一种检测植物中转基因事件的方法

1.本发明涉及转基因作物的简单、直观检测方法，具体的涉及复合性状的转基因 作物的检测方法，属于生物技术、农业科学领域。


背景技术：

2.自从1996年转基因作物大规模种植以来，越来越多的转化事件被应用于不同的 农作物中以满足人们对食品，饲料，服饰及其他日常用品的需求。但是这些转化事 件必须依据当地相关法律法规得到正式批准后才能在一个国家进行流通。近年来， 随着新的转化事件的不断出现，出现了将新转化事件同已有的优异的转化事件进行 基因叠加的趋势，截止2014年，全世界由基因叠加引起的带有复合性状的转基因农 作物种植面积已占全部转基因作物种植面积的28.3％。按照我国转基因管理相关法 律规定，通过杂交等手段获得的含有多个转化事件的基因叠加转基因作物，即使单 个转化事件都获得过批准，仍然需要按照新的转基因产品类型重新进行安全评价。 目前国外已经商品化种植的具有复合性状的转基因作物中有相当一部分并没有依 据我国转基因生物安全管理相关法律进行重新申报和批准。基因叠加的具有复合性 状转基因产品的检测是当前我国转基因监管工作的重要内容。如何简单、直观的检 测这些非法的具有复合性状的转基因作物给我国转基因生物安全管理提出了新的 挑战！
3.目前，具有复合性状的转基因作物的检测流程通常是：将农作物种子进行混合 后利用转基因通用元件进行初步筛查，然后利用转化事件特异性pcr鉴定阳性样品 的具体转化事件，最后提取单粒种子基因组dna分别进行转化事件分析，鉴定单粒 种子中是否含有多个转化事件。这种分析流程目前普遍采用荧光pcr和数字pcr等 技术对大量混合样品中单粒种子进行多个转基因转化事件的平行检测，因此需要繁 琐复杂的操作步骤和较高的试剂和人力成本，并非是理想的分析方式。由于基因叠 加生产复合性状转基因产品的目的是聚合不同的转基因外源蛋白从而获得多种性 状，我们可以利用不同颜色荧光染料(如cy3和fitc等)标记不同转基因蛋白抗体， 建立直观、简单检测复合转基因复合性状的免疫荧光新方法。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种基于免疫荧光方法，检测样品中含有的转基因事件数量的方 法、试剂盒和应用。
5.方法
6.本发明一方面提供了一种检测样品中含有的转基因事件的方法，所述方法包括 用第一荧光染料标记第一靶标抗体，用第二荧光染料标记第二靶标抗体；通过样品 处理、石蜡包埋切片、石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、屏蔽自发荧光处理、免疫荧 光染色和镜检拍照后，根据观察到的荧光颜色判断待测样品中的转基因事件数量。
7.所述第一靶标事件和第二靶标事件是不同的靶标事件，优选的，第一靶标事件 和
第二靶标事件分别是pat/bar和cp4-epsps靶标抗体。
8.所述第一荧光染料和第二荧光染料是不同的荧光染料，优选的第一荧光染料和 第二荧光染料分别是fitc(红色)和cy3(绿色)。
9.当第一荧光染料和第二荧光染料分别是fitc(红色)和cy3(绿色)的情况 下，观察荧光时，若无荧光，则无目标转化事件，若有红色或绿色的荧光，则有一 种转化事件，若观察到的荧光为黄色，则是fitc(红色)和cy3(绿色)叠加产生， 说明样品中有两种转化事件。
10.所述屏蔽自发荧光处理是指用磷酸缓冲液与硼氢化钠的混合液和苏丹黑b的 无水乙醇溶液处理，可以显著降低背景荧光，提高检测的效率。
11.在一种实施方式中，所述样品可以来源于动物、植物和微生物中的一种或多种。
12.在一种实施方式中，所述样品可以是新鲜的组织，也可以是经过处理的。
