滨海地区潮汐影响下的抗性基因研究方法及固相萃取仪

1.本发明涉及一种滨海地区潮汐影响下的抗性基因研究方法及固相萃取仪，属于海洋科学技术领域。


背景技术：

2.在经济全球化和区域经济一体化的今天，具有地区优势，坐拥宝贵资源的滨海城市，已成为经济发展的主力城市，滨海城市是人口、经济、产业的聚集地，因此研究滨海地区的环境问题至关重要。
3.近年来，由于抗生素的滥用导致抗性基因在水生环境中广泛传播，海洋环境也是抗性基因广泛分布的一个库，抗生素耐药性已成为威胁人类健康的全球重大公共安全问题，研究滨海地区的抗性基因对具有重大意义。
4.目前对滨海地区抗性基因的研究集中于滨海地区抗性基因的种类、丰度、分布及传播，针对滨海地区潮汐影响下的抗性基因的变化的研究极少，需要建立一个方法来研究潮汐变化对抗性基因的演变规律。
5.抗生素主要是由人类排放，从医院下水道、污水处理厂、养殖场等传播出来的抗性基因最终都会流入海洋，研究滨海地区潮汐影响下的抗性基因分布、变化可以为研究海洋抗性基因的传播扩散、污染防治提供科学依据。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供一种滨海地区潮汐影响下的抗性基因研究方法及固相萃取仪，其具体技术方案如下：一种滨海地区潮汐影响下的抗性基因研究方法，包括以下步骤：海滨现场操作步骤1：确定滨海滩涂采样点的布设：根据采样区域地形地貌图、水系图，按照高、中、低潮位带，沿着海岸线布点，每条潮位带布点n个，5≤n≤15，相邻点间隔xm，50≤x≤150，绘制采样点位分布图；步骤2：确定采样时段：根据国家海洋信息中心潮汐时刻表，分别选择潮差最大的大潮和潮差最小的小潮当天的落潮时间段进行采样，掌握涨落潮在时间和空间上的演变规律；步骤3：现场勘察进行布点验证：用北斗定位系统对现场采样点位进行勘察，观察布点环境是否适宜采样，记录现场状况和滩涂底质类型，避免在植被中心地带选点，避开多种底质交错分布的地区，合理调整采样点位，并确定各点位的采样方法；步骤4：在各点位采样：根据现场勘察确定取样方法，分别在大潮和小潮时间段对各点位进行采样，取样深度为表层和浅层两个深度，各个点位均在两个深度上采集样品，每个点位每个采样深度采集样品ykg，0.5≤y≤1.5，装入灭菌塑料袋，每个点位至少取样两次，灭菌塑料袋外附上标签，标明采样名称、点位、时间、地点、采样人员信息，接着放入遮光
低温箱，用冰袋保存，作为底质样品，运回实验室做下一步处理；实验室操作步骤5：确定抗生素的赋存特征：步骤51，底质样品前处理：每个灭菌塑料袋内的底质样品均分为两部分，其中一部分底质样品于-4℃冷藏保存，用于分析理化指标，另一部分底质样品于-20℃冷冻，冷冻24h后，在105
±
5℃鼓风干燥箱中烘干至恒重，去除风干底质中的石块、微小动植物杂质，进行研磨并过2mm筛，得到细颗粒样品，将未过筛的底质样品再次研磨，研磨后再次过2mm筛，重复多次后，将所有细颗粒样品混合均匀，放入自封袋中密封，于-20℃保存；步骤52，固液提取：步骤521，将pbs缓冲液与乙腈混合，配制好ph=3的乙腈提取溶剂，将步骤51制得的多个点位的细颗粒样品分别取样5g，分别与10ml乙腈提取溶剂装入50ml离心管并进行标号，摇床振幅调制200rpm，室温下振荡10min，超声提取10min，细颗粒样品和乙腈提取溶剂充分混合形成悬浊液，离心机转速调至5000r/min离心10min，离心管中悬浊液中的细颗粒样品离心沉淀在底部，细颗粒样品中的抗生素被乙腈提取溶剂提取，进入上清液中，分别收集各个离心管中的上清液，保留细颗粒样品沉淀物，接着继续在各个离心管加10ml乙腈提取溶剂，振荡、超声、离心，取上清液，再次在离心管沉淀物中加10ml酸化乙腈，振荡、超声、离心，取上清液，合并各个离心管三次提取的上清液，并加入超纯水稀释定容至300ml，得到各个点位各层样品的稀释液