自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器及其制备方法和应用

1.本公开属于生物化学领域，尤其涉及一种自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.光动力疗法是指，在氧气存在时，通过激光照射光敏剂(pss)产生活性氧(ros)，如单线态氧(1o2)，从而氧化周围的生物分子，损伤甚至杀死目标细胞的治疗方法。光动力疗法具有精确的时空选择性，治疗效果明显，毒副作用低，创伤小，在肿瘤治疗的应用中具有明显的优势。然而，目前光动力治疗多依赖于高氧环境，如何实现光敏剂在肿瘤乏氧环境下发挥良好的治疗效果，仍然是光动力治疗在临床应用中面临的重大挑战。


技术实现要素：

3.针对上述技术问题，本公开提供了一种自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器及其制备方法和应用，以期至少部分地解决上述的技术问题。
4.为了解决上述技术问题，本公开的技术方案如下：
5.一种自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器，包括：
6.铁蛋白；和
7.负载在铁蛋白内腔中的二氧化锰纳米颗粒和光动力光敏剂。
8.在其中一个实施例中，上述光动力光敏剂包括二氢卟吩、铁卟啉、锰卟啉、吲哚菁绿中的任意一种。
9.本公开还提供了一种上述自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器在光照后产生活性氧的应用，其中，上述光照包括激光照射。
10.在其中一个实施例中，上述自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器具备在微酸环境下产生氧分子的功能，所产生的上述氧分子具有提高光敏剂的光动力效果的作用。
11.本公开还提供了一种制备上述自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器的方法，包括：
12.将锰盐与铁蛋白孵育，通过生物矿化得到铁蛋白二氧化锰纳米颗粒；
13.将溶解于有机溶剂中的光动力光敏剂与上述铁蛋白二氧化锰纳米颗粒混合搅拌，得到内腔负载有光动力光敏剂和二氧化锰的铁蛋白光动力纳米反应器。
14.在其中一个实施例中，上述锰盐包括以下任意一种：
15.氯化锰、硫酸锰、硝酸锰。
16.在其中一个实施例中，上述锰盐的浓度范围包括：50μm～400μm；
17.上述铁蛋白的浓度范围包括：3mg/ml～6mg/ml；
18.上述光敏剂的浓度范围包括：5μg/ml～20μg/ml。
19.在其中一个实施例中，在将锰盐与铁蛋白孵育后，通过加入碱性试剂将ph值调节至11～13。
20.在其中一个实施例中，上述光动力光敏剂与上述铁蛋白二氧化锰纳米颗粒混合包
括在避光条件下搅拌。
21.在其中一个实施例中，上述有机溶剂包括以下任意一种：二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺。
22.从上述技术方案可以看出，本公开提供的一种自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器及其制备方法和应用，至少具有以下之一的有益效果：
23.(1)在本公开的实施例中，利用铁蛋白独特的空腔结构，可以获得尺寸形貌均一、分散性良好、生物安全性较高的二氧化锰纳米颗粒，且该二氧化锰纳米颗粒的性能更加稳定可控。
24.(2)在本公开的实施例中，铁蛋白中的二氧化锰纳米颗粒可以在肿瘤微酸环境中与过量的过氧化氢反应产生大量的氧气，增加光敏剂在乏氧环境下的敏感性，从而提高光敏剂的光动力效果。
