有ve的情况下生产血清所产生的时间和费用。另一个重要的方面是，peg方法不能完全去除血清中存在的ve，因为所描述的实施方式之一定义了减少ve的血清，其浓度不超过每毫升104个囊泡。
15.就另一部分而言，kornilov等人(kornilov r.et al.j extracell vesicles.2018jan 21；7(1):1422674)描述了一种通过超滤从sfb中去除ve的方法。尽管提供了一种在方法上更简单的实验室级替代方案来消除ve，但这种方法仍然需要离心和使用昂贵的材料(如超滤材料和设备)，这降低了该方法的实用性及其在工业水平上的应用。此外，这种方法减少了ve的数量，但没有去除外部的rna，因此经这种方法处理的血清仍然含有大量的sfb中的rna。
16.除了上述处理sfb和减少ve含量及其rna含量的方法外，还有用于细胞培养的sfb替代品的商业替代品。此类血清替代品是含有部分血清天然成分的合成制剂，这样一些细胞系能够在受控培养条件下在最佳条件下生长(barnes d,sato g.anal biochem.1980mar 1；102(2)255-70)。然而，合成血清替代物往往比sfb贵得多，并且通常设计用于培养特定类
型的细胞，因此，一般来说，它们仅代表用于培养细胞系和/或特定培养条件的有效sfb替代品，例如对于干细胞(ohnuma k.et al.j neurosci methods.2006mar 15；151(2):250-61)。
17.由于需要研究外泌体在细胞培养中的生物学效应并防止血清mirna污染培养物，因此阻碍了实验的结论，而市场上已经有mirna减少的sfb产品(paszkiet b.et al.development of an improved process for the depletion of exosomes from fetal bovine serum.thermo fisher scientific inc.2016)，然而，这些含有大量其他类型的rna，而其对培养的影响仍尚未有研究。
18.理想情况下，为避免细胞培养物中的rna污染，用于补充培养基的血清，应不含rna或应实质上减少含有的rna，并应不含ve或实质上减少含有的ve，但也希望它不含任何其他化合物，举例来说，例如peg。然而，这种血清应保留细胞培养所必需的其他血清成分。
19.基于当前的现有技术，对动物血清(主要是sfb)的需求是显而易见的，其不含rna或具有最低含量的rna，将允许其在细胞培养物中进行研究，而不会有污染或干扰血清rna的风险。同样显而易见地，需要一种从用于细胞培养的动物来源血清中去除rna的方法，该方法通过简单且低成本的技术，不会使血清处于不育危险之中，并且可在工业应用上扩展，而不会从根本上增加血清的成本。


技术实现要素：

20.本发明涉及不含rna或实质上不含rna的动物血清。血清不含或实质上不含细胞外囊泡(ve)，但它保留了血清中对细胞培养至关重要的其他成分，因此有助于开展基于细胞培养物的研究而不会受到血清中ve或rna污染的风险。
21.在本发明的实施方式中，包括了不同类型的动物血清，例如牛、马、人、小鼠、大鼠和山羊血清，以及各自相应的胎儿血清变体。
22.本技术还涉及通过依次应用加热、冷却、碱化和中和过程来去除或实质上减少动物血清中存在的rna量的方法，特别主要是胎牛血清(sfb)。所述方法分解存在于动物血清中的内源性ve，进而使血清中的游离rna变性和降解，从而使所述血清中存在的rna被去除或实质上减少，ve的分解因此抵消了其自然功能。
附图说明
