一种多重信号放大系统及其在免疫吸附直接法检测中的应用的制作方法

1.本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种多重信号放大系统及其在免疫吸附直接法检测中的应用。


背景技术：

2.酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，简写elisa) 将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。传统elisa测定方法中有3种必要的试剂：固定的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。
3.传统的elisa检测方法受限于酶和底物显色的种类，一次实验只能检测一种抗原或抗体。为了实现同时检测多种抗原或抗体信号并实现多轮检测，已有研究使用其他信号放大方法来代替酶促信号放大。
4.cn101988920a公开了一种抗原检测试剂盒和检测方法，采用dna寡核苷酸缀合的抗体替换过氧化物酶融合的抗体，用于由酶实现的信号放大。rna寡核苷酸分别互补于dna寡核苷酸，能实现多种抗原在单个测定中的同时检测，但检测方法需要加入rna酶，且存在检出限高、无法实现多轮检测、检测效率低、成本高、操作繁琐等缺陷。为此，需要研究新的检测灵敏度高、操作简便的信号放大系统。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫吸附直接法检测抗原的方法，包括下述步骤：
6.(1)在固相基质中包被待检测抗原；
7.(2)加入抗体-dna/rna连接链，作用一定时间；
8.(3)加入dna/rna放大链，作用一定时间；
9.(4)加入dna/rna检测链，作用一定时间；
10.(5)进行洗涤，检测dna/rna检测链上的信号强度；
11.(6)根据不同浓度抗原标准品的检测信号强度绘制标准曲线，并根据待检测抗原样品的检测信号强度和标准曲线计算抗原的浓度。
12.本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，包被待检测抗原后，加入封闭液进行封闭。
13.本发明的优选技术方案中，所述固相基质选自多孔板、pvdf膜、醛基化的固相基质等任何可吸附包被抗体/抗原或者通过化学键包被抗体/抗原的固相基质。
14.本发明的优选技术方案中，所述包被抗原选自任何可与相应抗体结合，并可被包被于固相基质的抗原。
15.本发明的优选技术方案中，所述抗原可通过化学键、吸附等作用包被于固相基质。
16.本发明优选的技术方案中，所述待检测抗原可来自人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒、其他任何来源的抗原的任一种或多种。
17.本发明的优选技术方案中，步骤(2)中，所述抗体-dna/rna连接链中，每个抗体分子连接一个或多个连接中间体。
18.本发明优选的技术方案中，所述抗体与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
19.本发明的优选技术方案中，步骤(2)中，所述抗体-dna/rna连接链中，每个连接中间体连接一个或多个dna/rna连接链。
20.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体与dna/rna连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
21.本发明优选的技术方案中，用于连接抗体和dna/rna连接链的连接中间体中的两种双官能团的比例为一比一、一比多中的任一种或多种。
22.本发明优选的技术方案中，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
23.本发明的优选技术方案中，步骤(3)中，可先连接一级dna/rna放大链，连接后再加入二级dna/rna放大链，根据需要连接更多级别dna/rna放大链。
24.本发明的优选技术方案中，步骤(5)中，可先进行第一轮dna/rna检测链进行检测，然后进行解离，再加入第二轮dna/rna检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮dna/rna检测链进行检测；根据需要进行多轮检测。
25.本发明优选的技术方案中，检测过程中不低于1轮的检测，优选为2轮到6轮；每轮检测中同时检测1种或1种以上的抗原。
26.本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
27.本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前解离洗脱的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、连接链与检测链互补配对的位置。
28.本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
29.本发明优选的技术方案中，所述检测信号可以连接于dna/rna检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
30.本发明优选的技术方案中，所述检测信号包括但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
31.本发明的优选技术方案中，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
32.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链、dna/rna放大链、dna/rna检测链中可含有碱基重复单元。
33.本发明优选的技术方案中，dna/rna放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
34.gtgatgtaggtggtagaggaattt-tt-ataaaccta-a-(ataaaccta-a)n‑ꢀ
ataaaccta-a(40≤n≤60)、
35.ctagatcgaactattcgaacactaaata-tt-catcatcat-a-(catcatcat-a)n‑ꢀ
catcatcat-a(40≤n≤60)、
36.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt-tt-aatactctc-a
‑ꢀ
(aatactctc-a)
n-aatactctc-a(40≤n≤60)、
37.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac-tt-a-caacttaac-a
‑ꢀ
(caacttaac-a)
n-caacttaac-a(40≤n≤60)、
38.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc-tt-ttcatttac-a
‑ꢀ
(ttcatttac-a)
n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
39.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg-tt-caatcaaaa-a
‑ꢀ
(caatcaaaa-a)
n-caatcaaaa-a(40≤n≤60)、
40.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact-tt-ccaataata-a
‑ꢀ
(ccaataata-a)
n-ccaataata-a(40≤n≤60)、
41.taggtttat-t-taggtttat-t-taggtttat-ttt-ttcatttac-a-(ttcatttac
‑ꢀ
a)
n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
42.atgatgatg-t-atgatgatg-t-atgatgatg-ttt-ttttctacc-a-(ttttctacc
‑ꢀ
a)
n-ttttctacc-a(40≤n≤60)、
43.gagagtatt-t-gagagtatt-t-gagagtatt-ttt-tccttttat-a-(tccttttat
‑ꢀ
a)
n-tccttttat-a(40≤n≤60)、
44.gttaagttg-t-gttaagttg-t-gttaagttg-ttt-ccttctatt-a-(ccttctatt
‑ꢀ
a)
n-ccttctatt-a(40≤n≤60)、
45.gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-ttt-ttattcact-a-ttattcact-a
‑ꢀ
(ttattcact-a)
n-ttattcact-a(40≤n≤60)、
46.ttttgattg-t-ttttgattg-t-ttttgattgttt-tcattactt-a-tcattactt-a
‑ꢀ
(tcattactt-a)
n-tcattactt-a(40≤n≤60)、
47.tattattgg-t-tattattgg-t-tattattgg-ttt-ttcttactc-a-ttcttactc-a
‑ꢀ
(ttcttactc-a)
n-ttcttactc-a(40≤n≤60)。
48.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
49.aaauuccucuaccaccuaca、
50.aaattcctctaccacctacatcac、tatttagtgttcgaatagtt、
51.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
52.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
53.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