25.(3)在本公开实施例中的铁蛋白光动力纳米反应器不仅可以提高光动力光敏剂的分散性，也可以提高光动力光敏剂在肿瘤部位的富集量，提高光动力的治疗功效。
附图说明
26.图1是本公开实施例中自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器的制备方法、结构和机理示意图；
27.图2a是本公开实施例中铁蛋白(ftn)的透射电子显微镜图；
28.图2b是本公开实施例中负载二氢卟吩的铁蛋白二氧化锰纳米颗粒(ce6/ftn@mno2)的透射电子显微镜图；
29.图3是本公开实施例中ftn、铁蛋白二氧化锰纳米颗粒(ftn@mno2)和ce6/ftn@mno2纳米颗粒的水合粒径分布图；
30.图4是本公开实施例中ce6/ftn@mno2的x射线光电子能谱图；
31.图5是本公开实施例中ce6和ce6/ftn@mno2的紫外吸收光谱图；
32.图6是本公开实施例中ftn、ftn@mno2和ce6/ftn@mno2的稳定性测试结果图；
33.图7是本公开实施例中在不同条件下ce6/ftn@mno2的分解曲线图；
34.图8是本公开实施例中ce6/ftn@mno2分解h2o2的效果图；
35.图9是本公开实施例中用溶氧仪测定溶液中ce6/ftn@mno2在不同条件下的产生氧气含量图；
36.图10是本公开实施例中在不同条件下单线态氧产生的效果图；
37.图11是本公开实施例中细胞摄取ce6/ftn@mno2的共聚焦激光扫描显微镜图；
38.图12是本公开实施例中在不同条件下细胞内的活性氧水平的荧光光谱图；
39.图13是本公开实施例中ce6和ce6/ftn@mno2抑制4t1癌细胞存活率的柱状图；
40.图14是本公开实施例中不同条件对4t1癌细胞生长活性的效果图；
41.图15是本公开实施例中小鼠治疗后体内肿瘤生长曲线随时间变化图。
具体实施方式
42.为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开作进一步的详细说明。
43.光动力治疗是在氧气存在的条件下，光敏剂在激光照射后可以产生对细胞毒性的活性氧物种，如单线态氧，利用单线态氧的氧化性可以破坏癌细胞中的遗传物质，导致细胞凋亡或死亡。
44.众所周知，目前临床光动力治疗药物多基于type-ii型光敏化机制，该机制具有高氧气依赖性。这导致光动力疗法对乏氧实体瘤的治疗效果十分有限。此外，光动力光敏剂由于自身水溶性差，代谢快，缺乏靶向性且毒副作用较明显等不足，进一步限制了它的发展和使用。肿瘤微环境除乏氧外，还具有微酸性和过氧化氢(h2o2)浓度过高等特点。因此，针对以上问题，需要开发一种适用于肿瘤微环境的光动力试剂运输体系，用于提高肿瘤的光动力治疗效果。
45.二氧化锰(mno2)纳米材料能够在微酸环境下与过氧化氢迅速反应，产生氧气(mno2 h2o2 h

→
mn
2
h2o o2)。因此，二氧化锰纳米颗粒有望缓解肿瘤乏氧微环境，提高光动力的治疗效果，克服缺氧相关的耐药性。同时，二氧化锰纳米材料能够在体内降解为二价锰离子(mn
2
)，用于肿瘤的磁共振成像。
46.值得注意地是，均一的尺寸和形貌是纳米材料具有稳定性能的前提。目前制备二氧化锰纳米颗粒的技术已多有报道，包括水热法，高锰酸钾氧化法，化学法等。然而，这些合成方法所获得的二氧化锰纳米颗粒稳定性相对较差，粒径不均一。
47.针对这一问题，我们采用原位生物矿化的方法，获得了尺寸、形貌均一，化学性能稳定的二氧化锰纳米材料。生物矿化是指在生物大分子参与和调控下，生成无机矿化物的过程。由于内源性生物分子具有良好的生物相容性，使得这一合成方法在临床转化中引起广泛关注。
48.铁蛋白是一种内源性的储铁蛋白，呈球形空腔结构，其外径约12nm，空腔约8nm。铁蛋白具有耐酸、耐碱、耐高温等特点，结构非常稳定，并能够可逆的解聚和自组装。它具有8个亲水通道和6个疏水通道，易于装载亲水和疏水药物。作为内源性的铁贮存蛋白，铁蛋白可以存储fe