13.在一种实施方式中，所述方法还包括用第三荧光染料标记第三靶标抗体，以便 于检测0种，1种，2种，3种转基因事件。
14.在一种实施方式中，所述方法还包括用第三荧光染料标记第三靶标抗体，用来 检测0-3种转基因事件，所述第三靶标抗体是与第一靶标抗体和第二靶标抗体不同 的靶标抗体，所述第三荧光染料是与第一荧光染料和第二荧光染料不同的荧光染 料。
15.在一种实施方式中，所述样品处理是取植物的任意部分烘干并研磨成粉末后， 用3％琼脂，投入faa固定液中固定，优选的植物的任意部分是指种子，更优选的 是油菜的种子。
16.在一种实施方式中，所述石蜡包埋切片是将切好的组织于脱水机内依次梯度酒 精进行脱水和浸蜡，待蜡凝固冷却后，切片，烤片，常温保存备用。
17.在一种实施方式中，所述石蜡切片脱蜡至水是将切片依次进行二甲苯、无水乙 醇、酒精、蒸馏水处理。
18.在一种实施方式中，所述抗原修复是将组织切片置于edta抗原修复缓冲液 (ph 9.0)和pbs(ph7.4)中处理，优选的，缓冲液和操作条件可以根据样品的种 类进行调整。
19.在一种实施方式中，所述屏蔽自发荧光处理是指用依次加入自发荧光淬灭剂a 和自发荧光淬灭剂b，最后进行血清封闭；所述自发荧光淬灭剂a是为ph7.4的 磷酸缓冲液与硼氢化钠的混合；所述自发荧光淬灭剂b是苏丹黑b与无水乙醇的混 合液。具体而言，自发荧光淬灭剂a的制备方法如下：分别称取nacl 8.0g，kcl 0.2g， na2hpo4 1.44g，kh2po4 0.24g，加入超纯水溶解定容1000ml，得到ph为7.4的磷 酸缓冲液；称取10mg硼氢化钠溶于10ml ph为7.4的磷酸缓冲液中即得自发荧光 淬灭剂a。自发荧光淬灭剂b的制备方法如下：称取苏丹黑b 0.5g，于70％酒精中 溶解，过滤备用。
20.在一种实施方式中，所述免疫染色是指将玻片脱色后，用荧光染料标记的转基 因靶标抗体标记靶标，脱色后进行封片。
21.试剂盒
22.另一方面，本发明还提供了一种高效检测样品中含有的转基因事件数量的试剂 盒。
23.所述试剂盒包括针对样品中靶标抗体分别设计的第一荧光染料和第二荧光染 料。
24.优选的，所述试剂盒还包括进行荧光免疫实验所需要的试剂和仪器，优选的， 还
包括屏蔽自发荧光处理所需要的溶液。
25.优选的，所述试剂盒还包括处理样品所需要的试剂和仪器。
26.组合物
27.另一方面，本发明还提供了一种高效检测样品中含有的转基因事件数量的组合 物。
28.所述组合物包括针对样品中靶标抗体分别设计的第一荧光染料和第二荧光染 料。
29.优选的，所述组合物还包括进行荧光免疫实验所需要的试剂和仪器，优选的， 还包括屏蔽自发荧光处理所需要的溶液。
30.优选的，所述组合物还包括处理样品所需要的试剂。
31.应用
32.另一方面，本发明还提供了上述试剂盒在检测样品中含有的转基因事件数量中 的应用。
附图说明
33.图1.a：pat/bar蛋白观察到的绿色，b：细胞核的蓝色荧光(背景荧光),c： 蓝色和绿色的叠加。
34.图2.a：cp4-epsps蛋白观察的红色，b：细胞核的蓝色荧光(背景荧光),c： 蓝色和红色的叠加。
35.图3.a：pat/bar蛋白观察到的绿色，b：cp4-epsps蛋白观察的红色,c：细 胞核的蓝色荧光(背景荧光),d：蓝色、红色和绿色的叠加。
具体实施方式
36.实施例1对转基因事件数量进行检测
37.植物软化处理
38.1.将样品转入培养皿中37℃烤箱恒温干燥48h
39.2.样品放入组织研磨仪中，充分研磨后收集组织粉末
40.3.取粉末样本1g，充分混匀后，转入ep管中并用3％琼脂包裹组织粉末， 待琼脂冷却凝固后投入
41.faa固定液中(幼嫰植物选取50％浓度，老硬组织选取70％浓度)固定24h.