54.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
55.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
56.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
57.aaauuccucuaccaccuacaucac。
58.本发明优选的技术方案中，dna/rna检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
59.待检测信号-tt-taggtttat-t-taggtttat-t、
60.待检测信号-tt-atgatgatg-t-atgatgatg-t、
61.待检测信号-tt-gagagtatt-t-gagagtatt-t、
62.待检测信号-tt-gttaagttg-t-gttaagttg-t、
63.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
64.待检测信号-tt-ttttgattg-t-ttttgattg-t、
65.待检测信号-tt-tattattgg-t-tattattgg-t、
66.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
67.待检测信号-tt-ggtagaaaa-t-ggtagaaaa-t、
68.待检测信号-tt-ataaaagga-t-ataaaagga-t、
69.待检测信号-tt-aatgaaaga-t-aatgaaaga-t、
70.待检测信号-tt-agtgaataa-t-agtgaataa-t、
71.待检测信号-tt-aagtaatga-t-aagtaatga-t、
72.待检测信号-tt-gagtaagaa-t-gagtaagaa-t、
73.待检测信号-uu-guaaaugaa-u-guaaaugaa-u。
74.本发明的另一目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫吸附直接法检测抗体的方法，包括下述步骤：
75.(1)在固相基质中包被待检测抗体；
76.(2)加入抗原-dna/rna连接链，作用一定时间；
77.(3)加入相应的dna/rna放大链，作用一定时间；
78.(4)加入dna/rna检测链，作用一定时间；
79.(5)去除dna/rna检测链，并用检测缓冲液洗涤，检测dna/rna检测链上的信号强度；
80.(6)根据不同浓度抗体标准品的检测信号强度绘制标准曲线，并根据待检测抗体样品的检测信号强度和标准曲线计算抗体的浓度。
81.本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，包被待检测抗体后，加入封闭液进行封闭。
82.本发明的优选技术方案中，所述固相基质选自多孔板、pvdf膜、醛基化的固相基质等任何可吸附包被抗体/抗原或者通过化学键包被抗体/抗原的固相基质。
83.本发明的优选技术方案中，所述包被抗体选自任何可与相应抗原结合，并可被包被于固相基质的抗体。
84.本发明的优选技术方案中，所述抗体可通过化学键、吸附等作用包被于固相基质。
85.本发明优选的技术方案中，所述待检测抗体可来自人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒、其他任何来源的抗体的任一种或多种。
86.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述抗原-dna/rna连接链中，每个抗原分子连接一个或多个连接中间体。
87.本发明优选的技术方案中，所述抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
88.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述抗原-dna/rna连接链中，每个连接中间体连接一个或多个dna/rna连接链。
89.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体与dna/rna连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组
合。
90.本发明优选的技术方案中，所述用于连接抗体和dna/rna连接链的连接中间体中的两种双官能团的比例为一比一、一比多中的任一种或多种。
91.本发明优选的技术方案中，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
92.本发明的优选技术方案中，步骤(3)中，可先连接一级dna/rna放大链，连接后再加入二级dna/rna放大链，根据需要连接更多级别dna/rna放大链。
93.本发明的优选技术方案中，步骤(5)中，可先进行第一轮dna/rna检测链进行检测，然后进行解离，再加入第二轮dna/rna检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮dna/rna检测链进行检测；根据需要进行多轮检测。
94.本发明优选的技术方案中，检测过程中不低于1轮的检测，优选为2轮到6轮；每轮检测中同时检测1种或1种以上的抗原。
95.本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
96.本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前解离洗脱的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、连接链与检测链互补配对的位置。
97.本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
98.本发明优选的技术方案中，所述检测信号可以连接于dna/rna检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
99.本发明优选的技术方案中，所述检测信号包括但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
100.本发明的优选技术方案中，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
101.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链、dna/rna放大链、dna/rna检测链中可含有碱基重复单元。
102.本发明优选的技术方案中，dna/rna放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
103.gtgatgtaggtggtagaggaattt-tt-ataaaccta-a-(ataaaccta-a)n‑ꢀ
ataaaccta-a(40≤n≤60)、
104.ctagatcgaactattcgaacactaaata-tt-catcatcat-a-(catcatcat-a)n‑ꢀ
catcatcat-a(40≤n≤60)、
105.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt-tt-aatactctc-a
‑ꢀ
(aatactctc-a)
n-aatactctc-a(40≤n≤60)、
106.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac-tt-a-caacttaac-a
‑ꢀ
(caacttaac-a)
n-caacttaac-a(40≤n≤60)、
107.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc-tt-ttcatttac-a
‑ꢀ
(ttcatttac-a)
n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
108.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg-tt-caatcaaaa-a
‑ꢀ
(caatcaaaa-a)
n-caatcaaaa-a(40≤n≤60)、
109.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact-tt-ccaataata-a
‑ꢀ
(ccaataata-a)
n-ccaataata-a(40≤n≤60)、
110.taggtttat-t-taggtttat-t-taggtttat-ttt-ttcatttac-a-(ttcatttac
‑ꢀ
a)
n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
111.atgatgatg-t-atgatgatg-t-atgatgatg-ttt-ttttctacc-a-(ttttctacc
‑ꢀ
a)
n-ttttctacc-a(40≤n≤60)、
112.gagagtatt-t-gagagtatt-t-gagagtatt-ttt-tccttttat-a-(tccttttat
‑ꢀ
a)
n-tccttttat-a(40≤n≤60)、
113.gttaagttg-t-gttaagttg-t-gttaagttg-ttt-ccttctatt-a-(ccttctatt
‑ꢀ
a)
n-ccttctatt-a(40≤n≤60)、
114.gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-ttt-ttattcact-a-ttattcact-a
‑ꢀ
(ttattcact-a)
n-ttattcact-a(40≤n≤60)、
115.ttttgattg-t-ttttgattg-t-ttttgattgttt-tcattactt-a-tcattactt-a
‑ꢀ
(tcattactt-a)
n-tcattactt-a(40≤n≤60)、