3
，cu
2
，mn
2
等金属离子。其中，每个铁蛋白可以负载3000-4000的锰离子。鉴于其出色的物理和化学特性，铁蛋白被广泛用作金属和金属氧化物纳米结构的蛋白质纳米笼。除此之外，铁蛋白还具有转铁蛋白受体的靶向性。由于转铁蛋白受体在多种恶性肿瘤中高表达，因此铁蛋白是一种天然的肿瘤细胞靶向纳米载体。
49.在本公开中，我们利用铁蛋白作为载体，利用铁蛋白独特的空间结构，通过生物矿化的方法制备了一种尺寸和形貌均一、分散性良好、性能稳定、生物安全性较高的铁蛋白二氧化锰纳米反应器。接着，我们将光动力光敏剂与铁蛋白二氧化锰纳米反应器混合搅拌，获得了一种自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器。该纳米反应器不仅提高了光动力光敏剂在生理环境中的分散性，还提高了光敏剂在肿瘤组织中的富集量。
50.光动力疗法是一个消耗氧气的过程，而实体肿瘤组织具有缺乏氧气、微酸性、过氧化氢过多等特点。因此，我们开发了一种自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器，并将其应用于肿瘤的光动力治疗。该纳米反应器能够对肿瘤微环境产生响应，在肿瘤的微酸环境中催化内源性过量的过氧化氢产生氧气，为光动力治疗提供氧气来源，增加光敏剂在乏氧环境下的敏感性，从而提高光敏剂对于肿瘤光动力治疗的效果。
51.图1是本公开实施例中自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器的制备方法、结构和机理示意图。
52.如图1所示，具有独特空腔结构的铁蛋白的内部负载着二氧化锰纳米颗粒和光动力光敏剂，该铁蛋白光动力纳米反应器在微酸和过氧化氢存在的条件下，可以将二氧化锰纳米颗粒分解成氧气和二价锰离子，其中，氧气分子能够提高光动力光敏剂在乏氧环境下的敏感性；二价锰离子可以用于肿瘤的磁共振成像；而在中性环境中只能得到氧气。
53.根据本公开的实施例，光动力光敏剂包括二氢卟吩、铁卟啉、锰卟啉、吲哚菁绿中的任意一种。
54.通过本公开的实施例，由上述光敏剂制备的铁蛋白光动力纳米反应器，因上述光动力光敏剂的性能相似，所以在激光照射下可以将氧气转变成单线态氧，可以应用于光动力治疗。
55.根据本公开的实施例，自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器在光照后产生活性氧的应用，其中，光照包括激光照射。
56.根据本公开的实施例，自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器具有在肿瘤微环境光照后产生氧分子的功能，所产生的氧分子具有促进光敏剂对的光动力效果、杀死肿瘤细胞的作用。
57.如图1所示，将锰盐与铁蛋白孵育，通过生物矿化方法得到铁蛋白二氧化锰纳米颗粒；将溶解于有机溶剂中的光动力光敏剂与铁蛋白二氧化锰纳米颗粒混合搅拌，得到内腔负载有光动力光敏剂和二氧化锰的铁蛋白光动力纳米反应器。
58.通过本公开的实施例，利用铁蛋白独特的空间结构和生物矿化的方法，将锰盐与铁蛋白孵育，可以在铁蛋白的空腔内原位生成二氧化锰纳米颗粒。再将溶解于有机溶剂中的光动力光敏剂与铁蛋白二氧化锰纳米颗粒混合搅拌，可以获得内腔负载有光动力光敏剂和二氧化锰的铁蛋白光动力纳米反应器。铁蛋白中的二氧化锰纳米颗粒可以在肿瘤的微酸环境中与过氧化氢反应产生大量的氧气，为光敏剂的光动力治疗提供氧气来源，从而解决了光动力光敏剂在肿瘤乏氧环境下敏感性低的难题。并且，通过该方法可以获得尺寸形貌均一、分散性良好、性能稳定、生物安全性较高的二氧化锰纳米颗粒。此外，该铁蛋白光动力纳米反应器不仅提高了光动力光敏剂在生理环境中的分散性，还提高了光敏剂在肿瘤组织中的富集量。