23.图1显示了一个条形图，它总结了不同商业sfb产品中rna的类别和丰富程度的比率。每个条形图显示不同的sfb套组。1)常规的sfb a；2)常规的sfb b；3)特征化的sfb；4)合格的sfb；5)经认证的sfb；6)三重过滤sfb；7)外泌体减少sfb。值得注意的是，不同类别的rna的含量和数量在包装方面有所不同，尽管有些不存有mirna，但全部都存有rna。黑条代表mirna；深灰色条代表未注释的rna(在bos taurus基因组中发现但不能与具有特定功能的rna类型相关联的序列)；浅灰色条代表trna；白条代表在bos taurus基因组中未发现的其他rna，其来源可能非为牛。
24.图2显示了在结合不同程序应用于sfb样品，以达成rna去除之后，回收的rna浓度的图表。使用的程序及其顺序描述于表1。在三种不同的条件之下rna被去除(第11、13和18条)，ind表示无法检测到rna浓度。以特定顺序通过加热、冷却、碱化和中和以进行去活性的
组合，是导致sfb中rna去除或显著减少的组合之一，其他减少rna量的组合则涉及额外的超速离心步骤。
25.图3显示了一个直方图，描述了sfb中所含颗粒的数量和大小。灰色直方图对应于利用本发明方法处理的sfb样品中存在的颗粒的大小和数量(根据表1的组合#11)，黑色轮廓直方图对应于未处理的对照样品。具有代表性尺寸(直径50至400nm)的ve颗粒(包括外泌体)，相较于未经处理的血清(对照组)尺寸变得较小，其中在加热、冷却、碱化和中和之后，绝大部分的尺寸约为直径30nm。
26.图4显示的条形图显示了在应用本发明方法之前和之后，几种商业sfb产品的rna浓度。1)常规的sfb a；2)常规的sfb b；3)特征化的sfb；4)合格的sfb；5)经认证的sfb；6)三重过滤的sfb；7)外泌体减少的sfb。需要注意的是，无论商业产品及其初始rna浓度如何，在应用本技术中描述的rna去除方法后，rna浓度都是不可检测的(ind)。
27.图5是显示细胞培养物的细胞增殖的图，其中本发明中描述的不含rna或实质上不含rna的sfb被用作补体。hek 293细胞在不同的补充条件下生长：白色圆圈代表未处理的sfb(对照组)，黑色圆圈代表本发明的不含rna或实质上不含rna的sfb(通过表1的组合#11获得)，灰色三角形代表合成血清替代物。用不含rna或实质上不含rna的sfb培养的细胞，显示出与使用未处理的sfb(对照组)培养的细胞具有相似的增殖，并且高于合成替代物的增殖，表明获得的不含rna或实质上不含rna的sfb应用本发明的方法后，能保持有效促进细胞增殖所需的特性。
28.图6显示了使用不同补充条件的细胞培养形态。使用了未处理的sfb(对照组)、本发明中描述的不含rna或实质上不含rna的sfb(通过表1中描述的组合#11获得)和合成血清替代物。应注意的是，本发明中不含rna或实质上不含rna的sfb对对照组的细胞形态没有负面影响，对合成血清也没有负面影响，证明它保持了用于细胞增殖所需的特性。
29.图7显示了一个条形图，其中比较了不同补充条件下培养物的细胞活性。白条为sfb使用未处理(对照组)；黑条为本发明的不含rna或实质上不含rna的sfb，以及灰条为合成血清替代物。值得注意的是，在第6天，使用对照组sfb作为补充的细胞和不含rna的sfb和合成替代物的细胞之间的累积生存力没有显著差异，证实了不含rna的血清在使用本发明的方法之后，仍然保持其补充特性。
30.图8显示了使用不含rna的sfb作为补充的细胞系以及使用未处理血清作为对照组的细胞系的增殖比率：1)hek 293、2)hela、3)cho、4)mcf7和5)mef细胞,使用未处理的sfb作为补充(对照组)以及使用不含rna或实质上不含rna的sfb培养的细胞，在两种补充条件下获得的增殖率。与使用未处理的sfb作为补充相比，在第6天，用不含rna的sfb培养的细胞系均未显示出累积增殖差异。
31.图9显示了补充不含rna的sfb的细胞以及使用未处理血清(对照组)的细胞，细胞活力之间的比率。1)hek 293、2)hela、3)cho、4)mcf7和5)mef细胞，使用未处理的sfb作为补充以及使用不含rna或实质上不含rna的sfb进行培养，在两种补充条件下获得存活率。使用不含rna的sfb培养的细胞系，与各自的sfb对照组相比，在第6天均未显示出累积活力的差异。
