一种伏立康唑M3中偶氮二异丁腈的检测方法与流程

一种伏立康唑m3中偶氮二异丁腈的检测方法
技术领域
1.本发明涉及医药原料药中技术分析领域，具体涉及一种伏立康唑m3中偶氮二异丁腈的检验方法。


背景技术：

2.伏立康唑（vrz）是具有广谱抗真菌活性的第二代三唑类抗真菌药物，是侵袭性曲霉感染和克柔念珠菌感染的一线治疗药物，其抗菌谱广，抗菌活性高，是深部曲霉菌感染首选，经验性抗真菌治疗的首选。麦角甾醇是真菌保持细胞膜的结构完整和发挥膜相关蛋白功能所必需的重要成分。伏立康唑通过阻止羊毛甾醇转化成为麦角甾醇，使真菌细胞膜合成受到阻碍，破坏真菌细胞的完整性，最终导致真菌细胞破裂凋亡。伏立康唑作为新型三唑类抗真菌药，具有更广的抗菌谱和明显的药动学优势，在临床应用中具有更大的优势。
3.伏立康唑制备的过程中，偶氮二异丁腈是合成过程中使用的物料，其反应可能不完全而残留在伏立康唑消旋体（以下简称伏立康唑m3）中，因此需要对伏立康唑m3中可能残留的偶氮二异丁腈进行研究。本发明首次提出了一种伏立康唑m3中偶氮二异丁腈的检测方法，该检测方法是由gc-ms方法实现的，为验证该方法的有效性和可行性，根据ich-q2指导原则对该方法进行验证。


技术实现要素：

4.本发明首次提出了一种伏立康唑m3中偶氮二异丁腈的检测方法，该检测方法是由gc-ms方法实现的，该方法操作简单，耗时少，并且得到的数据准确有效，具有较高的系统适用性，具体如下：一种伏立康唑m3中偶氮二异丁腈的检验方法，包括以下步骤：（1）配制溶液，分别配制空白溶液、偶氮二异丁腈储备液、对照品溶液、灵敏度溶液和供试品溶液；所述空白溶液为盐酸水溶液和二氯甲烷溶液；所述偶氮二异丁腈储备液包括偶氮二异丁腈和稀释液；对照品溶液中包括偶氮二异丁腈、稀释液、盐酸水溶液和二氯甲烷溶液；所述灵敏度溶液中包括偶氮二异丁腈、稀释液、盐酸水溶液和二氯甲烷溶液；所述供试品溶液中包括伏立康唑、盐酸水溶液和二氯甲烷溶液；（2）测定方法：分别将空白溶液、灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液注入气相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱：（6%-氰丙基-苯基）-94%甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱；柱温：初始柱温为70℃，保持1min，以12℃/min的速率升温至150℃，再以8℃/min的速率升温至200℃，再以20℃/min的速率升温至250℃；进样口温度：220℃；载气：he；分流模式：分流；载气流速：1.5ml/min；分流比：5:1；进样量：1μl；ms条件如下：
进一步地，所述空白溶液的配制步骤为：取离心管，加入盐酸水溶液，再加入二氯甲烷，涡旋静置；取下层二氯甲烷层用滤膜过滤，作为空白溶液；所述偶氮二异丁腈储备液的配制步骤为：取偶氮二异丁腈对照品，精密称定，置容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液，置容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀即得偶氮二异丁腈储备液；所述对照品溶液的配制步骤为：精密量取偶氮二异丁腈储备液，置容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；取离心管，加入盐酸水溶液，再加入上述二氯甲烷溶液，涡旋静置；取下层二氯甲烷层用滤膜过滤，作为对照品溶液；所述灵敏度溶液的配制步骤为：精密量取偶氮二异丁腈储备液，置容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。取离心管，加入盐酸水溶液，再加入上述二氯甲烷溶液，涡旋静置；取下层二氯甲烷层用滤膜过滤，作为灵敏度溶液；所述供试品溶液的配制步骤为：称取伏立康唑m3置于离心管，加入盐酸水溶液，涡旋至完全溶解，再加入二氯甲烷，涡旋静置；取下层二氯甲烷层用滤膜过滤，作为供试品溶液；所述稀释液为二氯甲烷溶液；所述盐酸水溶液为浓盐酸：水=60:40（v/v，体积比）；所述盐酸、无水乙醇为ar及以上；所述二氯甲烷和超纯水为hplc；所述偶氮二异丁腈对照品为外购；所述色谱柱可为agilent technologies db-624,30mx0.32mm,1.8μm，或效能相当的色谱柱。