59.根据本公开的实施例，锰盐包括以下任意一种：氯化锰、硫酸锰、硝酸锰。
60.通过本公开的实施例，通过生化矿化的方法将锰离子变成二氧化锰纳米颗粒，采用生物矿化的方法得到的二氧化锰纳米颗粒具有尺寸大小均一、分散性良好、性能稳定、生物安全性较高的特点。
61.根据本公开的实施例，锰盐的浓度范围包括：50μm～400μm，可选为50、100、150、200、250、300、350、400μm等。
62.通过本公开的实施例，将锰盐的浓度限定在这个范围内，可以避免因锰离子太多诱导铁蛋白发生团聚而沉淀，或者因锰离子太少而导致铁蛋白内腔中负载的锰离子过少，生物矿化形成的二氧化锰纳米颗粒过少，进而不能有效改善肿瘤细胞中的缺氧环境，影响光动力治疗效果。
63.根据本公开的实施例，铁蛋白的浓度范围包括：3mg/ml～6mg/ml，可选为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6mg/ml等。
64.通过本公开的实施例，将铁蛋白的浓度限定在这个范围内可以实现锰离子和光动
力光敏剂的包裹，同时也不会因铁蛋白含量过高而导致自身聚沉。
65.根据本公开的实施例，光动力光敏剂的浓度范围包括：5μg/ml～20μg/ml，可选为5、6、8、10、12、14、16、18、20μg/ml等。
66.通过本公开的实施例，将光动力光敏剂限定在这个范围内是为了防止光敏剂含量过高而导致铁蛋白聚沉，也避免使负载在铁蛋白内腔中的光敏剂含量太低影响光动力治疗的效率。
67.根据本公开的实施例，在将锰盐与铁蛋白孵育后，通过加入碱性试剂将ph值调节至11～13，ph值可选为11、12、13。
68.根据本公开的实施例，碱性试剂包括以下任意一种：naoh、koh。
69.通过本公开的实施例，加入碱性试剂将ph调节至11～13。该碱性环境的第一个目的是使锰离子在碱性条件下反应生成氢氧化锰，氢氧化锰经空气中氧化后生成二氧化锰；第二目的是使铁蛋白解聚，以便于光动力光敏剂进入铁蛋白内腔中。如果ph值过低，锰离子无法生成二氧化锰，铁蛋白不能正常解聚，从而影响光动力光敏剂的负载。
70.根据本公开的实施例，光动力光敏剂与铁蛋白二氧化锰纳米颗粒混合包括在避光条件下搅拌。
71.根据本公开的实施例，有机溶剂包括以下任意一种：二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺。
72.为了使本公开的目的、技术方案及优点更加的清晰明确，以下结合实施例，以光动力光敏剂为二氢卟吩为例，对制备自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器作进一步详细准确地说明，但是需要知晓地是，此处所描述的具体实施例只是本公开的部分实施例，而非全部。
73.铁蛋白(ftn)的表达
74.将转有铁蛋白质粒的大肠杆菌在4.5ml含100g/ml氨苄青霉素的肉汤培养基(lb)中进行孵育。细胞在37℃下生长过夜，然后转移到1l lb培养基中，使细胞继续生长直到od
600
＝0.8，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，0.4mm)，并在37℃下诱导蛋白表达4h。接着，通过离心方式收集细菌，并将沉淀物重悬于40ml重悬缓冲液(50mm tris，dnaase，ph＝8.0)中，将细胞在冰上进行超声处理，通过离心的方式将细胞裂解物分离以去除大肠杆菌碎片。将上清液在65℃下加热15分钟，在此期间，许多不纯的蛋白质沉淀并通过离心去除。然后将固体(nh4)2so4添加到获得的上清液中，直到其浓度达到60％，并将溶液在4℃下搅拌过夜。接着，通过离心除去上清液后，将沉淀物中的蛋白质重悬于50mm tris，150mm nacl，ph＝8.0的缓冲液中，使用superose 6色谱柱(ge healthcare life sciences，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)，通过分子排阻色谱法进一步纯化铁蛋白质。将纯化的铁蛋白储存在-80℃，并通过sds-page和native-page分析蛋白质的纯度。