116.tattattgg-t-tattattgg-t-tattattgg-ttt-ttcttactc-a-ttcttactc-a
‑ꢀ
(ttcttactc-a)
n-ttcttactc-a(40≤n≤60)。
117.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
118.aaauuccucuaccaccuaca、
119.aaattcctctaccacctacatcac、tatttagtgttcgaatagtt、
120.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
121.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
122.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
123.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
124.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
125.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
126.aaauuccucuaccaccuacaucac。
127.本发明优选的技术方案中，dna/rna检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
128.待检测信号-tt-taggtttat-t-taggtttat-t、
129.待检测信号-tt-atgatgatg-t-atgatgatg-t、
130.待检测信号-tt-gagagtatt-t-gagagtatt-t、
131.待检测信号-tt-gttaagttg-t-gttaagttg-t、
132.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
133.待检测信号-tt-ttttgattg-t-ttttgattg-t、
134.待检测信号-tt-tattattgg-t-tattattgg-t、
135.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
136.待检测信号-tt-ggtagaaaa-t-ggtagaaaa-t、
137.待检测信号-tt-ataaaagga-t-ataaaagga-t、
ttttctacc-a(40≤n≤60)、
159.gagagtatt-t-gagagtatt-t-gagagtatt-ttt-tccttttat-a-(tccttttat
‑ꢀ
a)
n-tccttttat-a(40≤n≤60)、
160.gttaagttg-t-gttaagttg-t-gttaagttg-ttt-ccttctatt-a-(ccttctatt
‑ꢀ
a)
n-ccttctatt-a(40≤n≤60)、
161.gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-ttt-ttattcact-a-ttattcact-a
‑ꢀ
(ttattcact-a)
n-ttattcact-a(40≤n≤60)、
162.ttttgattg-t-ttttgattg-t-ttttgattgttt-tcattactt-a-tcattactt-a
‑ꢀ
(tcattactt-a)
n-tcattactt-a(40≤n≤60)、
163.tattattgg-t-tattattgg-t-tattattgg-ttt-ttcttactc-a-ttcttactc-a
‑ꢀ
(ttcttactc-a)
n-ttcttactc-a(40≤n≤60)。
164.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
165.aaauuccucuaccaccuaca、
166.aaattcctctaccacctacatcac、tatttagtgttcgaatagtt、
167.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
168.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
169.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
170.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
171.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
172.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
173.aaauuccucuaccaccuacaucac。
174.本发明优选的技术方案中，dna/rna检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
175.待检测信号-tt-taggtttat-t-taggtttat-t、
176.待检测信号-tt-atgatgatg-t-atgatgatg-t、
177.待检测信号-tt-gagagtatt-t-gagagtatt-t、
178.待检测信号-tt-gttaagttg-t-gttaagttg-t、
179.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
180.待检测信号-tt-ttttgattg-t-ttttgattg-t、
181.待检测信号-tt-tattattgg-t-tattattgg-t、
182.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
183.待检测信号-tt-ggtagaaaa-t-ggtagaaaa-t、
184.待检测信号-tt-ataaaagga-t-ataaaagga-t、
185.待检测信号-tt-aatgaaaga-t-aatgaaaga-t、
186.待检测信号-tt-agtgaataa-t-agtgaataa-t、
187.待检测信号-tt-aagtaatga-t-aagtaatga-t、
188.待检测信号-tt-gagtaagaa-t-gagtaagaa-t、
189.待检测信号-uu-guaaaugaa-u-guaaaugaa-u。
140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
205.本发明优选的技术方案中，dna/rna放大链与dna/rna连接链互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100 个，再优选9-70个，还优选10-50个。
206.本发明的优选技术方案中，dna/rna连接链之间、同一级dna/rna放大链之间(例如，一级链之间的配对，二级链之间的配对)、dna/rna检测链之间的可配对部分碱基长度为0-5个碱基对。
207.本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
208.本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前采用洗脱液解离洗脱掉的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、检测链与连接链互补配对的位置。
209.本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
210.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链、dna/rna放大链、dna/rna检测链中可含有碱基重复单元。
211.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna放大链包括但不限于以下序列 (5’端到3’端序列)：
212.gtgatgtaggtggtagaggaattt-tt-ataaaccta-a-(ataaaccta-a)n‑ꢀ
ataaaccta-a(40≤n≤60)、
213.ctagatcgaactattcgaacactaaata-tt-catcatcat-a-(catcatcat-a)n‑ꢀ
catcatcat-a(40≤n≤60)、
214.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt-tt-aatactctc-a
‑ꢀ
(aatactctc-a)
n-aatactctc-a(40≤n≤60)、
215.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac-tt-a-caacttaac-a
‑ꢀ
(caacttaac-a)
n-caacttaac-a(40≤n≤60)、
216.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc-tt-ttcatttac-a
‑ꢀ
(ttcatttac-a)
n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
217.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg-tt-caatcaaaa-a
‑ꢀ
(caatcaaaa-a)
n-caatcaaaa-a(40≤n≤60)、
218.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact-tt-ccaataata-a
‑ꢀ
(ccaataata-a)
n-ccaataata-a(40≤n≤60)、
219.taggtttat-t-taggtttat-t-taggtttat-ttt-ttcatttac-a-(ttcatttac
‑ꢀ
a)
