柔性微纳电极传感器及其制备方法

1.本发明涉及传感器技术领域，尤其涉及一种柔性微纳电极传感器及其制备方法。


背景技术：

2.生物电信号检测以心脏和大脑为重点研究对象，其检测范围包括细胞、组织、器官、以及活体等层面。通过检测电生理特性的信号，能够研究不同疾病机理，对疾病机制及治疗方法具有极高的指导意义。此外，细胞电信号的检测与记录也是药物的研发和筛选的关键技术：研究药物对细胞动作电位峰谱的变化，能够解析药物分子对细胞离子通道开闭的调控机制，进而了解药物治疗效应与毒性效应等有效信息。
3.目前常规的细胞内电信号记录方法是膜片钳技术。膜片钳技术的电流钳技术能够采集标准的动作电位信号，另一种电压钳技术能够采集记录离子通道的响应，这些技术成为解析电兴奋型细胞行为的基础。膜片钳技术一般利用一根含有金属丝的尖头玻璃管当做记录电极，与细胞表面贴附，同时加上负压使细胞膜破裂，记录细胞质中的动作电位。但是因为手动膜片钳的通量低、操作过程复杂且耗时、对细胞造成伤害，所以没法长时记录细胞的电生理信号，当前使用手动膜片钳技术采集信号的时长不超过2小时。另外，现有技术无法对在体细胞内电信号进行检测。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明实施例的目的是提供一种柔性微纳电极传感器及其制备方法，实现高通量、长时间地对在体细胞内电信号进行检测。
5.第一方面，本发明实施例提供了一种柔性微纳电极传感器，包括具有纳米多孔膜的柔性衬底及纳米针电极阵列，所述纳米针电极阵列包括纳米针、预设形状的电极及蛇形电路，所述预设形状的电极连接所述纳米针和所述蛇形电路，所述蛇形电路用于连接外部电路，所述预设形状的电极覆盖在所述柔性衬底的表面，所述纳米针穿透所述柔性衬底的纳米孔。
6.可选地，所述纳米针的表面修饰有阳性离子聚合物。
7.可选地，所述柔性衬底的纳米孔密度范围为0.5孔/μm2～1.5孔/μm2。
8.第二方面，本发明实施例提供了一种柔性微纳电极传感器的制备方法，包括：
9.提供具有纳米多孔膜的柔性衬底；
10.在所述柔性衬底的第一表面的纳米孔覆盖预设形状阵列图案的掩膜板或光刻胶；每一个预设形状图案均具带有蛇形弯曲图案；
11.在所述掩膜板或所述光刻胶上镀导电层后，移除所述掩膜板或所述光刻胶以形成预设形状电极阵列及蛇形电路；
12.基于所述预设形状电极阵列，采用电沉积在所述纳米孔的内壁形成金属实心柱状结构；
13.在所述柔性衬底的第一表面涂绝缘层以封装器件，在所述柔性衬底的第二表面刻
蚀部分衬底以形成外露的金属纳米针。
14.可选地，所述方法还包括：
15.在所述金属纳米针的表面通过巯基反应进行羟基化；
16.在羟基化的金属纳米针表面修饰阳性离子聚合物；
17.封堵未反应的基团。
18.可选地，所述方法还包括：
19.通过扫描电子显微镜评估所述金属纳米针的结构特征及分布特征。
20.可选地，所述方法还包括：
21.通过循环伏安方法检测所述金属纳米针与所述预设形状电极阵列是否连接良好。
22.可选地，所述方法还包括：
23.通过电化学阻抗谱测试所述金属纳米针的电学性能。
24.可选地，所述方法还包括：
25.通过微电极阵列的标准仪器对柔性微纳电极传感器的空白背景噪声进行评估。
26.实施本发明实施例包括以下有益效果：本实施例中柔性微纳电极传感器包括具有纳米多孔膜的柔性衬底及纳米针电极阵列，纳米针电极阵列包括纳米针、预设形状的电极及蛇形电路，预设形状的电极连接纳米针和蛇形电路，蛇形电路用于连接外部电路；通过柔性衬底实现在体细胞电信号的检测，通过纳米针电极阵列实现对细胞内电信号进行高通量和长时间的检测。
附图说明
27.图1是本发明实施例提供的一种柔性微纳电极传感器的结构示意图；
28.图2是本发明实施例提供的一种柔性微纳电极传感器的制备方法的步骤流程示意图；
29.图3是本发明实施例提供的一种制备柔性微纳电极传感器的流程图；
30.图4是本发明实施例提供的一种纳米针表明修饰阳性离子聚合物的流程图；