75.制备铁蛋白二氧化锰纳米颗粒(ftn@mno2)
76.锰离子通过生物矿化的方法形成mno2，2mn
2
4oh- o2→
2mno2 2h2o。在铁蛋白存在的条件下，得到ftn@mno2，具体制备方法如下：
77.将80mg纯化后的铁蛋白分散于15ml 50mm tris，150mm nacl，ph＝8.0缓冲溶液中，在25℃下搅拌5min；接着，将400μl 0.01m mncl2滴加到溶液中并搅拌10min，在连续搅拌的过程中将1m naoh滴加到溶液中以调节ph值为11。由于锰离子可以固定在铁蛋白的羧基和巯基上，因此用naoh溶液将ph值调节到11后，继续搅拌2h可以形成二氧化锰纳米颗粒。
接着，将所得的产物以13000rpm离心5min以除去多余聚集物(如未反应的铁蛋白)，并利用超滤管(分子量截留mwco＝10kda)以6000rpm离心20min进行超滤，用tris缓冲液洗涤3次以去除多余的前体(如铁蛋白)。
78.制备负载二氢卟吩的铁蛋白二氧化锰纳米反应器(ce6/ftn@mno2)
79.先将疏水的光动力光敏剂二氢卟吩(ce6)溶解于二甲基亚砜(dmso)中。接着，将200μg ce6加入含铁蛋白二氧化锰纳米颗粒的tris缓冲液(ph＝11.0)中，将所得的混合物避光搅拌过夜(避免光敏剂见光发生反应)。接着，以14800rpm离心5min以除去可能存在的聚集体(铁蛋白二氧化锰纳米颗粒)并通过超滤管(分子量截留分子量mwco＝10kda)超滤3次以除去游离的ce6后，获得ce6/ftn@mno2。通过紫外-可见吸收光谱测量ce6的浓度计算包封率(负载率)。
80.图2a是本公开实施例中铁蛋白(ftn)的透射电子显微镜图；图2b是本公开实施例中负载二氢卟吩的铁蛋白二氧化锰纳米颗粒(ce6/ftn@mno2)的透射电子显微镜图。
81.如图2a和图2b所示，对铁蛋白ftn和ce6/ftn@mno2进行负染后，铁蛋白和ce6/ftn@mno2的形貌为均匀的球形，粒径大约为12nm左右，且ce6/ftn@mno2保留了铁蛋白的初始结构形貌。在铁蛋白内腔矿化形成了二氧化锰纳米颗粒之后，衬度更高，因此铁蛋白内核的颜色相比于单独铁蛋白的颜色更深，表明成功通过生物矿化的方法在铁蛋白内核生成了二氧化锰颗粒。
82.图3是本公开实施例中ftn、铁蛋白二氧化锰纳米颗粒(ftn@mno2)和ce6/ftn@mno2纳米颗粒的水合粒径分布图。
83.如图3所示，通过对ftn、ftn@mno2和ce6/ftn@mno2的水合粒径测试可以发现，ftn、ftn@mno2和ce6/ftn@mno2具有较窄的尺寸分布，流体动力学直径从12.8nm略微增加到15.5nm，进一步证明mno2纳米颗粒的形成以及ce6的成功负载包裹到铁蛋白的内腔中。与传统的mno2合成相比，由于铁蛋白精确的立体结构，利用铁蛋白原位生物矿化的方法可以精确地控制mno2的大小和形貌。铁蛋白的外壳为mno2提供了天然表面修饰位点，这种生物矿化制备的纳米颗粒不仅具有优异的生理稳定性和生物安全性，与游离的药物相比还具有在肿瘤组织高富集的特性。
84.图4是本公开实施例中ce6/ftn@mno2的x射线光电子能谱图。
85.通过x射线光电子能谱(xps)研究了ce6/ftn@mno2中mn的价态，如图4所示，图中有两个特征峰，分别是mn
4
2p1/2(654.2ev)和2p3/2(642.4ev)，证实了ftn@mno2中mno2的形成。
86.图5是本公开实施例中ce6和ce6/ftn@mno2的紫外吸收光谱图。