5.所述偶氮二异丁腈含量的测定方法还包括在检测之前的方法验证，该方法验证为按照正式检测的色谱条件，测定结果为：
有益效果本发明首次提出了一种伏立康唑m3中偶氮二异丁腈的检测方法，该检测方法是由gc-ms方法实现的，为验证该方法的有效性和可行性，根据ich-q2指导原则对该方法进行验证该方法在专属性、精密度、准确度、线性和范围和耐用性都符合标准，且该方法操作简单，耗时少，并且得到的数据准确有效，具有较高的系统适用性。
附图说明
6.图1为实施例2、3、4、5中空白溶液的液相色谱图；图2为实施例2、5中灵敏度溶液的液相色谱图；图3为实施例2、3、4中对照品溶液的液相色谱图；图4为实施例3中供试品溶液的液相色谱图；图5为实施例3中选择性溶液的液相色谱图；图6为实施例4中供试品溶液（加标）的液相色谱图；图7为实施例5中loq溶液的液相色谱图；图8为实施例5中lod溶液的液相色谱图；
图9为偶氮二异丁腈线性关系。
具体实施方式
7.实施例1(1)实验材料与仪器条件实验材料：盐酸，生产厂家：merck；二氯甲烷，生产厂家：merck；水，生产厂家：watsons；无水乙醇，生产厂家：天津市大茂化学试剂厂；偶氮二异丁腈，生产厂家：百灵威科技；伏立康唑m3，生产厂家：河南紫萌医药科技有限公司。
8.仪器：气相色谱质谱联用仪：agilent technologies 7890b&7000d；电子分析天平:xse205du、gr-200；色谱柱：db-624 30mx0.32mm,1.8μm；涡旋仪：mx-s；滤膜：13mm
×
0.22um；注射器：0.6
×
25rw lb13。
9.分别将空白溶液、灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液注入气相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱：（6%-氰丙基-苯基）-94%甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱；柱温：初始柱温为70℃，保持1min，以12℃/min的速率升温至150℃，再以8℃/min的速率升温至200℃，再以20℃/min的速率升温至250℃；进样口温度：220℃；载气：he；分流模式：分流；载气流速：1.5ml/min；分流比：5:1；进样量：1μl；ms条件如下：（2）实验步骤所述稀释液为二氯甲烷溶液；所述盐酸水溶液为浓盐酸：水=60:40（v/v，体积比）；所述盐酸、无水乙醇为ar及以上；所述二氯甲烷和超纯水为hplc；所述偶氮二异丁腈对照品为外购；所述色谱柱可为agilent technologies db-624,30mx0.32mm,1.8μm，或效能相当的色谱柱。
10.①
空白溶液的制备：取50ml离心管，加入盐酸水溶液5.0ml，再加入二氯甲烷5.0ml，涡旋1min，静置；取下层二氯甲烷层用0.22μm滤膜过滤，作为空白溶液；
②
偶氮二异丁腈储备液的制备：取偶氮二异丁腈对照品约45mg，精密称定，置25ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀即得偶氮二异丁腈储备液（偶氮二异丁腈浓度：18μg/ml）；
③