32.图10显示了未经处理的血清(对照组)和用本发明的方法处理后的相同血清中几种mirna的量的图。1)bta-mir-143；2)bta-mir-181a；3)bta-mir-192；4)bta-mir-380-3p和
5)hsa-mir-25-3p mirna通过定量逆转录pcr(qrt-pcr)检测。白条代表未处理的sfb，黑条代表用本发明的方法处理的sfb。在所有情况下，本发明的方法将mirna的量降低到低于检测限(约38ct)的水平，显示了本发明所述方法从sfb中去除mirna的有效性。
33.图11显示了未经处理的血清(对照组)和用本发明的方法处理后的相同血清中其他种类的rna的量图。1)u47和2)未注释的rna#49627通过qrt-pcr检测rna。白条代表未处理的sfb(对照组)，黑条代表用本发明方法处理后的sfb，清楚地表明本发明所述方法可有效去除数种rna。
34.图12显示了未经处理的血清(对照组)和用本发明的方法处理后的相同血清中几种mirna的量的图。1)hsa-mir-486；2)hsa-mir-423-5p；3)hsa-mir-10b通过qrt-pcr检测mirna。白条代表未处理的sfb(对照组)，黑条代表用本发明的方法处理后的sfb。可以看出，这些mirna在所用血清样品中的含量很低，然而，本发明的方法能够将其去除至检测不到的水平。
具体实施方式
35.细胞系和原代组织的培养是生物医学研究的主要工具之一。通常，细胞培养是通过在含有添加剂的液体培养基中培养细胞来进行的，这些添加剂可以使细胞保持存活或持续增殖。胎牛血清(sfb)可作为培养基的补充物，因为它由蛋白质、核酸、激素、生长因子、脂质和其他小分子(例如对细胞生长很重要的维生素和矿物质)组成的复杂混合物组成。
36.sfb包含不同类别的rna的混合物，包括高度保守的mirna，因此在进化距离较远的物种之间存在序列和大小完全相同的mirna。由于其高度的保守性和特异性，mirna被认为是基因表达的重要调节因子(bartel d.p.metazoan micrornas.cell(2018)173:20
–
51)。
37.最近有报导称，当血清用作细胞培养物中的补充剂时，存在于sfb中的rna会干扰细胞内mirna的检测(wei z.et al.sci rep.2016aug 9；6:31175)。这一发现在分子生物学中具有重要意义，因为绝大多数在细胞培养中表征rna基因表达的研究都使用sfb作为补体，并且获得的结果可能会因培养细胞本身的mirna和来自sfb的mirna的混合效应而改变。当考虑到在大量mirna中无法区分它们来自的物种时，这种情况会更加严重。也不排除用作补充剂的血清中的mirna或其他rna，可能通过改变基因的表达或它们的生理状态，对培养的细胞发挥生物学功能的可能性，并因此影响随之而来的实验结果。
38.其中一个牛mirna可能转移到细胞培养物中的来源之一是sfb中包含的细胞外囊泡(ve)，然而，牛rna的污染也来自囊外培养基，因为mirna和其他类型的rna的量在ve内外是以相等的比例存在，因此从血清中去除ve不足以完全去除污染的rna。
39.最后，需要注意的是，sfb中的rna非常稳定，无论是在ves内部还是外部都应该受到rna结合蛋白的保护，如果rna没有得到有效保护，sfb中含有大量的rna酶会自然地降解rna(chen x,et al.cell res.2008oct；18(10):997-1006)。
40.在现有技术中，描述了几种从sfb中减少或去除ve的方法，包括使用化学试剂的超滤、超速离心和沈淀，然而，这些方法的重点是消除ve和其中包含的生物材料，但它们不能减少或去除以游离形式存在于血清中的rna，这些rna可占哺乳动物血清中所含rna的60％，因此这些方法或sfb制剂没有一个是不含rna或实质上不含rna的。一种可能的替代方法是使用合成补充剂，但这些补充剂通常比使用sfb昂贵得多，并且并不是对所有类型的细胞生