；步骤522，将固相萃取仪各组件装好，真空槽内不放置试管及试管架，作为样品废液缸使用，将步骤521配制的各个点位各层样品的稀释液分别倒入固相萃取仪各进样水槽中并标号，至进样水槽满仓；步骤523，强阴离子交换lc-sax柱下端出口接在hlb柱上端入口形成lc-sax、hlb两柱一体的串联柱（以下简称串联柱），hlb柱下端即串联柱下端安置在固相萃取仪进液孔上，真空泵接在真空槽上，开启抽气模式，打开各个流量控制阀开关，气体从串联柱上端吸入，依次使用10ml100%（体积比）甲醇溶液和10ml超纯水活化串联柱，甲醇溶液和超纯水在重力及负压影响下快速通过串联柱，进入上述步骤522真空槽废液缸中，活化完成后，把输液管一端放入进样水槽稀释液中，一端通过密闭接口接在对应lc-sax柱上端，进样水槽稀释液在真空泵负压影响下通过输液管流经串联柱，进入真空槽废液缸，待进样水槽稀释液全部通过串联柱后，在串联柱中的hlb柱中形成了hlb目标物，加入超纯水至进样水槽，清洗输液管和串联柱，超纯水全部通过串联柱后，拆除输液管，去除lc-sax柱，把真空槽内液体倒入实验室废液缸中。将试管和试管架放入真空槽，每个试管口对准上方hlb柱，继续打开真空泵，负压抽真空至真空槽干燥10min，用10ml甲醇对hlb目标物进行洗脱，在试管中获得洗脱液目标物，收集的洗脱液于40℃下氮吹至近干，接着用含0.1%（体积比）甲酸的甲醇定容至1ml，使用0.22μm滤膜过滤，存放于棕色送样瓶中待测，形成样品待测液；以上步骤521-524处理进行三次平行实验，即每个底质样品取15g，分为三组，每组5g作为一个细颗粒样品进行实验，同时设置空白对照组；步骤53，配制抗生素标准储备液：称取抗生素标准品，用甲醇溶液溶解抗生素标准品并配置成抗生素标准液；步骤54，用高效液相色谱-串联质谱仪分析步骤524中样品待测液的抗生素赋存特
征，根据色谱分离柱的使用说明设置梯度洗脱程序，得到抗生素的质谱分析参数，对下机原始数据进行积分分析，与步骤53中抗生素标准液进行对比，得到滩涂各点位样品抗生素种类、回收率与检出限；步骤6，对抗性基因种类、丰度进行定量：步骤61，dna提取：采用dna试剂盒提取沉积物中的微生物总dna，从灭菌塑料袋中取出各点位滩涂底质样品，每个样品做三个重复实验，采用分光光度计测定评估dna的浓度和质量，提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取后的dna样品-20℃保存直至后续实验分析；步骤62，pcr扩增、构建质粒：设置目的基因pcr扩增体系，抗性基因上下引物、序列、片段大小和退火温度，得到pcr产物，产物用琼脂糖凝胶电泳，对片段条带单一且大小一致的片段进行割胶，通过dna纯化试剂盒进行纯化后连接到pmd19-t质粒载体上，转移至lb平板，过夜培养后挑选阳性克隆菌落进行离心，收集菌体，使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，用分光光度计测定质粒溶液浓度，采用标准品专用稀释液进行配比稀释，绘制抗性基因定量标准曲线；步骤7，使用高通量pcr技术对移动遗传元件进行测定：在高通量荧光定量反应平台上完成，所有样本设置三个技术重复，每对引物设置空白阴性对照，依据说明书调整pcr程序，进行抗性基因和移动遗传元件的丰度定量；步骤8，数据分析：对不同潮位带、不同潮期的底质样品中的抗生素、抗性基因、移动遗传元件的多样性、丰度进行比较分析，其差异使用最小差异法检验并通过单因素方差分析方法分析，其相关性使用spearman相关性方法进行分析，对抗性基因与移动遗传元件的共存模式网络化分析，得到不同潮差和潮位带采样点中的抗性基因丰度和组成，抗性基因在潮汐影响下的分布特征、抗性基因与移动遗传元件的共存模式。
7.进一步的，所述步骤1中的采样区域地形地貌图、水系图的等比例尺为1：25万，每条潮位带布点10个，各个点间隔100m。