对照品溶液（偶氮二异丁腈定位溶液）的制备：精密量取偶氮二异丁腈储备液1.0ml，置20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；取50ml离心管，加入盐酸水溶液5.0ml，再加入上述二氯甲烷溶液5.0ml，涡旋1min，静置；取下层二氯甲烷层用0.22μm滤膜过滤，作为对照品溶液（偶氮二异丁腈浓度：0.9μg/ml）；
④
灵敏度溶液的制备：精密量取偶氮二异丁腈储备液300μl，置20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。取50ml离心管，加入盐酸水溶液5.0ml，再加入上述二氯甲烷溶液5.0ml，涡旋1min，静置；取下层二氯甲烷层用0.22μm滤膜过滤，作为灵敏度溶液（偶氮二异丁腈浓度：0.27μg/ml）；
⑤
供试品溶液（伏立康唑m3定位溶液）的制备：称取伏立康唑m3约2.4g置于50ml离心管，加入盐酸水溶液5.0ml，涡旋至完全溶解，再加入二氯甲烷5.0ml，涡旋1min，静置；取下层二氯甲烷层用0.22μm滤膜过滤，作为供试品溶液(伏立康唑m3浓度：0.48g/ml)；
⑥
选择性溶液的制备：精密量取偶氮二异丁腈储备液1.0ml，置20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；称取伏立康唑m3约2.4g置于50ml离心管，加入盐酸水溶液5.0ml，涡旋至完全溶解，再加入上述二氯甲烷溶液5.0ml，涡旋1min，静置；取下层二氯甲烷层用0.22μm滤膜过滤，作为选择性溶液(伏立康唑m3浓度：0.48g/ml，加入偶氮二异丁腈浓度：0.9μg/ml)；
⑦
供试品溶液（加标）的制备：精密量取偶氮二异丁腈储备液1.0ml，置20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；称取伏立康唑m3约2.4g置于50ml离心管，加入盐酸水溶液5.0ml，涡旋至完全溶解，再加入上述二氯甲烷溶液5.0ml，涡旋1min，静置；取下层二氯甲烷层用0.22μm滤膜过滤，作为供试品溶液(伏立康唑m3浓度：0.48g/ml，加入偶氮二异丁腈浓度：0.9μg/ml)，同法配制6份该溶液；
⑧
loq溶液的制备：根据灵敏度溶液所得的偶氮二异丁腈的s/n值，调节稀释比例至偶氮二异丁腈的s/n不小于10，摇匀，作为loq溶液。同法配制6份；
⑨
lod溶液的制备：精密量取loq溶液5.0ml，置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，取50ml离心管，加入盐酸水溶液5.0ml，再加入上述二氯甲烷溶液5.0ml，涡旋1min，静置；取下层二氯甲烷层用0.22μm滤膜过滤，作为lod溶液。
11.待系统稳定后，进空白溶液1针（必要时，可进多针[1-3针]）、灵敏度溶液1针、对照品溶液6针、空白溶液1针（必要时，可进多针[1-3针]），供试品溶液1针，记录谱图。
[0012]
实施例2本发明所述检测方法系统适用性试验系统适用性是通过测定灵敏度溶液中偶氮二异丁腈的s/n值及6针对照品溶液中偶氮二异丁腈峰面积的rsd而实现的。要求灵敏度溶液中偶氮二异丁腈的s/n值应≥10；6针对照品溶液中偶氮二异丁腈峰面积的rsd应不大于10.0%。为确认序列运行过程中的系统适用性，在验证过程中每隔约8小时及序列的最后，进1针对照品溶液，要求后连续6针对照品溶液中偶氮二异丁腈峰面积的rsd应不大于10.0%；如超出该范围，应做评估调查。
[0013]
如实施例1所述配制空白溶液、偶氮二异丁腈储备液、灵敏度溶液和对照品溶液，在实施例1所述色谱条件下，进空白溶液1针（必要时，可进多针[1-3针]）、灵敏度溶液1针，对照品溶液6针，得到色谱图，如图1、图2和图3，根据公式换算结果如下表所示：