长都有效。
41.这就是为什么需要不含rna或实质上减少rna的哺乳动物血清的原因，它允许在体外进行细胞培养，而不会造成污染或可能改变分子生物学实验的结果，同时保持其特点和作为补充剂的功能。从这个意义上说，还需要有一种方法允许生产不含rna或实质上减少rna的血清，不会改变其作为补充剂的功能，并且不会留下可能干扰细胞培养或分子生物实验的化学试剂残留物。
42.本发明通过提供不含rna或实质上减少rna的血清克服了现有技术的缺点，以及去除哺乳动物血清(特别是sfb)中所含rna的有效方法。这种方法可以有效地消除哺乳动物血清中存在的rna，无论它是在ve内还是在其外部，并因此可以从不同种类的哺乳动物中产生不含或实质上减少rna的血清。
43.所述方法的另一个技术优势是它是一种简单的方法，不需要离心或超速离心，也不需要使用过滤器，从而降低了应用成本和需要的工业规模。此外，所述方法可以在不需要将血清转移到不同容器中的情况下进行，这有助于维持其所需的无菌条件。由本技术中描述的方法产生的血清，其中不含有ve和rna，或其中ve和rna的总量是显著减少的，相对于现有技术中描述的其他血清达到更高的rna去除率。
44.本发明更基于一个出人意料的事实，即以特定顺序对哺乳动物血清应用加热、冷却、碱化和中和过程，会导致血清中天然存在的rna显著消除或减少。尽管这些过程是常用的，并且它们中的每一个对血清中存在的不同生物分子的影响是已知的，但是将这四个过程与这种特定的执行顺序相结合，并具有这种有效去除rna的方法，到目前为止并还没有被已经描述过。如本发明中所述，这些方法的特定应用顺序提高了哺乳动物血清中存在的rna的去除效率。
45.由于本发明基于以特定顺序应用加热、冷却、碱化和中和过程，这与现有已知技术的直觉相悖，因此并不期望通常知识者得出类似的结论。在血清中单独应用这些过程或以不同顺序应用这些过程不会产生相同的结果，因此本方法相对于现有已知技术是非显而易见的。
46.不含rna或实质上减少rna的血清可用作任何类型的体外细胞培养(例如hela、hek 293、cho、mcf7、mef等)的补充剂，和任何寻求研究细胞代谢或生理状态的分子生物学实验之中。此外，在所有与基因表达分析相关的研究中，尤其是在数个rna种类的表达分析相关研究中(例如mirna、trna、lncrna、mrna、snrna和pirna等)，不含rna或实质上减少rna的血清可用作补体。相类似地，不含rna或实质上减少rna的血清可用作细胞培养的补充物，这些细胞培养可用于生产治疗剂，例如激素、重组蛋白、抗体、凝血因子和疫苗，在此仅举几例。(ashish verma,anchal singh academic press,nov 4,2013)
47.如在本技术说明书中所述，术语“不含rna血清”和“实质上减少rna的血清”是指动物血清，优选是哺乳动物来源，其已经经历了rna去除过程，并且其内源性rna含量无法被用于测量水溶液样本核酸浓度的高灵敏度常规方法检测到，例如分光光度法和荧光分光光度法，或通过检测特定rna序列的存在和相对量的方法检测，并且很少或没有检测到rna序列通常被解释为“不存在”或“不可检测”序列，就像qrt-pcr的情况一样，其中扩增循环(ct)表示感兴趣序列的数量，考虑到ct大于38个周期的信号量表示所寻找的序列不存在或检测不到。在下一代测序(rna-seq，small rna-seq)等特定的序列检测技术中，通常假设读数的数
量表示感兴趣序列的数量，因此读数为0的序列表明rna不存在或其含量低于该技术的检测限。