31.图5是本发明实施例提供的一种柔性微纳电极传感器检测细胞内动作电位图；
32.图6是本发明实施例提供的一种单个细胞内动作电位峰被按时间均匀划分成25段的示意图；
33.图7是本发明实施例提供的一种多通道24个特征点所对应电压值的热图。
具体实施方式
34.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。对于以下实施例中的步骤编号，其仅为了便于阐述说明而设置，对步骤之间的顺序不做任何限定，实施例中的各步骤的执行顺序均可根据本领域技术人员的理解来进行适应性调整。
35.如图1所示，本发明实施例提供了一种柔性微纳电极传感器，其中，图1(a)表示柔性微纳电极传感器的侧视图，图1(b)表示柔性微纳电极传感器的俯视图，包括具有纳米多孔膜的柔性衬底1-1及纳米针电极阵列，所述纳米针电极阵列包括纳米针1-2、预设形状的电极1-3及蛇形电路1-4，所述预设形状的电极1-3连接所述纳米针1-2和所述蛇形电路1-4，所述蛇形电路1-4用于连接外部电路，所述预设形状的电极1-3覆盖在所述柔性衬底1-1的
表面，所述纳米针1-2穿透所述柔性衬底1-1的纳米孔。
36.需要说明的是，柔性衬底的材料包括聚酰亚胺pi、聚碳酸酯、丝蛋白或su8等。柔性衬底可以贴附在弯曲不平的器官表面上，与器官表面形成良好的耦合界面，从而记录到不同器官不同区域细胞的生理电信号。
37.可选地，所述纳米针的表面修饰有阳性离子聚合物。
38.需要说明的是，在纳米针电极表面修饰阳性离子聚合物，优化维持纳米电极长时间穿透细胞膜的条件，并揭示细胞膜穿透机制与细胞安全性。
39.可选地，所述柔性衬底的纳米孔密度范围为0.5孔/μm2～1.5孔/μm2。
40.需要说明的是，柔性衬底的纳米孔密度范围根据细胞的直径大小确定，使一个细胞可以接触到多个纳米针。
41.实施本发明实施例包括以下有益效果：本实施例中柔性微纳电极传感器包括具有纳米多孔膜的柔性衬底及纳米针电极阵列，纳米针电极阵列包括纳米针、预设形状的电极及蛇形电路，预设形状的电极连接纳米针和蛇形电路，蛇形电路用于连接外部电路；通过柔性衬底实现在体细胞电信号的检测，通过纳米针电极阵列实现对细胞内电信号进行高通量和长时间的检测。
42.如图2所示，本发明实施例提供了一种柔性微纳电极传感器的制备方法，包括：
43.s100、提供具有纳米多孔膜的柔性衬底；
44.s200、在所述柔性衬底的第一表面的纳米孔覆盖预设形状阵列图案的掩膜板或光刻胶；每一个预设形状图案均具带有蛇形弯曲图案；
45.s300、在所述掩膜板或所述光刻胶上镀导电层后，移除所述掩膜板或所述光刻胶以形成预设形状电极阵列及蛇形电路；
46.s400、基于所述预设形状电极阵列，采用电沉积在所述纳米孔的内壁形成金属实心柱状结构；
47.s500、在所述柔性衬底的第一表面涂绝缘层以封装器件，在所述柔性衬底的第二表面刻蚀部分衬底以形成外露的金属纳米针。
48.需要说明的是，预设形状阵列图案根据实际应用确定，本实施例不做具体限制，如正方形或圆形等。
49.需要说明的是，导电层包括但不限于金属层，如金层或铂层等。
50.参阅图3，在一个具体的实施例中，在聚碳酸酯纳米多孔膜柔性衬底上构建金纳米针阵列和柔性电路图案。衬底膜上含有孔径为100nm的纳米孔(孔密度为0.1孔/μm2)，通过电沉积方法和等离子体刻蚀工艺可制备金纳米针阵列。为了实现图案化排布的金纳米针阵列，首先通过设计6
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6正方形(尺寸为10μm
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10μm)阵列图案的掩膜版，或者通过紫外光刻技术在多孔膜背侧曝光上6
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6正方形(尺寸为10μm