n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
220.atgatgatg-t-atgatgatg-t-atgatgatg-ttt-ttttctacc-a-(ttttctacc
‑ꢀ
a)
n-ttttctacc-a(40≤n≤60)、
221.gagagtatt-t-gagagtatt-t-gagagtatt-ttt-tccttttat-a-(tccttttat
‑ꢀ
a)
n-tccttttat-a(40≤n≤60)、
222.gttaagttg-t-gttaagttg-t-gttaagttg-ttt-ccttctatt-a-(ccttctatt
‑ꢀ
a)
n-ccttctatt-a(40≤n≤60)、
223.gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-ttt-ttattcact-a-ttattcact-a
‑ꢀ
(ttattcact-a)
n-ttattcact-a(40≤n≤60)、
224.ttttgattg-t-ttttgattg-t-ttttgattgttt-tcattactt-a-tcattactt-a
‑ꢀ
(tcattactt-a)
n-tcattactt-a(40≤n≤60)、
225.tattattgg-t-tattattgg-t-tattattgg-ttt-ttcttactc-a-ttcttactc-a
‑ꢀ
(ttcttactc-a)
n-ttcttactc-a(40≤n≤60)。
226.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna连接链包括但不限于以下序列 (5’端到3’端序列)：
227.aaauuccucuaccaccuaca、
228.aaattcctctaccacctacatcac、
229.tatttagtgttcgaatagtt、
230.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
231.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
232.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
233.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
234.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
235.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
236.aaauuccucuaccaccuacaucac。
237.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna检测链包括但不限于以下序列 (5’端到3’端序列)：
238.待检测信号-tt-taggtttat-t-taggtttat-t、
239.待检测信号-tt-atgatgatg-t-atgatgatg-t、
240.待检测信号-tt-gagagtatt-t-gagagtatt-t、
241.待检测信号-tt-gttaagttg-t-gttaagttg-t、
242.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
243.待检测信号-tt-ttttgattg-t-ttttgattg-t、
244.待检测信号-tt-tattattgg-t-tattattgg-t、
245.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
246.待检测信号-tt-ggtagaaaa-t-ggtagaaaa-t、
247.待检测信号-tt-ataaaagga-t-ataaaagga-t、
248.待检测信号-tt-aatgaaaga-t-aatgaaaga-t、
249.待检测信号-tt-agtgaataa-t-agtgaataa-t、
250.待检测信号-tt-aagtaatga-t-aagtaatga-t、
251.待检测信号-tt-gagtaagaa-t-gagtaagaa-t、
252.待检测信号-uu-guaaaugaa-u-guaaaugaa-u。
253.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体两端或中间任意位置双功能化，一官能团连接抗体或抗原上对应的官能团，另一官能团连接dna/rna连接链上对应的官能团，连接中间体的双官能团中两种官能团的比例为一比一或一比多的任一种或多种。
254.本发明优选的技术方案中，所述抗体、抗原、dna或rna上用于与连接中间体反应或
连接的官能团包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
255.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的一种官能团与抗原或抗体上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
256.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的另一种官能团可以与dna/rna上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
257.本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的抗体或抗原分子，一个抗体或抗原分子可连接一个或同时连接多个连接中间体。
258.本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的dna连接链，一个一个连接中间体可连接一个或同时连接多个dna连接链。
259.本发明优选的技术方案中，所述检测链连接有待检测信号。
260.本发明优选的技术方案中，所述待检测信号可以连接于dna/rna检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
261.本发明优选的技术方案中，所述待检测信号选自但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
262.本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统可应用于免疫吸附直接法的检测中。
263.本发明的另一目的在于提供一种信号放大系统，所述的信号放大系统采用dna/rna放大链，其中，所述的dna/rna放大链可为一条或多条。
264.本发明的优选技术方案中，所述的dna/rna放大链可为一级放大或多级放大。
265.本发明的优选技术方案中，当dna/rna放大链为一条或多条时，dna/rna 放大链部分片段与dna/rna连接链碱基互补配对，同时dna/rna放大链的部分片段与一条或多条dna/rna检测链的碱基互补配对。本发明的优选技术方案中，当dna/rna放大链为多条时，一条dna/rna放大链部分片段与dna/rna 检测链互补配对，同时与其他多条dna/rna放大链互补配对。
266.本发明优选的技术方案中，当dna/rna放大链为多条时，dna/rna连接链与一条或多条dna/rna放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述dna/rna放大链再与一条或多条dna/rna放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者 dna/rna放大链部分片段与一条或多条dna/rna检测链的碱基互补配对。
267.本发明优选的技术方案中，当dna/rna放大链为多级放大时，dna/rna连接链与一级dna/rna放大链的部分片段的碱基互补配对，一级dna/rna放大链与一条或多条二级dna/rna放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级 dna/rna放大链与一条或多条dna/rna检测链的碱基互补配对。
268.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与dna/rna放大链或者dna/rna检测链通过碱基互补配对连接。
269.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与dna/rna放大链或者dna/rna连接链通过碱基互补配对连接。
270.本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
271.本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
272.本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
273.本发明的另一目的在于提供一种dna/rna放大链，该放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
274.gtgatgtaggtggtagaggaattt-tt-ataaaccta-a-(ataaaccta-a)n
‑ꢀ
ataaaccta-a(40≤n≤60)、
275.ctagatcgaactattcgaacactaaata-tt-catcatcat-a-(catcatcat-a)n
‑ꢀ
catcatcat-a(40≤n≤60)、
276.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt-tt-aatactctc-a
‑ꢀ
(aatactctc-a)n-aatactctc-a(40≤n≤60)、
277.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac-tt-a-caacttaac-a
‑ꢀ