48.为了本发明的开发，首先分析了血清中存在的不同类型rna的组成和相对量(图1)。对此，不同商业sfb产品的样品：1)常规的sfb a；2)常规的sfb b；3)特征化的sfb；4)合格的sfb；5)经认证的sfb；6)三重过滤的sfb和7)通过rnaseq方法(illumina)分析外泌体减少的sfb。生物信息学分析结果表明，sfb含有不同数量的不同种类的rna。在最丰富的rna类别中，我们发现了mirna、trna和未注释的rna(其序列位于bos taurus基因组中，但不能与特定类型的rna相关联)。需要注意的是，不同商业产品中不同类型rna的比例有所不同，其中一些显示出相较于其他产品较低的mirna比例，但都显示出某种类型的rna。
49.为了确定去除血清中存在的rna过程的最合适条件，测试了不同的过程及其组合，包括：加热、冷却、碱化、添加酶(核糖核酸酶)和超速离心。不同过程的测试组合描述于表1。应用这些过程后，用trizol(thermo)试剂提取rna，并用qubit型荧光分光光度法(thermo)对提取的rna进行定量。
50.表1
[0051][0052]
图2显示了sfb样品中不同过程及其组合的rna去除效率。只有三种不同过程的特定组合导致rna去除至无法检测的水平(ind)，其低于荧光分光光度法的检测限250pg/μl。其中一种组合(图2，第11条)包括加热和冷却，然后是碱化，然后是中和。另一种有效的组合(图2，第13条)包括加热和冷却，然后是超速离心。第三种有效的组合(图2，第18条)是超速离心步骤的组合，然后是加热和冷却，然后是碱化，然后是中和，按此顺序。
[0053]
其他方法和组合在从血清中去除rna方面，显示出一定程度的有效性，但它们都不能用于完全去除或低于检测限。需要强调的是，从血清中去除rna不仅是通过应用所描述的
四个过程来进行的：加热、冷却、碱化和中和，而且这些过程的应用顺序尤其重要，因为这三个过程的组合但顺序不同(图2，第12条)，对从血清中去除rna的效果不同；这在现有技术中是令人惊讶且非显而易见的。总而言之，在血清中单独应用或以不同顺序应用这些过程，并不能去除其中所含的rna。
[0054]
鉴于血清中存在的部分rna包含在ve中，使用nanosight(malvern)仪器(图3)，通过纳米颗粒跟踪分析(nta)对纳米颗粒进行量化，以验证本发明方法对sfb中存在的ve的影响。
[0055]
sfb中天然包含的颗粒尺寸在直径为50nm和400nm之间，两个颗粒浓度峰值接近100nm和180nm(图3，对照组，黑色轮廓直方图)。使用本技术描述的方法后，sfb中存在的颗粒尺寸显著减小，最大颗粒浓度峰直径接近30nm(图3，#11，灰色直方图)。
[0056]
这些结果表明，应用rna去除方法，分解了血清中存在的ve，包括外泌体，因为在30nm附近看到的峰的数量(1.5x 108个颗粒)关联于对照组样品两个主要峰的数量，这表明了ve的自然状态的分解，去除或显著降低了血清中ve的含量。ve的分解使动物血清中存在的总rna的去除更加有效，可能会释放ve中存在的rna以便随后降解。
[0057]
这一结果可以通过以下事实来解释：加热和冷却过程会使ve变性，并释放它们所含的rna，随后用强碱处理会产生rna的碱性水解，并且添加强酸会促进更大的rna降解，从而提高从血清中去除rna的效率。经过这种处理后残留在血清中的rna，很可能是由非功能性片段组成，这是rna分子降解的产物，因此它们不会再对培养中的细胞产生影响。
[0058]
为了证实从血清中去除rna的方法的效率，在用本技术中描述的方法处理之前和之后对七种不同的商业sfb产品的rna进行了量化。用trizol(thermo)试剂提取rna，并通过qubit型荧光分光光度法(thermo)对提取的rna进行定量。
[0059]