8.进一步的，所述步骤4中表层即为底质表面，深度用0cm表示，浅层表示表层向下20-30cm，深度为20-30cm表示。
9.进一步的，所述步骤4中每个采样点的在各层深度分别采样1kg，采用滩涂底质柱状采集器对各点位进行采样。
10.固相萃取仪，从上到下依次包括进样水槽、水槽支架和真空槽，所述进样水槽整体呈圆柱形状，从其中心线朝向四周设置有m个隔板，将其分割成m 1个隔间，所述进样水槽通过水槽支架架设在真空槽的垂直上方，所述真空槽的顶部设置有小柱托盘，所述小柱托盘围绕其靠近边缘一圈贯穿设置有若干个小柱，每个小柱位于小柱托盘上方的部分均设置有流量控制阀，每个流量控制阀的垂直上方均对应一个真空槽隔间，每个流量控制阀的垂直下方均设置有一个玻璃试管；所述真空槽的侧壁设置有真空槽抽气孔和真空压力表，所述真空槽抽气孔连接抽气管。
11.进一步的，所述进样水槽中部留有一柱状通道以安置输液管，输液管连接进样水槽和固相萃取柱，依靠真空槽的负压实现自动进样，进样水槽底部呈漏斗状。
12.进一步的，所述玻璃试管通过试管架倾斜设置，所述试管架包括通过多根试管支架固定的上层托盘和下层托盘，所述上层托盘和下层托盘之间预留间距，所述上层托盘和
下层托盘均开设有一圈通孔，所述下层托盘的通孔围成圆比上层托盘通孔围成的圆小，每个玻璃试管均穿过上层托盘和下层托盘的一组对应的通孔，每个玻璃试管从上到下朝内倾斜。
13.本发明的有益效果是：本发明的固相萃取仪通过真空形成负压，可实现低成本低能耗自动进样，自动进样期间无需看管，省时省力。
14.本发明的固相萃取仪包括多个进样水槽，可以同时萃取多个样品，极大提高萃取效率。
15.本发明的固相萃取仪真空槽中的试管设计为倾斜放置，洗脱液目标物可先滴落至倾斜的试管口内侧壁，再滑落至试管中，避免了直接滴落在试管液体中引起液体外溅，不仅最小化洗脱液目标物的损耗，还避免了污染其他试管中洗脱液目标物。
16.本发明方法实现采样区域的横向数据和纵向数据的统计，便于综合比较产生高价值参考数据，更全面的研究潮汐影响下抗性基因的演变规律。
附图说明
17.图1是本发明的固相萃取仪的分解图，图2是本发明的固相萃取仪的装配示意图，图中：1.进样水槽；2.水槽支架；3.流量控制阀；4.小柱接口；5.真空槽；6.玻璃试管；7.小柱；8.真空压力表；9.真空槽抽气孔；10.试管架；101. 试管支架；102.上层托盘 ；103.下层托盘；11.小柱托盘。
具体实施方式
18.现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
19.如图1-2所示，本发明的固相萃取仪具体结构为：结合图1，主要包括从上到下依次包括进样水槽1、水槽支架2和真空槽5，所述进样水槽1整体呈圆柱形状，从其中心线朝向四周设置有m个隔板，将其分割成m 1个隔间，图中示意滑出设置有17个隔板，分割成18个隔间，可同时测试18个样品。所述进样水槽1通过水槽支架2架设在真空槽5的垂直上方，水槽支架由两个木制圆环和六根柱子连接而成，用于将水槽搭在真空槽上，减少占地面积，方便固相萃取的进样操作。
20.进样水槽1中部留有一柱状通道以安置输液管，输液管连接进样水槽1和固相萃取柱，依靠真空槽的负压实现自动进样，进样水槽1底部呈漏斗状，中部较低，提高输液管抽取稀释液的效率。
21.进样水槽作为装样品稀释液的容器，其材料为塑料，轻便耐腐蚀，易冲洗，其形状为饼型，每个隔间分别往下对应一个流量控制阀。流量控制阀作为控制稀释液进样流量的阀门，进样时打开开关，进样完毕后关上，避免漏气。
22.所述真空槽5的顶部设置有小柱托盘11，所述小柱托盘11围绕其靠近边缘一圈贯穿设置有若干个小柱7，每个小柱7位于小柱托盘11上方的部分均设置有流量控制阀3，每个流量控制阀3的垂直上方均对应一个真空槽5隔间，每个流量控制阀3的垂直下方均设置有