87.从图5的ce6/ftn@mno2紫外可见吸收光谱图中发现ce6的特征型吸收峰，这表明ce6成功负载到ftn@mno2中。从紫外可见吸收数据中进一步表明，大概有1.0
±
0.07％的ce6被负载在ftn@mno2中。
88.材料的稳定性是影响材料实际应用的一个重要参数，因此在10％fbs的rpmi 1640培养基中对铁蛋白ftn、ftn@mno2和ce6/ftn@mno2等材料的稳定性进行了测试。
89.图6是本公开实施例中ftn、ftn@mno2和ce6/ftn@mno2的稳定性测试结果图。
90.如图6所示，在rpmi 1640中，ce6/ftn@mno2的粒径在120h内没有发生明显变化，证明mno2纳米颗粒被铁蛋白包覆后，可以有效地提高稳定性。
91.本公开还提供了一种自产氧的铁蛋白光动力纳米反应器在光照后产生活性氧的应用。
92.众所周知，实体瘤内部肿瘤细胞的代谢水平较高和血液供应不足等特点，会导致肿瘤微环境酸化，并导致肿瘤内部h2o2含量显著增加。鉴于mno2与h

和h2o2的反应活性，mno2纳米颗粒在酸性条件下可与h2o2反应产生氧气，不仅能够改善肿瘤的乏氧环境，而且可以增强氧气依赖型光动力疗法的治疗效果。
93.因此，本公开在中性和微酸(分别模拟正常组织和肿瘤组织的生理环境)条件下，研究了ce6/ftn@mno2中mno2的降解和产氧能力。
94.在加入或不加入50μm h2o2的条件下，将1.0mg/ml ce6/ftn@mno2分散在不同的ph值(7.4和6.0)的缓冲液中，通过利用紫外-可见分光光度计测定mno2在不同的时间点的吸光度(λ＝420nm)来计算ce6/ftn@mno2降解实验中残留的mno2百分比。
95.图7是本公开实施例中在不同条件下ce6/ftn@mno2的分解曲线图。
96.如图7所示，在酸性条件下，特别是在h2o2存在的情况下，ce6/ftn@mno2中mno2的残留率明显降低，说明酸性和h2o2存在的条件下能显著促进mno2的分解。相比之下，在不存在h2o2的情况下，mno2在ph＝7.4下非常稳定；即使加入h2o2后，mno2的残留量也能够保持90％以上。这种现象可以通过以下反应来解释：
97.mno2 2h

→
mn
2
h2o 1/2o2↑
(1)
98.mno2 h2o2 2h

→
mn
2
2h2o o2↑
(2)
99.由此说明，在酸性和h2o2存在的条件下能有效缓解肿瘤细胞中的缺氧问题，可以为光动力治疗提供氧气来源。
100.进一步的，还探究了不同条件下ce6/ftn@mno2分解h2o2产氧能力，利用ti(so4)2试剂分析溶液中h2o2浓度的变化进而来评估ce6/ftn@mno2分解过氧化氢的活性。
101.ti(so4)2可以与h2o2结合，并生成黄色产物，该产物在412nm处具有特征吸收峰。由此，我们通过紫外-可见光谱仪测试了ce6/ftn@mno2分解h2o2的能力。
102.图8是本公开实施例中ce6/ftn@mno2分解h2o2的效果图。
103.将1.0mm h2o2和400μg/ml ce6/ftn@mno2在0.01m醋酸-醋酸钠缓冲液(ph＝6.0)中于37℃孵育5分钟。在10分钟内，将混合物(50μl)添加到ti(so4)2溶液(100μl，由1.33ml的24％ti(so4)2和8.33ml的h2so4溶解在50ml蒸馏水中获得)中。紫外可见分光光度计测定不同时间产物(ti-o2)415nm的吸光度。
104.如图8所示，当有ce6/ftn@mno2存在下，在412nm处吸光度在10分钟内急剧下降，证明了ce6/ftn@mno2可以快速分解h2o2。