(caacttaac-a)n-caacttaac-a(40≤n≤60)、
278.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc-tt-ttcatttac-a
‑ꢀ
(ttcatttac-a)n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
279.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg-tt-caatcaaaa-a
‑ꢀ
(caatcaaaa-a)n-caatcaaaa-a(40≤n≤60)、
280.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact-tt-ccaataata-a
‑ꢀ
(ccaataata-a)n-ccaataata-a(40≤n≤60)、
281.taggtttat-t-taggtttat-t-taggtttat-ttt-ttcatttac-a-(ttcatttac
‑ꢀ
a)n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
282.atgatgatg-t-atgatgatg-t-atgatgatg-ttt-ttttctacc-a-(ttttctacc
‑ꢀ
a)n-ttttctacc-a(40≤n≤60)、
283.gagagtatt-t-gagagtatt-t-gagagtatt-ttt-tccttttat-a-(tccttttat
‑ꢀ
a)n-tccttttat-a(40≤n≤60)、
284.gttaagttg-t-gttaagttg-t-gttaagttg-ttt-ccttctatt-a-(ccttctatt
‑ꢀ
a)n-ccttctatt-a(40≤n≤60)、
285.gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-ttt-ttattcact-a-ttattcact-a
‑ꢀ
(ttattcact-a)n-ttattcact-a(40≤n≤60)、
286.ttttgattg-t-ttttgattg-t-ttttgattgttt-tcattactt-a-tcattactt-a
‑ꢀ
(tcattactt-a)n-tcattactt-a(40≤n≤60)、
287.tattattgg-t-tattattgg-t-tattattgg-ttt-ttcttactc-a-ttcttactc-a
‑ꢀ
(ttcttactc-a)
n-ttcttactc-a(40≤n≤60)。
288.本发明的另一目的在于提供一种dna/rna连接链，该连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
289.aaauuccucuaccaccuaca、
290.aaattcctctaccacctacatcac、
291.tatttagtgttcgaatagtt、
292.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
293.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
294.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
295.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
296.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
297.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
298.aaauuccucuaccaccuacaucac。
299.本发明的另一目的在于提供一种dna/rna检测链，该检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
300.待检测信号-tt-taggtttat-t-taggtttat-t、
301.待检测信号-tt-atgatgatg-t-atgatgatg-t、
302.待检测信号-tt-gagagtatt-t-gagagtatt-t、
303.待检测信号-tt-gttaagttg-t-gttaagttg-t、
304.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
305.待检测信号-tt-ttttgattg-t-ttttgattg-t、
306.待检测信号-tt-tattattgg-t-tattattgg-t、
307.待检测信号-tt-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t、
308.待检测信号-tt-ggtagaaaa-t-ggtagaaaa-t、
309.待检测信号-tt-ataaaagga-t-ataaaagga-t、
310.待检测信号-tt-aatgaaaga-t-aatgaaaga-t、
311.待检测信号-tt-agtgaataa-t-agtgaataa-t、
312.待检测信号-tt-aagtaatga-t-aagtaatga-t、
313.待检测信号-tt-gagtaagaa-t-gagtaagaa-t、
314.待检测信号-uu-guaaaugaa-u-guaaaugaa-u。
315.本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统的制备方法，包括抗原或抗体-dna/rna连接链的制备、dna/rna放大链的制备。
316.本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-dna/rna连接链的制备为抗体或抗原通过连接中间体与dna/rna连接链相连，其中，所述连接中间体具有双官能团，一官能团与抗体或抗原相连，另一官能团与dna/rna连接链相连。
317.本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原或者dna连接链上的用于与连接中间体连接的官能团包括但不限于腙基、氨基、羧基、羟基、巯基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
318.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体的双官能团中一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羧基反应连接；或者一个官能团可以氨基反应连接，另一官能团可与羟基的反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羧基结合，另一官能团可与羟基结合；或者一个官能团可与羧基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羟基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或任何其他可行的连接方案。
319.本发明优选的技术方案中，抗体或抗原上的氨基与连接中间体上的一个官能团反
应连接，而dna/rna连接链上的巯基与连接中间体上的另一个官能团反应连接。
320.本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-dna/rna连接链的制备包括下述步骤：
321.(1)将抗原或抗体、连接中间体，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合， 0-50℃反应，形成抗原或抗体-连接中间体；
322.(2)将抗原或抗体-连接中间体、dna/rna连接链，按摩尔比1:0.01
‑ꢀ
1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-dna/rna连接链。
323.本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.05-1:1000，优选为1:0.1-1:100。
324.本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，反应温度为1-25℃，优选为2
‑ꢀ
8℃。
325.本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗原或抗体-连接中间体可通过脱盐离心柱或超滤进行纯化。
326.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，抗原或抗体-连接中间体、dna/rna 连接链的摩尔比为1:0.05-1:1000，优选为1:0.1-1:100。
327.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，反应温度为1-25℃，优选为2
‑ꢀ
8℃。
328.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述的抗原或抗体-dna/rna连接链可采用超滤离心纯化或透析纯化。
329.本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-dna/rna连接链连接成功的验证方法，包括使用质谱进行验证。
330.本发明优选的技术方案中，所述质谱选自基质辅助激光解吸飞行时间质谱(maldi-tof)、电喷雾离子化质谱(esi-ms)的任一种或其组合。
331.本发明的优选技术方案中，dna/rna放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
332.gtgatgtaggtggtagaggaattt-tt-ataaaccta-a-(ataaaccta-a)n
‑ꢀ
ataaaccta-a(40≤n≤60)、