一个玻璃试管6；玻璃试管6用于装萃取之后液体的容器，玻璃试管6在试管架中倾斜放置，玻璃试管口刚好对应小柱下端出口，液体滴落在玻璃试管内侧壁上，不会有溅出，避免导致其他药剂污染的风险，小柱接口4连接固相萃取柱与真空槽，稀释液经过固相萃取柱、小柱11后掉落在真空槽内。
23.所述真空槽5的侧壁设置有真空槽抽气孔和真空压力表8，所述真空槽抽气孔连接抽气管9。真空压力表8用于观察真空槽内负压大小。真空槽抽气孔是真空槽气体抽取的位点，抽气管9（可选橡皮胶管）连接抽气孔至真空泵，通过真空泵抽取真空槽内气体。
24.所述玻璃试管6通过试管架10倾斜设置，所述试管架10包括通过多根试管支架101固定的上层托盘102和下层托盘103，所述上层托盘102和下层托盘103之间预留间距，所述上层托盘和下层托盘均开设有一圈通孔，所述下层托盘的通孔围成圆比上层托盘通孔围成的圆小，每个玻璃试管6均穿过上层托盘和下层托盘的一组对应的通孔，每个玻璃试管6从上到下朝内倾斜。玻璃试管开口对准滴落的萃取液。
25.试管支架101是试管架的一部分，由三根柱子构成，用于连接试管架的两块托盘，以保证试管的正确放置。
26.本发明的滨海地区潮汐影响下的抗性基因研究方法具体方法为：海滨现场操作步骤1：确定滨海滩涂采样点的布设：根据1：25万等比例尺的采样区域地形地貌图、水系图，按照高、中、低潮位带，沿着海岸线布点，每条潮位带布点10个，相邻点间隔100m，绘制采样点位分布图；步骤2：确定采样时段：根据国家海洋信息中心潮汐时刻表，分别选择潮差最大的大潮和潮差最小的小潮当天的落潮时间段进行采样，掌握涨落潮在时间和空间上的演变规律；步骤3：现场勘察进行布点验证：用北斗定位系统对现场采样点位进行勘察，观察布点环境是否适宜采样，记录现场状况和滩涂底质类型，避免在植被中心地带选点，避开多种底质交错分布的地区，合理调整采样点位，并确定各点位的采样方法；步骤4：在各点位采样：根据现场勘察确定取样方法，分别在大潮和小潮时间段对各点位进行采样，取样深度为表层和表层向下20-30cm，各个点位均在两个深度上采集样品，每个点位每个采样深度采集样品10kg，装入灭菌塑料袋，每个点位至少取样两次，灭菌塑料袋外附上标签，标明采样名称、点位、时间、地点、采样人员信息，接着放入遮光低温箱，用冰袋保存，作为底质样品，运回实验室做下一步处理；实验室操作步骤51，底质样品前处理：每个灭菌塑料袋内的底质样品均分为两部分，其中一部分底质样品于-4℃冷藏保存，用于分析理化指标，另一部分底质样品于-20℃冷冻，冷冻24h后，在105
±
5℃鼓风干燥箱中烘干至恒重，去除风干底质中的石块、微小动植物杂质，进行研磨并过2mm筛，得到细颗粒样品，将未过筛的底质样品再次研磨，研磨后再次过2mm筛，重复多次后，将所有细颗粒样品混合均匀，放入自封袋中密封，于-20℃保存；步骤52，固液提取：步骤521，将pbs缓冲液与乙腈混合，配制好ph=3的乙腈提取溶剂，将步骤51制得的多个点位的细颗粒样品分别取样5g，分别与10ml乙腈提取溶剂装入50ml离心管并进行标
号，摇床振幅调制200rpm，室温下振荡10min，超声提取10min，细颗粒样品和乙腈提取溶剂充分混合形成悬浊液，离心机转速调至5000r/min离心10min，离心管中悬浊液中的细颗粒样品离心沉淀在底部，细颗粒样品中的抗生素被乙腈提取溶剂提取，进入上清液中，分别收集各个离心管中的上清液，保留细颗粒样品沉淀物，接着继续在各个离心管加10ml乙腈提取溶剂，振荡、超声、离心，取上清液，再次在离心管沉淀物中加10ml酸化乙腈，振荡、超声、离心，取上清液，合并各个离心管三次提取的上清液，并加入超纯水稀释定容至300ml，得到各个点位各层样品的稀释液；步骤522，将固相萃取仪各组件装好，真空槽内不放置试管及试管架，作为样品废液缸使用，将步骤521配制的各个点位各层样品的稀释液分别