105.更进一步的，通过使用溶氧仪实时测量了溶液中氧气的含量，在25℃下监测ce6/ftn@mno2分解过氧化氢，生成氧气的性能：将1.5mm h2o2与0.01m醋醋-醋酸钠缓冲液(ph＝6.0或7.4)混合，然后加入1.0mg/ml ce6/ftn@mno2。立即检测氧气浓度，并连续记录数据10分钟，其中，使用1.5mm h2o2水溶液作为对照。
106.图9是本公开实施例中用溶氧仪测定溶液中ce6/ftn@mno2在不同条件下的产生氧气含量图。
107.如图9所示，通过测试发现ce6/ftn@mno2在弱酸性条件下产生的氧气量显着高于中性条件下产生的氧气量。
108.基于ce6/ftn@mno2可以有效的分解h2o2产生氧气，采用2,2,6,6-四甲基哌啶(temp)作为自旋捕集剂，通过电子自旋共振(esr)光谱法测定在ce6、ce6/ftn@mno2、ce6/ftn@mno2 h2o2、h2o2等不同条件下的单线态氧产生情况，在检测之前将准备好的上述溶液用660nm激光(25mw/cm2)照射1分钟，为了进行比较，用电子顺磁自旋谱仪(jeol，jes-fa200)测试了用temp作为空白对照组实验。
109.图10是本公开实施例中在不同条件下单线态氧产生的效果图。
110.如图10所示，利用电子顺磁共振检测出了单线态氧(1o2)的特征三重峰1：1：1，证实了ce6/ftn@mno2在660nm激光的照射下，能够产生1o2。与游离的ce6相比，ce6/ftn@mno2在h2o2存在下，显示出了更高的1o2产生效率。其原因是由于mno2能够分解h2o2生成o2，从而提高光敏剂激活o2产生1o2的效率。这一结果表明，ce6/ftn@mno2有望在乏氧、微酸的肿瘤微环境中，催化内源性过量的h2o2分解产生o2，提高光动力光敏剂在乏氧环境下的敏感性，增强光动力治疗效果，抑制肿瘤生长。
111.鉴于ce6/ftn@mno2有望增强乏氧环境下的光动力治疗效果，本公开还研究了ce6/ftn@mno2对肿瘤细胞存活率的影响。
112.将4t1细胞接种在共聚焦培养皿中培养过夜，去掉原有的rpmi 1640培养基，加入含1ml 40μg/ml ce6和4mg/ml ce6/ftn@mno2的培养基。将细胞孵育不同时间(0小时，1小时，2小时，4小时)后，去除培养基，加入含有2μl hoechst 33342(10mg/ml)的培养基，37℃孵育20min后去除培养基，用pbs洗涤3次，用共聚焦显微镜分析细胞的荧光成像。
113.图11是本公开实施例中细胞摄取ce6/ftn@mno2的共聚焦激光扫描显微镜图。
114.如图11所示，通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm)监测4t1细胞中ce6的红色荧光来分析ce6/ftn@mno2的细胞摄取情况。结果可见，ce6/ftn@mno2显示出比游离ce6更强的红色荧光，表明该纳米反应器比游离分子具有更高的细胞摄取效率，其中细胞质灰色部分来自于ce6红色荧光，而细胞核灰色部分来自于细胞核的蓝色荧光。
115.图12是本公开实施例中在不同条件下细胞内的活性氧水平的荧光光谱图。
116.如图12所示，采用活性氧(ros)探针2,7-二氯氟树脂双乙酸盐(dcfh-da)检测激光照射后，细胞内的活性氧(1o2)水平。该探针在被活性氧氧化后显示出明亮的绿色荧光(图中灰色区域)。结果显示，在常氧条件下，660nm激光照射后ce6和ce6/ftn@mno2均可以生成大量的ros信号。相反，在乏氧条件下，由于氧气供应不足，ce6的ros产生效率显著降低，而ce6/ftn@mno2能够自供o2，因此仍然能够观察到明亮的绿色荧光信号。
117.进一步的，为了评估常氧和乏氧条件下ce6/ftn@mno2对光动力治疗效果，测试了材料(过氧化氢、ce6、ce6/ftn@mno2)在不同反应条件下对肿瘤细胞生长的影响。