实施例3 本发明所述检测方法专属性试验方法的专属性是通过测定空白溶液对检测无干扰；选择性溶液中偶氮二异丁腈与相邻峰之间的分离度而实现的，要求空白溶液对检测应无干扰，选择性溶液中偶氮二异丁腈与相邻峰之间的分离度应不小于1.5。
[0014]
如实施例1所述配制空白溶液、偶氮二异丁腈储备液、对照品溶液、供试品溶液和选择性溶液，在实施例1所述色谱条件下，进空白溶液1针、供试品溶液1针、对照品溶液1针、选择性溶液1针，得到色谱图，如图1、图3、图4和图5，根据公式换算结果如下表所示：
实施例4 本发明所述检测方法的精密度试验重复性是通过测试6份供试品溶液（加标）测定结果的rsd而实现的，要求6份供试品溶液（加标）中偶氮二异丁腈测定结果的rsd应不大于10.0%。
[0015]
如实施例1所述配制空白溶液、偶氮二异丁腈储备液、对照品溶液、供试品溶液（加标），待系统平衡后，进空白溶液1针、对照品溶液6针、空白溶液1针、6供试品溶液（加标）各1针，记录色谱图，如图1、图3和图6，得出专属性检测结果如下：实施例5 本发明所述检测方法的定量限和检测限定量限和检测限是通过检测响应信号与噪声之比而实现的，定量限的信噪比（s/n）应不小于10：1，检测限的信噪比（s/n）应不小于3：1；在定量限浓度水平下，重复考察6份定量限溶液，要求6份loq溶液中偶氮二异丁腈单位浓度峰面积的rsd应不大于10.0%；loq
偶氮二异丁腈
应不大于0.9ppm，s/n≥10；lod
偶氮二异丁腈
的s/n≥3，且lod＜loq。
[0016]
如实施例1所述配制空白溶液、偶氮二异丁腈储备液、灵敏度溶液、loq溶液和lod溶液。待系统平衡后，进空白溶液1针、灵敏度溶液1针，6份loq溶液各1针、lod溶液1针，记录色谱图，如图1、图2、图7和图8。得到结果如下表所示：
实施例6 本发明所述检测方法的准确度准确度是通过被测组分实测浓度和理论浓度之间的回收率及回收率的总rsd（n=9）而实现的，要求加入loq浓度、100%限度浓度、200%限度浓度的准确度溶液中，偶氮二异丁腈的回收率应在70.0%～130.0%之间，且回收率的总rsd（n=9）应不大于20.0%。
[0017]
备注：1）供试品溶液峰面积：引用专属性项下伏立康唑m3定位溶液的峰面积；2）对照品溶液峰面积：引用系统适用性项下的6针对照品溶液的平均峰面积；3）样品带入峰面积=供试品溶液测得峰面积
×
准确度溶液样品称取量
÷
供试品溶液样品称取量；4）测得浓度=扣除本底计算峰面积
÷
对照品溶液峰面积
×
对照品溶液理论投入浓度；5）回收率（%）=测得浓度
÷
理论投入浓度
×
100%。
[0018]
实施例7 本发明所述检测方法的溶液稳定性考察对照品溶液、供试品溶液和选择性溶液在室温避光下放置一段时间后进样，检测
结果随时间变化的规律，为检测时对照品溶液和供试品溶液的放置时间提供参考。
[0019]
要求：与0hr对照品溶液相比较，对照品溶液在室温避光考察期间，偶氮二异丁腈的回收率在80.0%～120.0%之间，且无明显的变化趋势，则对照品溶液在室温避光考察期间稳定；若供试品溶液0hr有检出偶氮二异丁腈，供试品溶液在室温避光下放置一段时间内，测定结果变化值在偶氮二异丁腈限度的20%以内，且无明显的变化趋势，则供试品溶液在室温避光考察期间稳定；若供试品溶液0hr未检出偶氮二异丁腈，供试品溶液在室温避光下放置一段时间内，仍无偶氮二异丁腈检出，则供试品溶液在室温避光考察期间稳定；选择性溶液在室温避光下放置一段时间内，偶氮二异丁腈的回收率在80.0%～120.0%之间，且无明显的变化趋势，则选择性溶液在室温避光考察期间稳定。之间，且无明显的变化趋势，则选择性溶液在室温避光考察期间稳定。
[0020]
备注：测得结果（ppm）=测得峰面积
÷
对照品溶液-0hr测得峰面积
×
对照品溶液-0hr理论投入浓度
÷
供试品溶液浓度。