333.ctagatcgaactattcgaacactaaata-tt-catcatcat-a-(catcatcat-a)n
‑ꢀ
catcatcat-a(40≤n≤60)、
334.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt-tt-aatactctc-a
‑ꢀ
(aatactctc-a)n-aatactctc-a(40≤n≤60)、
335.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac-tt-a-caacttaac-a
‑ꢀ
(caacttaac-a)n-caacttaac-a(40≤n≤60)、
336.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc-tt-ttcatttac-a
‑ꢀ
(ttcatttac-a)n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
337.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg-tt-caatcaaaa-a
‑ꢀ
(caatcaaaa-a)n-caatcaaaa-a(40≤n≤60)、
338.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact-tt-ccaataata-a
‑ꢀ
(ccaataata-a)n-ccaataata-a(40≤n≤60)、
339.taggtttat-t-taggtttat-t-taggtttat-ttt-ttcatttac-a-(ttcatttac
‑ꢀ
a)n-ttcatttac-a(40≤n≤60)、
340.atgatgatg-t-atgatgatg-t-atgatgatg-ttt-ttttctacc-a-(ttttctacc
‑ꢀ
a)n-ttttctacc-a(40≤n≤60)、
341.gagagtatt-t-gagagtatt-t-gagagtatt-ttt-tccttttat-a-(tccttttat
‑ꢀ
a)n-tccttttat-a(40≤n≤60)、
342.gttaagttg-t-gttaagttg-t-gttaagttg-ttt-ccttctatt-a-(ccttctatt
‑ꢀ
a)n-ccttctatt-a(40≤n≤60)、
343.gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-t-gtaaatgaa-ttt-ttattcact-a-ttattcact-a
‑ꢀ
(ttattcact-a)n-ttattcact-a(40≤n≤60)、
344.ttttgattg-t-ttttgattg-t-ttttgattgttt-tcattactt-a-tcattactt-a
‑ꢀ
(tcattactt-a)n-tcattactt-a(40≤n≤60)、
345.tattattgg-t-tattattgg-t-tattattgg-ttt-ttcttactc-a-ttcttactc-a
‑ꢀ
(ttcttactc-a)n-ttcttactc-a(40≤n≤60)。
346.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna放大链的制备方法包括下述步骤：
347.(1)将聚合酶和相应的引物按一定比例混合并反应一定时间；
348.(2)反应完成后，灭活聚合酶，制得的dna/rna放大链反应产物；
349.(3)所得dna/rna放大链直接使用或进行纯化后使用。
350.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna放大链合成后不纯化直接使用。本发明优选的技术方案中，所述dna/rna放大链合成后纯化时所采用的纯化方法包括但不限于切胶回收、高效液相色谱法，凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、超滤离心、透析、沉淀法、结晶法等纯化方法中的一种或多种。
351.本发明的优选技术方案中，dna/rna连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
352.aaauuccucuaccaccuaca、
353.aaattcctctaccacctacatcac、
354.tatttagtgttcgaatagtt、
355.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
356.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
357.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
358.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
359.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
360.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
361.aaauuccucuaccaccuacaucac。
362.本发明的另一目的在于多重信号放大系统在免疫吸附直接法检测中的应用。
363.本发明的另一目的在于多重信号放大检测系统在免疫吸附直接法检测中的应用。
364.本发明中，“dna/rna”是指dna或rna。
365.本发明中，“抗体/抗原”是指抗体或抗原。与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
366.1、本发明是一种基于dna或rna互补配对的信号放大系统，通过dna/rna 连接链和一条dna/rna放大链连接，dna/rna放大链与多个dna/rna检测链连接，实现信号单级多重放
大；另外，dna/rna放大链还可与多个放大链连接，实现二级多重放大，甚至三级以上放大。本发明不仅实现了待检测抗原或抗体的浓度检测，并且降低了检测限，灵敏度更高。
367.2、本发明每一轮可以同时检测多种抗原或抗体的浓度。
368.3、本发明可以实现抗体或抗原的多轮检测，且可实现检测链、放大链、连接链互补配对部分的选择洗脱，适用性更广，降低时间成本和材料成本。
369.4、本发明中可量化偶联到每个抗原或抗体上的dna/rna连接链的数量。
附图说明
370.图1抗体与dna/rna连接链的缀合过程。(1)抗体与中间连接体结合；(2) 抗体缀合中间连接体，制得的抗体-连接中间体偶联物，再与dna/rna连接链结合；(3)抗体与dna/rna连接成为抗体-dna/rna连接链。
371.图2本发明所述检测系统信号放大的原理机制。其中图a表示一级多重信号放大系统示意图，图b表示二级多重信号放大系统示意图。(1)引物z*
‑ꢀ
a和发夹在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物1:z*-aaaa
…
aa；(2) 长链复合物1与抗体上的dna/rna连接链z结合；(3)检测链a*a*与已经连接到抗体上的长链复合物1结合并发光，实现单次多重信号放大；(4)与步骤1同理，引物在a*a*-b和发夹在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物2:a*a*-bbbb
…
bb；(5)长链复合物2与已经连接到抗体上的长链复合物 1结合；(6)检测链b*b*与已经连接到抗体上的长链复合物2结合并发光，实现2次多重信号放大。
372.代表抗体。
373.代表互补链。例如单链dna或rna：a链表示某一dna或rna的序列，那么a*表示a链的互补链的序列。
374.代表荧光基团
375.图3二级多重放大系统的免疫吸附直接法检测流程。(1)在固相基质上包被抗原；(2)抗原与抗体-dna/rna连接链结合；(3)加入一级dna放大链进行一次信号放大；(4)加入二级dna放大链进行二次信号放大；(5)孵育 2条检测链并随之进行第一轮信号检测；(6)将上一步骤中的2条检测链洗掉，并孵育另外2条检测链后进行第二轮检测。
376.代表抗体。
377.代表互补链。例如单链dna或rna：a链表示某一dna或rna片段序列，那么a*表示a链互补链的序列。
378.代表抗原1
379.代表抗原2
380.代表抗原3
381.代表抗原4
382.代表绿色荧光基团a
383.代表红色荧光基团b
具体实施方式
384.下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
385.实施例1采用一级多重放大系统和直接法检测多种抗体
386.采用直接法同时检测4种抗体的浓度，四种抗体分别为il-10抗体，tgf
‑ꢀ
β抗体，ifn-γ抗体和tnf-α抗体。
387.一、抗原-dna/rna连接链的制备(以人tgf-β和dna连接链2的连接为例)
388.(1)将抗原通过超滤离心(100kda mwco)浓缩至2mg/ml，去除叠氮化物和其他防腐剂。
389.(2)抗体与连接中间体聚乙二醇化的长链smcc(sm(peg)2)(摩尔比1:20) 在4℃反应3小时，sm(peg)2具有双官能团，一个官能团可与抗原上氨基反应连接，另一个官能团可与巯基反应连接。
390.(3)通过脱盐离心柱(7000da mwco)去除多余的sm(peg)2。
391.(4)将巯基化修饰的dna连接链2(tatttagtgttcgaatagtt)与连接中间体修饰的抗原混合(摩尔比15:1)，4℃反应12小时。
392.(5)通过超滤离心管(100kda mwco)纯化抗原-dna连接链。
393.(6)抗体与dna连接成功的验证：使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱 (maldi-tof)验证是否成功地将dna连接链偶联到抗原上，并量化偶联到每个抗原上的dna数量。结果显示，每个抗原上连接上了1个dna连接链。
394.二、dna放大链的制备(以c.1放大链的制备为例)