倒入固相萃取仪各进样水槽中并标号，至进样水槽满仓；步骤523，强阴离子交换lc-sax柱下端出口接在hlb柱上端入口形成lc-sax、hlb两柱一体的串联柱（以下简称串联柱），hlb柱下端即串联柱下端安置在固相萃取仪进液孔（即附图1和2上的小柱11上端的小柱接口4）上，真空泵接在真空槽上，开启抽气模式，打开各个流量控制阀开关，气体从串联柱上端吸入，依次使用10ml100%（体积比）甲醇溶液和10ml超纯水活化串联柱，甲醇溶液和超纯水在重力及负压影响下快速通过串联柱，进入上述步骤522真空槽废液缸中，活化完成后，把输液管一端放入进样水槽稀释液中，一端通过密闭接口接在对应lc-sax柱上端，进样水槽稀释液在真空泵负压影响下通过输液管流经串联柱，进入真空槽废液缸，待进样水槽稀释液全部通过串联柱后，在串联柱中的hlb柱中形成了hlb目标物，加入超纯水至进样水槽，清洗输液管和串联柱，超纯水全部通过串联柱后，拆除输液管，去除lc-sax柱，把真空槽内液体倒入实验室废液缸中。将试管和试管架放入真空槽，每个试管口对准上方hlb柱，继续打开真空泵，负压抽真空至真空槽干燥10min，用10ml甲醇对hlb目标物进行洗脱，在试管中获得洗脱液目标物，收集的洗脱液于40℃下氮吹至近干，接着用含0.1%（体积比）甲酸的甲醇定容至1ml，使用0.22μm滤膜过滤，存放于棕色送样瓶中待测，形成样品待测液；以上步骤521-524处理进行三次平行实验，即每个底质样品取15g，分为三组，每组5g作为一个细颗粒样品进行实验，同时设置空白对照组；步骤53，配制抗生素标准储备液：称取抗生素标准品，用甲醇溶液溶解抗生素标准品并配置成抗生素标准液；步骤54，用高效液相色谱-串联质谱仪分析步骤524中样品待测液的抗生素赋存特征，根据色谱分离柱的使用说明设置梯度洗脱程序，得到抗生素的质谱分析参数，对下机原始数据进行积分分析，与步骤53中抗生素标准液进行对比，得到滩涂各点位样品抗生素种类、回收率与检出限；步骤6，对抗性基因种类、丰度进行定量：步骤61，dna提取：采用dna试剂盒提取沉积物中的微生物总dna，从灭菌塑料袋中取出各点位滩涂底质样品，每个样品做三个重复实验，采用分光光度计测定评估dna的浓度和质量，提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取后的dna样品-20℃保存直至后续实验分析；步骤62，pcr扩增、构建质粒：设置目的基因pcr扩增体系，抗性基因上下引物、序列、片段大小和退火温度，得到pcr产物，产物用琼脂糖凝胶电泳，对片段条带单一且大小一致的片段进行割胶，通过dna纯化试剂盒进行纯化后连接到pmd19-t质粒载体上，转移至lb
平板，过夜培养后挑选阳性克隆菌落进行离心，收集菌体，使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，用分光光度计测定质粒溶液浓度，采用标准品专用稀释液进行配比稀释，绘制抗性基因定量标准曲线；步骤7，使用高通量pcr技术对移动遗传元件进行测定：在高通量荧光定量反应平台上完成，所有样本设置三个技术重复，每对引物设置空白阴性对照，依据说明书调整pcr程序，进行抗性基因和移动遗传元件的丰度定量；步骤8，数据分析：对不同潮位带、不同潮期的底质样品中的抗生素、抗性基因、移动遗传元件的多样性、丰度进行比较分析，其差异使用最小差异法检验并通过单因素方差分析方法分析，其相关性使用spearman相关性方法进行分析，对抗性基因与移动遗传元件的共存模式网络化分析，得到不同潮差和潮位带采样点中的抗性基因丰度和组成，抗性基因在潮汐影响下的分布特征、抗性基因与移动遗传元件的共存模式，为滨海水域的抗性基因的研究提供重要的高价值数据。
27.以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。