本技术所述的rna去除方法对所有经测试的商业sfb产品均有效：1)常规的sfb a；2)常规的sfb b；3)特征化的sfb；4)合格的sfb；5)经认证的sfb；6)三重过滤的sfb和7)外泌体减少的sfb。图4显示，尽管含有不同类别的rna，如先前确定的(图1)，所述方法能够去除不同商业产品的rna并低于检测限的水平，表明所述方法是有效的，无论rna浓度和是否存在于血清中，因此所述方法适用于任何类型的动物血清。
[0060]
随后，评估了本技术中描述的不含rna或实质上减少了rna的sfb，在应用rna去除方法后，其对细胞培养的补充能力是否发生了变化。为此，绘制了补充不含rna血清的人体细胞(hek 293细胞)的生长曲线，并测定了其6天的增殖、形态和活力，并将它们与补充未处理血清的培养基的细胞进行比较，以及与使用合成血清替代物进行培养的细胞进行比较，一种合成配方包含某些类型的细胞系在培养中生长所必需的成分，并且由于其合成性质，它不含rna或ve。
[0061]
图5显示了三种补充条件下细胞增殖的比较。hek 293细胞在正常条件下在培养基中生长，直至达到长满60％。之后，更换培养基，加入补充有任何变体(对照组sfb、不含rna的sfb和合成血清替代物)的培养基，量化细胞密度(第0-6天)。结果表明，与未处理的sfb(对照组，空心圆圈)相比，补充不含rna血清(黑色圆圈)的培养物的细胞增殖没有差异。使用不含rna血清获得的增殖高于在补充合成血清替代物的培养基中生长的细胞(灰色三角形)。
[0062]
图6显示了在三种补充条件下培养的细胞形态。值得注意的是，相对于对照组，不
含rna的sfb不会影响细胞的形态，也不会影响合成血清，这表明它保持了促进细胞增殖所必需的特性，而对细胞生理没有副作用。
[0063]
细胞活力是通过trypan blue排除测定法对hek 293细胞进行量化来确定的，该测定法评估膜的完整性。图7显示了在三种补充条件下培养的细胞在第6天的累积细胞活力(白条：对照组sfb；黑条：不含rna的sfb；灰条：合成替代物)。结果表明，在第6天的累积细胞活力在所用的不同补充剂之间没有变化，这表明本发明所述的不含rna的sfb对细胞活力没有任何负面影响，因此使用上是安全的。
[0064]
在其他细胞系中重复这些活力和增殖测定(分别为图8和图9)。图8显示了在补充不含rna的sfb的培养基中生长的细胞系，与补充有血清但未经处理的培养基(对照组)中生长的细胞系之间的增殖比率。培养细胞：1)hek 293、2)hela、3)cho、4)mcf7和5)mef在补充未处理sfb以及补充不含rna或实质上不含rna的sfb的培养基中生长，获得两种补充下的增殖率状况。与hek 293细胞一样，对于所有测试的细胞系，两种补充条件之间的增殖比都接近1，表明不含rna的sfb和对照组sfb之间的补充能力没有差异。
[0065]
图9显示了相同细胞系在两种培养条件下第6天的累积活力，注意到两种补充条件之间的活力比接近1。该结果表明，使用经本发明方法处理的血清，其细胞活力与对照组的血清相比没有显著差异。
[0066]
为了验证该方法对去除血清中rna的有效性，在应用所述方法之前和之后进行了一些mirna的测定。为此，根据先前(图1)所描述的，从具有丰富mirna含量的商业sfb产品中提取rna，随后根据生物信息学分析海量测序结果，确定血清中最具代表性的mirna的相对量。
[0067]
探针被用于测定每种mirna在表2中进行了描述。如图10所示，评估的所有mirna：1)bta-mir-143；2)bta-mir-181a；3)bta-mir-192；4)bta-mir-380-3p和5)hsa-mir-25-3p在对照组血清(白条)中被发现，而在用本发明的方法(黑条)处理的血清中未检测到低于38ct(虚线)的mirna，这表明当应用本发明的方法时，大量sfb中的mirna被去除或减少到检测限以下。
[0068]