395.(1)在100μlpbs反应液中分别加入10mm mgso4，80units/ml的聚合酶，600μm的datp/dctp/dttp，10μm发卡结构h.1.1和10μm相应的引物p.1，将反应液置于37℃反应9小时。
396.(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
397.(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(含30mm乙二胺四乙酸，50％甘油， 0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)按照9:1的体积比混合后在95℃反应5分钟。
398.(4)制备6％tbe-urea page胶，采用gelred为染料。
399.(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75v，运行30分钟，在泳道中分别加入样品和dl 1000dna marker，将电压调至200v，运行25分钟。
400.(6)将目的dna条带从凝胶中切下，通过dna回收试剂盒进行纯化回收，冻干回收的dna，-20℃保存。
401.三、采用直接法检测多种抗体
402.(1)将4种不同的抗体(人il-10抗体/人ifn-γ/人tnf-α/人tgf
‑ꢀ
β)用包被液(50mm na2co3/nahco
3 in pbs)混合并包被至96孔板，4℃过夜。在实验中，将每种抗体的标准品分别稀释成不同浓度以制备标准曲线用于定量计算待检测抗体的浓度。
403.(2)去除未与96孔板结合的4种抗体并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％bsa in pbs)，37℃封闭2小时。
404.(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20)洗涤3遍，加入4种检测抗原
–
dna/rna连接链(人il-10/人ifn-γ/人tnf-α/人tgf-β)(il
‑ꢀ
10连接rna连接链1，tgf-β连接dna连接链2，ifn-γ连接dna连接链3， tnf-α连接dna连接链4)，用封闭液将各个检测抗原稀释至2μg/ml，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
405.(4)去除各个检测抗原并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液 (15％甲酰胺,1mm edta)洗涤1遍并加入4种一级dna放大链(60nm-150 nm)，37℃过夜孵育。
406.(5)去除dna放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液 (500mm nacl in 1mm tris-hcl)洗涤1遍，加入第一轮的两种rna检测链i.1*和dna检测链i.2*(1μm)，室温反应1小时，i.1*上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.2*上连接有红色荧光信号 (激发波长579nm，发射波长620nm)。
407.(6)去除未结合的游离检测链后同时检测两种检测链i.1*和i.2*上的不同荧光信号强度。
408.(7)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液(45％甲酰胺)，反应30分钟。
409.(8)去除解离缓冲液，用pbs缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2 遍，加入第二轮检测的两种检测链i.3*和i.4*(1μm)并室温反应1小时， i.3*dna上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.4*上连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
410.(9)去除未结合的游离检测链后同时检测两种dna检测链i.3*和i.4* 上的不同荧光信号强度。
411.(10)将每种抗体的标准品分别稀释成不同浓度，制备标准曲线用于定量计算待检测抗体的浓度。根据不同浓度抗体标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗体样品中不同的信号强度，计算每种抗体的浓度。
412.四、实验结果
413.四种抗体的浓度检测结果与四种抗体已知浓度一致。il-10抗体浓度为 90.0ng/ml，检测信号强度带入标准曲线方程的计算浓度为88.5ng/ml；tgf
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β抗体浓度为75.0ng/ml，检测浓度为76.3ng/ml；inf-γ抗体浓度为50.0 ng/ml，检测浓度为48.4ng/ml；tnf-α抗体浓度为25.0ng/ml，检测浓度为 26.2ng/ml。
414.实施例2使用二级多重放大系统和免疫吸附直接法检测抗原
415.在本实施例中，采用直接法同时检测4种抗原的浓度，四种抗原分别为il
‑ꢀ
10，tgf-β，ifn-γ和tnf-α。
416.一、抗体和dna/rna连接链的制备(以anti-human inf-γ抗体和dna-连接链1的连接为例)
417.(1)将抗体(anti-human inf-γantibody)通过超滤离心管(100kdamwco)浓缩到2mg/ml，去除掉叠氮化物和其他防腐剂。
418.(2)通过脱盐离心柱(7000da mwco)将抗体交换至pbs缓冲液中(ph 7.4)。
419.(3)抗体与连接中间体smcc(琥珀酰亚胺基4-[n-马来酰亚胺甲基]
[0420]
环己烷-1-羧化物)(摩尔比1:20)在4℃下反应3小时。
[0421]
(4)通过脱盐离心柱(7000da mwco)去除多余的连接中间体。
[0422]
(5)将与连接中间体相连接的抗体与巯基修饰的dna混合(摩尔比1:15)，4℃下反应12小时。
[0423]
(6)通过超滤离心管(100kda mwco)纯化抗体-dna连接链。
[0424]
(7)抗体与dna连接链连接成功的验证：使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(maldi-tof)验证是否成功地将dna连接链偶联到抗体上，并量化偶联到每个抗体上的dna的数量。实验结果显示，每个抗体上连接上了1个dna连接链。
[0425]
二、dna放大链的制备(以c.1放大链的制备为例)
[0426]
以可以部分互补配对的一级放大链c.1和二级放大链c.8为例。
[0427]
c.1一级放大链的制备同实施例1，c.8二级放大链的制备过程如下：
[0428]
(1)在100μl反应液中分别加入10mm mgso4,80units/ml的聚合酶， 600μm的datp/dctp/dttp，10μm h.8.8和10μm相应的引物p.8，将反应液置于37℃作用9小时。
[0429]
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
[0430]
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(含30mm乙二胺四乙酸，50％甘油， 0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)按照体积比9:1混合后在95℃反应5分钟。
[0431]
(4)制备6％tbe-urea page胶或者1％琼脂糖凝胶，采用gelred为染料。
[0432]
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75v，运行30分钟，之后在泳道中分别加入样品和dl 1000dna marker，将电压调至200v，运行25分钟。
[0433]
(6)将目的dna条带从凝胶中切下，通过dna回收试剂盒进行纯化回收，回收后的dna进行冻干，之后放入-20℃进行保存。
[0434]
同理制得其他所需放大链。
[0435]
三、采用免疫吸附直接法检测多种抗原
[0436]
(1)将4种不同的抗原(human il-10/human ifn-γ/human tnf-α/ human tgf-β)用包被液(50mm na2co3/nahco
3 in pbs)混合并包被至96孔板，4℃过夜。在实验中，将每种抗原的标准品分别稀释成不同浓度以制备标准曲线用于定量计算待检测抗原的浓度。
[0437]
(2)去除4种包被抗原未被包被的剩余溶液并用洗涤缓冲液(0.1％tween
‑ꢀ
20in pbs)洗涤3次，加入封闭液(1％bsa in pbs)，37℃封闭2小时。
[0438]
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入4种检测抗体(anti
‑ꢀ
human il-10antibody/anti-human ifn-γantibody/anti-human tnf
‑ꢀ
αantibody/anti-human tgf-βantibody)-dna连接链，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/ml并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
[0439]
(4)去除各个检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液 (15％甲酰胺,1mm edta)洗涤1遍，加入4种dna一级放大链c.1、c.2、c.3、c.4 (60nm-150nm)，37℃孵育过夜。
[0440]
(5)去除一级dna放大链，用杂交洗涤液洗涤3遍，然后加入与一级dna放大链部分互补的4种二级dna放大链c.8、c.9、c.10、c.11(60nm-150nm)， 37℃孵育5个小时。
[0441]