42.4.取出流水冲洗2-4h
43.5.如需长期保存可转回faa固定液中
44.样品石蜡包埋切片1、取材：新鲜组织固定于faa固定液24h以上。将组 织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对 应的标签放于脱水盒内。
45.2、脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精 4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇i 30min-无水乙醇ii 30min-醇 苯5-10min-二甲苯i 5-10min-二甲苯ii 5-10min-蜡i1h-蜡ii 1h-蜡iii 1h。
46.3、包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框， 待蜡
凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的 标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
47.4、切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4-6μm。切片漂浮 于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内 烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
48.石蜡切片脱蜡至水
49.依次将切片放入二甲苯ⅰ15min-二甲苯ⅱ15min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇
ꢀⅱ
5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。
50.抗原修复
51.组织切片置于盛满edta抗原修复缓冲液(ph 9.0)的修复盒中于微波炉内 进行抗原修复。中火至沸后断电间隔10min中低火至沸，此过程中应防止缓冲液 过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动 洗涤3次，每次5min。
52.免疫荧光染色
53.加荧光标记抗体(cy3-bar抗体和fitc-epsps抗体)：轻轻甩掉封闭液，在切 片上滴加pbs按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿 盒内加少量水防止抗体蒸发)；
54.dapi复染细胞核：玻片置于pbs(ph 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加dapi染液，避光室温孵育10min；
55.封片：玻片置于pbs(ph 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
56.镜检拍照
57.切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
58.结果分析
59.如图1.a pat/bar蛋白观察到的绿色，b细胞核的蓝色荧光(背景荧光),c蓝 色和绿色的叠加。如果样品观察到的如图1c所示，则说明样品中只有pat/bar蛋 白，就说明样品中含有一种转化事件。
60.图2.a cp4-epsps蛋白观察的红色，b细胞核的蓝色荧光(背景荧光),c蓝 色和红色的叠加。如果样品观察到的如图2c所示，则说明样品中只有cp4-epsps 蛋白，就说明样品中含有一种转化事件。
61.图3.a pat/bar蛋白观察到的绿色，b cp4-epsps蛋白观察的红色,c细胞核 的蓝色荧光(背景荧光),蓝色、红色和绿色的叠加。如果样品观察到的如图3c所 示，就说明样品中含有两种转化事件。
62.实施例2灵敏度的检测
63.按照实施例1中的实验方法进行操作，准备只含有pat/bar转基因事件的a油菜 种子，只含有cp4-epsps转基因事件的b油菜种子，同时含有cp4-epsps和pat/bar 转基因事件的c油菜种子。将abc三种油菜种子，以0.1％的比例与非转基因油菜种 子混合，后进行检测。
64.结果显示，在转基因种子只有0.1％的情况下，荧光免疫方法可以准确的鉴定出 待测样品的转基因数量，其检测灵敏度为0.1％。
65.实施例3经过屏蔽自发荧光处理后，灵敏度的检测
66.按照实施例1-2中的实验方法进行操作，具体的，在抗原修复之后，进行屏蔽 自发荧光的操作，具体操作如下：依次加入自发荧光淬灭剂a和自发荧光淬灭剂b， 最后进行血清封闭；所述自发荧光淬灭剂a是为ph 7.4的磷酸缓冲液与硼氢化钠的 混合；所述自发荧光淬灭剂b是苏丹黑b与无水乙醇的混合液；先加入自发荧光淬灭 剂a,室温孵育10-20min，清洗；之后，加入自发荧光淬灭剂b，室温孵育10-15min， 清洗，之后再进行免疫荧光染色、观察。
67.将abc三种油菜种子以更低的比例混合在非转基因种子中，并且进行屏蔽自发 荧光处理。检测结果显示，经过屏蔽自发荧光处理后，更低比例的转基因种子也可 以被检测出来，灵敏度有所提升；与不屏蔽自发荧光对照相比，检测灵敏度能提高 10倍左右。
68.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利 要求书所限定的范围。