有些商业sfb产品的mirna含量低，但含有大量其他rna(图1，第4和第7条)。对这些商业产品之一中包含的几类rna的计算分析表明，两种rna序列中含量丰富：分类为u47的rna和分类为“未注释”的另一种rna(此处指定为#49627)。
[0069]
为了证实其他类型rna的消除，使用特定探针进行qrt-pcr以评估这两种rna的数量。用于测定u47的探针见表2。
[0070]
表2
[0071]
mirna化验标识符bta-mi-r-143id:006735_matbta-mir-181aid:005861_matbta-mir-192id:006776_matbta-mir-380-3pid:006377_mathsa-mir-10bid:002218hsa-mir-25-3pid:000403hsa-mir-423-5pid:00234
hsa-mir-486id:001278u47id:001223
[0072]
对于未注释的rna序列#49627，sybr-green型荧光使用先前报导的技术，使用表3中描述的引子寡核苷酸。
[0073]
表3
[0074][0075]
图11显示了1)u47和2)#49627在未经处理血清的商品(白条)和使用本发明的方法处理后的相同血清(黑条)中的量。在未处理的血清中发现两种rna的水平低于20ct，并且本发明的方法的应用去除了这两种类型的rna，将其水平降低到低于38ct的检测限。
[0076]
那些似乎不含mirna的商业产品的一个重要方面是，尽管某些mirna似乎具有无法被检测到的水平，例如bta-mir-143、bta-mir-181a、bta-mir-192、bta-mir-380-3p和hsa-mir-25-3p，但它们确实含有一些仍可检测到的mirna。图12显示了用于确定：1)hsa-mir-486；2)hsa-mir-423-5p；和3)hsa-mir-10b，在这些商业产品之一中的处理前(白条)以及应用本发明的方法后(黑条)的qrt-pcr分析。值得注意的是，在未处理的sfb中，这些mirna在34ct附近被检测到，并且当使用本发明的方法时，这些mirna降低到低于38ct的检测限。
[0077]
根据本技术中的描述，本文所述的发明涉及不含rna或实质上减少rna的哺乳动物血清以及获得所述不含rna或实质上减少rna的血清的方法。通过本方法获得的血清保持其补充细胞培养物的能力并且不含对细胞培养物可能有害的化学残留物。
[0078]
为了实施本发明的方法，可以使用现有技术中描述的用于血清样品的受控加热的任何方法，优选在无菌容器或器皿中，或在工业容器中，包括但不限于浴槽和浸入温控水中、在温控柜(炉)中培养或使用任何其他受控加热设备。
[0079]
52℃和63℃之间的温度，优选55℃和57℃之间的温度可用于血清加热过程。加热时间可以在25和60分钟之间，优选35分钟。
[0080]
冷却过程可以在加热后逐步进行，无需通过使其冷却至室温来控制温度，或通过使用冷却手段来加速该过程，例如浸入室温或低于室温的水或液体中，或使用任何其他受控冷却装置。最终冷却温度的范围可以在8℃和25℃之间，优选16℃。
[0081]
对于碱化过程，可以使用溶液或无水的几种碱性或碱性化合物或盐，它们会释放羟基离子(oh-)，包括但不限于：氢氧化钾(koh)、氢氧化镁(mg(oh))2)、氢氧化钙(ca(oh)2)、氢氧化钠(naoh)和其他类似性质的物质。本领域普通技术人员可以常规地标准化本方法中所需的加热和冷却过程的最佳温度和时间。
[0082]
碱浓度可以在10-12n之间，优选12n。本领域普通技术人员可以常规标准化本方法中所需的碱化过程的最佳浓度。
[0083]
血清应碱化至10至12之间的ph值，优选12的ph值。
[0084]
血清暴露于碱的时间可以根据存在的rna浓度和体积而变化，但必须保持至少3分钟，可以在3到20分钟之间，最好在5到10分钟之间。
[0085]