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10μm)阵列的光刻胶图案。根据多孔膜上纳米孔的间距，所制备出的每个方块阵列上将平均具有10根纳米针(每个心肌细胞的直径》10μm，因此每个细胞将平均接触10根纳米针)。纳米针的间距设计，能有效保障大量的细胞有足够的纳米针进行接触。正方形阵列图案具有蛇形弯曲图案，将正方形阵列逐块独立延展至外部。整个金纳米针传感器件主要由金纳米针为传感模块的6
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6电极阵列和电信号记录的柔性电路图案两部分组成。为了在背侧搭建柔性电路来连接每个独立的传感模块，以便后续的电信号记录。设计蛇形电路图案作为引线，连接纳米针传感模块和外部电路接
触模块。然后利用磁控溅射镀上一层约40nm厚的au层，再直接移除掩膜版，或者通过去胶去除掉未曝光处的光刻胶，从而获得了6
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6排布的au层正方形(尺寸为10μm
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10μm)图案。正方形阵列图案也具有蛇形弯曲au电路图案，将正方形阵列逐块独立延展至外部。蛇形弯曲au电路具有柔性可弯曲性能，避免刚性电路设计在弯曲过程破坏导电性。这些au层正方形方块能够为电沉积制备金属纳米针提供很好的导电接触，使得只有au图案处的孔道内能沉积出纳米针结构。接着以ag/agcl作为参比电极，以pt作为对电极和以多孔膜底部金层工作电极，采用含有haucl4(0.1mm/l)、硫酸钾(10mm/l)、硫酸(1mm/l)、氯化钾(1mm/l)的电镀液进行电沉积。在恒压工作模式下，将金沉积在多孔膜的内壁形成实心柱状结构。在电镀金完成后，采用光刻加工蛇形柔性结构电路(线宽1μm)将正方形电极外接，并制备对电极以形成回路。最后在背侧旋涂su-8绝缘层封装器件。随后机械抛磨去除正面少量过剩金膜，并用o2等离子体刻蚀聚碳酸酯膜上表面，露出直径100nm、长度2μm的金纳米针结构。电信号记录使用ag/agcl电极作为参比电极。通过金属引线将蛇形电路引导出来，便于连接外部电源。将器件封装，防止漏电或漏液。
51.本实施例提出的纳米孔模板法、微纳加工刻蚀、电沉积等多工艺协同新策略，实现在柔性器件上大面积制备高精度的垂直纳米针状电极。
52.可选地，所述方法还包括：
53.在所述金属纳米针的表面通过巯基反应进行羟基化；
54.在羟基化的金属纳米针表面修饰阳性离子聚合物；
55.封堵未反应的基团。
56.参阅图4，在一个具体的实施例中，在金纳米针电极表面通过巯基反应进行羟基化。先将器件用95％乙醇进行清洗，然后加入11-巯基-十一烷酸(7-mercaptoheptanol，5mm)的乙醇溶液，反应24小时。再将金纳米针电极用乙醇进行清洗。接下来，将5％的3-glycidoxypropyl trimethoxysilane(3-gps)溶解在99％的乙醇溶液中，然后加入到金纳米针电极上，加热到60℃反应24小时。反应完后使用乙醇进行清洗。然后将pei高分子以10％浓度溶解于碳酸盐缓冲液(ph 9.5)，然后加入到金纳米针电极中反应24小时。反应完后使用1m的nacl溶液和纯净水清洗多次。然后加入1m的乙醇胺溶液反应6小时，把未反应的环氧树脂基团封堵住。随后将整个金纳米针阵列样品继续使用1m的nacl溶液和纯净水清洗多次。
57.为了优化pei修饰纳米针的穿透细胞膜效率与安全性，拟尝试不同分子量的支链化pei(800，2k，10k，50k)高分子修饰纳米针。修饰完pei的金纳米针阵列，利用x光电子能谱(xps)表征材料表面的元素与含量，从而检验pei是否成功修饰到纳米针表面。当pei分子量为10k，浓度为1％时，修饰效果较好。
58.可选地，所述方法还包括：
59.通过扫描电子显微镜评估所述金属纳米针的结构特征及分布特征。