(6)去除dna放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液(500 mm nacl in 1mm tris-hcl)洗涤1遍，加入第一轮的两种dna检测链i.8*、 i.9*(1μm)于室温反应1小时，一种dna检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，一种dna检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
[0442]
(7)去除dna检测链，并用检测缓冲液洗涤2遍，同时检测两种dna检测链上的不同荧光信号强度。
[0443]
(8)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液(45％甲酰胺in pbs)，室温反应30分钟。
[0444]
(9)去除解离缓冲液，用pbs缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第二轮检测的两种检测链i.10*、i.11*(1μm)，室温反应1小时，一种 dna检测链上连有绿色荧光信号，一种dna检测链连接有红色荧光信号。
[0445]
(10)去除检测链，并用检测缓冲液洗涤2遍，同时检测两种dna检测链上的不同荧光信号强度。
[0446]
(11)根据不同浓度抗原标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗原样品中不同的信号强度和标准曲线计算每种抗原的浓度。
[0447]
四、实验结果
[0448]
在本实验中，四种抗原的浓度已知，检测结果与四种抗原已知浓度一致。
[0449]
已知il-10浓度为90.0pg/ml，检测结果带入标准曲线方程后计算浓度为 91.5pg/ml。已知tgf-β1浓度为100.0pg/ml，检测结果带入标准曲线方程后计算浓度为97.6pg/ml。已知inf-γ浓度为30.0ng/ml，检测结果带入标准曲线方程后计算浓度为29.1ng/ml。已知tnf-α浓度为20.0ng/ml，检测结果带入标准曲线方程后计算浓度为21.5ng/ml。
[0450]
本实施例采用的是第一步包被抗原，然后加入dna修饰的抗体采用直接法检测抗原，在实际中也也可以第一步包被抗体然后加入dna修饰的抗原并检测抗体。
[0451]
实施例3采用二级多重信号放大系统和直接法进行三轮检测
[0452]
一、抗体和dna连接链的制备
[0453]
抗体-dna连接链的制备同实施例2，制得il-2抗体-dna连接链7、il-7 抗体-dna连接链2、il-15抗体-dna连接链3、il-17抗体-dna连接链4、tnf-α抗体-dna连接链5、il-6-dna连接链6。
[0454]
二、dna放大链的制备
[0455]
dna放大链的制备同实施例2，制得dna放大连c.2-c.7，c.9-c.14。
[0456]
三、采用直接法检测多种抗原
[0457]
(1)将6种不同的抗原(human il-2/human il-7/human il-15/ human il-17/human tnf-α/human il-6)混合，用包被液将每种包被抗原的浓度稀释至10μg/ml，将混合液包被至96孔板，4℃过夜。
[0458]
(2)去除未与96孔板结合的6种包被抗原并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入封闭液，37℃封闭2小时。
[0459]
(3)去除封闭液并用洗涤缓冲液洗涤3遍，加入6种检测抗体(anti
‑ꢀ
human il-2 detection antibody/anti-human il-7 detection antibody/ anti-human il-15 detection antibody/anti-human il-17 detectionantibody/anti-human tnf-αdetection antibody/anti-human il-6detection antibody)-dna连接链(见表7)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/ml并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
[0460]
(4)去除未结合的检测抗体用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺)洗涤1遍并加入6种dna一级放大链c.7、c.2、c.3、c.4、 c.5和c.6(60nm-150nm)，37℃过夜孵育。
[0461]
(5)去除一级dna放大链，用杂交洗涤液洗涤3遍，然后加入与一级dna 放大链部分互补的6种二级dna放大链c.14、c.9、c.10、c.11、c.12和c.13 (60nm-150nm)，37℃孵育5个
小时。
[0462]
(6)去除dna放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液洗涤1遍，加入第一轮的两种dna检测链i.14*和i.9*(1μm)，室温反应1 小时，i.14*dna检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)， i.9*dna检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
[0463]
(7)去除未结合的游离dna检测链，然后同时检测两种dna检测链的荧光信号强度。
[0464]
(8)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
[0465]
(9)去除解离缓冲液，用pbs缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2 遍，加入第二轮检测的两种检测链i.10*和i.11*(1μm)并于室温反应1小时，i.10*dna检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)， i.11*dna检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
[0466]
(10)去除未结合的游离dna检测链然后同时检测两种dna检测链的荧光信号强度。
[0467]
(11)去除检测缓冲液，加入解离缓冲液，室温反应20分钟。
[0468]
(12)去除解离缓冲液，用pbs缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2 遍，加入第三轮检测的两种检测链i.12*和i.13*(1μm)并于室温反应1小时，i.12*dna检测链上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)， i.13*dna检测链连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm)。
[0469]
(13)去除未结合的游离dna检测链然后同时检测两种dna检测链的荧光信号强度。
[0470]
(14)将每种抗原的标准品分别稀释成不同浓度，制备标准曲线用于定量计算待检测抗原的浓度。根据不同浓度抗原标准品绘制标准曲线，并根据待检测抗原样品中不同的信号强度，计算每种抗原的浓度。
[0471]
四、实验结果
[0472]
在本实验中，6种抗原的浓度已知，检测结果与6种抗原已知浓度一致。已知il-2浓度为45.0pg/ml，检测浓度为45.1pg/ml；已知il-7浓度为 12.0pg/ml，检测浓度为11.7pg/ml；已知il-15浓度为100.0pg/ml，检测浓度为103.6pg/ml；已知il-17浓度为100.0pg/ml，检测浓度为102.6 pg/ml；已知tnf-α浓度为25.0pg/ml，检测浓度为24.1pg/ml；已知il-6 浓度为10.0pg/ml，检测荧光值带入标准曲线方程后计算浓度为9.4pg/ml。
[0473]
表1.用于连接抗体的dna/rna连接链序列(从5’端到3’端)
[0474]
dna/rna连接链序列编号dna/rna连接链序列rna连接链1aaauuccucuaccaccuacadna连接链2tatttagtgttcgaatagttdna连接链3aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataacccdna连接链4gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacagdna连接链5gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaatdna连接链6caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactcdna连接链7agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc
[0475]
表2.用于放大链制备的引物和发夹序列(从5’端到3’端)
[0476][0477][0478]
表3.dna放大链序列(从5’端到3’端)
[0479][0480]
表4.用于荧光检测的dna检测链序列信息(从5’端到3’端)
[0481]
[0482][0483]
表5.实施例1中用于一级多重信号放大免疫吸附检测的连接链、放大链和检测链
[0484]
被检测抗原dna/rna连接链dna一级放大链dna/rna检测链il-10rna连接链1c.1i.1*tgf-βdna连接链2c.2i.2*inf-γdna连接链3c.3i.3*tnf-αdna连接链4c.4i.4*
[0485]
表6.实施例2中用于二级多重信号放大免疫吸附检测的连接链、放大链和检测链
[0486][0487]
表7.实施例3中用于六重抗原检测的抗体以及dna连接链、放大链和检测链
[0488]
[0489][0490]
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。