对于中和过程，可以使用酸性化学性质的几种化合物或盐，包括但不限于：磷酸(h3po4)、硝酸(hno3)、乙酸(ch3cooh)、盐酸(hcl)等其他类似性质的化合物。
[0086]
酸浓度可以在0.1和2n之间的范围内，优选1n可以用作浓度。本领域普通技术人员可以常规标准化本方法中所需的中和过程的最佳浓度。
[0087]
血清必须酸化，直到获得7.2和7.5之间的生理ph值，优选ph值7.4。
[0088]
在本发明的一个优选实施方案中，将血清在55℃至57℃之间的温度加热30至45分钟；使其逐渐冷却直至达到20℃室温，使用无水naoh(粉末或颗粒)碱化血清，直到达到ph12 10分钟，随后使用1n浓度的hcl降低碱化血清的ph，直到在生理ph值为7.4时达到中和。
[0089]
如果dna浓度非常高，例如高于45或50ng/ml，可以连续重复应用本发明的方法以确保去除rna。
[0090]
在本发明的一个实施方式中，本技术中描述的方法可以整合额外的超速离心步骤(在80,000xg和100,000xg之间)。如果进行超速离心，并且该过程危及血清的无菌性，则必须使用现有技术中已知的任何技术进行额外的灭菌步骤，例如通过0.2微米孔膜进行过滤。
[0091]
任何类型的动物血清都可以用于实施本发明，包括但不限于牛、马、人、小鼠、大鼠和山羊血清，以及各自的胎儿血清变体。
[0092]
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不构成对权利要求范围的限制。相反地，呈现这些示例是为了更好地理解本发明的实践，需理解它们仅代表本发明的一些实施例。
[0093]
实施本发明方式的描述
[0094]
实施例1
[0095]
从sfb中去除rna
[0096]
从常规的sfb商业产品开始，按照制造商的建议，通过使用trizol产品对其进行提取来进行总rna浓度的初步测定，发现浓度为35ng/ml。
[0097]
将sfb在56℃加热35分钟，缓慢冷却至室温直至达到20℃。随后，使用12n无水naoh将血清碱化，直到达到ph 12，并以这种方式保持15分钟，然后使用1n hcl降低碱化血清的ph，直到达到生理ph 7.4。
[0098]
应用该方法后，通过上述trizol提取法测定总rna浓度，通过荧光分光法找到低于检测限的浓度。
[0099]
实施例2
[0100]
结合本发明的方法和超速离心从sfb去除rna
[0101]
从常规sfb商业产品开始，发现其rna浓度为40ng/ml，将血清在4℃下以100,000xg超速离心7小时。在超速离心结束时，将样品上清液转移到一个新的无菌容器中，而不会干扰底部结果。为了保持无菌条件，使血清上清液通过孔径为0.2微米的无菌过滤器。
[0102]
随后，将sfb上清液在56℃加热35分钟，使其缓慢冷却至室温直至达到20℃；随后，使用无水naoh碱化血清，直至达到ph 12并保持该状态15分钟，之后，使用1n hcl降低碱化血清的ph，直至达到生理ph 7.4。
[0103]
应用该方法后，通过上述trizol提取法测定总rna浓度，通过荧光分光法找到低于
检测限的浓度。
[0104]
实施例3
[0105]
在不同的迭代中使用本发明的方法从sfb中去除rna
[0106]
不同的血清套组被预期含有比其他血清更高量的rna。在具有高rna含量的血清样品的情况下，可以重复本发明的方法以产生其在rna去除中效率的累加结果。
[0107]
从rna含量定量在45ng/ml以上的血清开始，在56℃下加热35分钟，使其缓慢冷却至室温直至达到20℃；随后，使用无水naoh碱化血清，直到达到ph 12并保持15分钟，之后，使用1n hcl降低碱化血清的ph值，直到达到生理ph值7.4。
[0108]
随后，在相同条件下重复加热、冷却、碱化和中和过程。
[0109]
在连续两次应用该方法后，通过上述trizol提取方法测定总rna浓度，通过荧光分光法找到低于检测限的浓度。