118.首先，通过噻唑蓝(mtt)实验来验证材料对细胞存活率的影响。将4t1癌细胞以每孔8000个的数量接种在96孔板中，并用100μl含10％fbs的rpmi 1640培养基培养12小时。用含有不同浓度的ce6(0至4μg/ml)和ce6/ftn@mno2(0至400μg/ml)的培养基替换，继续培养24小时。去除培养基，加入20μl 5mg/ml mtt溶液。将细胞继续培养4小时，直至细胞内生成深蓝色的甲瓒晶体。最后，去除培养基，加入150μl二甲基亚砜(dmso)溶解甲瓒，用bio-rad 680酶标仪通过570nm处的吸光度分析细胞存活率。
119.图13是本公开实施例中ce6和ce6/ftn@mno2抑制4t1癌细胞存活率的柱状图。
120.如图13所示，在660nm激光照射下，4t1癌细胞增殖明显降低，在高剂量下，游离ce6
光照处理之后癌细胞的存活率降低至8.1％，而ce6/ftn@mno2光照后的细胞的存活率降低至2.9％，说明ce6/ftn@mno2可以有效抑制癌细胞生长。
121.图14是本公开实施例中不同条件对4t1癌细胞生长活性的效果图。
122.如图14所示，测试了不同实验组，其中包括过氧化氢、ce6、ce6/ftn@mno2在不同条件下的细胞存活率。乏氧条件下，光照后ce6的光毒性与常氧条件相比明显下降，这是因为氧气是单线态氧产生的必要条件；相比之下，无论是在常氧还是乏氧条件下，ce6/ftn@mno2光照处理后，均能有效抑制肿瘤细胞的生长。尤其是在乏氧条件下，ce6/ftn@mno2比ce6抑制细胞存活率的效果更加明显。因此，ce6/ftn@mno2有望在肿瘤乏氧的微环境中高效分解h2o2，原位产生氧气，提高ce6的光动力治疗效果。
123.在细胞层面验证ce6/ftn@mno2的抗肿瘤效果后，本公开进一步在荷瘤小鼠模型中，进行了光动力治疗试验。
124.在本公开实施例中，所有活体动物实验均根据中国科学技术大学动物实验中心(中国合肥)的机构动物护理和使用委员会以及《实验动物事务管理规定》进行，实验的具体方案如下：
125.对于4t1鼠类乳腺肿瘤模型，通过在balb/c小鼠背侧面皮下注射100μl磷酸盐缓冲液分散的4t1细胞(2
×
106个细胞)构建4t1小鼠乳腺肿瘤模型。在肿瘤体积达到约70mm3时，将其用于体内光热成像和抗肿瘤治疗。肿瘤体积＝(肿瘤长度)
×
(肿瘤宽度)2/2。相对肿瘤体积计算为v
t
/v0(v
t
是治疗结束后的肿瘤体积，v0是开始治疗时的肿瘤体积)。
126.将4t1荷瘤小鼠随机分为六组(每组5只小鼠)，并在不同条件下分别给药治疗：200μl pbs、200μl pbs加激光、200μl 0.4mg/ml ce6、200μl 0.4mg ml ce6加激光、ce6/ftn@mno2(200μl 20mg/ml，含0.08mg ce6)和ce6/ftn@mno2(200μl 20mg/ml，含0.08mg ce6，加激光)。ce6/ftn@mno2组的小鼠通过尾静脉注射给予200μl 20mg/ml的剂量，在静脉注射8小时后，将激光照射组暴露于激光(25mw/cm2，660nm)下10分钟。每隔一天给药和光照一次，一共进行3次抗肿瘤治疗。使用数字卡尺记录肿瘤大小。
127.图15是本公开实施例中小鼠治疗后体内肿瘤生长曲线随时间变化图。
128.如图15所示，仅通过ce6或ce6/ftn@mno2治疗，小鼠的肿瘤生长速度没有被明显抑制。相比之下，ce6加激光照射组显示出了较为明显的肿瘤抑制效果。值得注意地是，由于ce6/ftn@mno2能够分解肿瘤组织中过量的h2o2转变为o2，改善肿瘤的乏氧环境，因此经过ce6/ftn@mno2加激光照射的小鼠中，其肿瘤生长受到了显著抑制。由此，体内实验结果进一步证实ce6/ftn@mno2可以克服肿瘤乏氧以增强光动力的治疗效果。
129.以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。