60.制备了图案化的金纳米针阵列后，通过扫描电子显微镜(sem)观察金纳米针阵列的图案化分布，评估纳米针局域分布的均一性，以及金纳米针的微观结构。金纳米针阵列的几何参数包括直径、高度和密度等均可控调节，优化金属纳米针的形貌，适合后续的细胞内电信号记录。金纳米针的直径和密度由聚碳酸酯多孔膜的孔径和孔密度决定，可通过选择不同规格参数的聚碳酸酯膜来调节金纳米针的直径和密度，而高度可通过改变o2等离子体
刻蚀的时间长短来调节。在技术成熟之后，6
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6排布的阵列模块可以根据记录需求，设计增加为8
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8或甚至10
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10的阵列模块，增加并行记录的通量。
61.可选地，所述方法还包括：
62.通过循环伏安方法检测所述金属纳米针与所述预设形状电极阵列是否连接良好。
63.可选地，所述方法还包括：
64.通过电化学阻抗谱测试所述金属纳米针的电学性能。
65.通过对传感器的基本电学性能测试，评估其高质量信号的记录能力。基于加工的纳米针阵列与背面的电极引线为两个工艺步骤，为了确保纳米针传感器电信号记录功能的可靠性，首先需要对其进行电化学测试。采用循环伏安方法(cv)，在k3fe(cn)6溶液中，扫描纳米针传感器的cv曲线，通过实验电流判断，纳米针与基底背面电极连接是否良好。同时，采用电化学阻抗谱测试方法，扫描100hz-1 mhz之间的纳米针传感器在磷酸缓冲液(pbs)中的阻抗谱，与典型的微电极阵列与纳米传感器阻抗谱作对比，从而进一步确定所研制纳米针传感器的基本性能是否良好。通过阻抗谱扫描，研究不同曲率条件下，纳米针传感器阻抗性能是否有较大改变，从而确定其柔性基底的传感器电学性能的稳定性。
66.可选地，所述方法还包括：
67.通过微电极阵列的标准仪器对柔性微纳电极传感器的空白背景噪声进行评估。
68.在基本电学性能测试之后，需要采用微电极阵列的标准仪器对纳米针传感器的空白背景噪声水平进行评估。采用纳米针传感器记录离体培养的电兴奋细胞的空白背景噪声，评估离体条件下的电信号噪声水平，同时，采用纳米针传感器记录动物的大脑与心脏器官组织的空白背景噪声，评估在体条件下的电信号噪声水平。通过分析阻抗谱和噪声水平，计算得到变异系数(cv)，从而可以评估多通道纳米针传感器间的一致性。通过以上各类性能测试，本研究将进一步对纳米针传感器的加工工艺进行优化和改进，研制出电信号记录性能好的纳米针传感器。
69.另外，本技术中的传感器除了用于离体电兴奋细胞的电信号记录，还将用于在体大脑和心脏的电信号记录，为了实现良好的生物-器件界面耦合，需要采用柔性材料作为传感器基底。通过对基于柔性材料基底的微纳传感器进行柔性测试，从而评价其在大脑和心脏应用产生的拉伸扭曲变形状态下电学性能的稳定性和鲁棒性。对柔性传感器进行反复多次拉伸扭曲变形的抗疲劳测试，通过测试前后阻抗谱特性，确定其鲁棒性。
70.纳米针传感器的稳定性是高性能长时记录生物电信号的基础与保证。纳米针传感器生物电记录的实际应用环境，通常为37℃、高湿、富含有机物、无机盐的离体细胞培养液或在体体液环境，因此，需要采用多种模拟实际环境的稳定性测试。对于离体细胞和组织培养环境条件，需要探索纳米针传感器长期记录电信号的质量变化情况。针对不同电兴奋型细胞(心肌细胞与神经细胞)，基于较长周期内(一周或几周)各时间段数据，对比传统的微电极阵列传感器同步记录数据，掌握生物电信号自身的演变规律，从而建立信号质量的评价标准，有助于选择生物相容性更好、抗磨抗腐蚀性更强的导电材料加工纳米针。
71.通过稳定性和鲁棒性的测试最终确定柔性传感器最佳工作条件和使用寿命。
72.下面以一个具体的实施例对本技术的传感器的使用进行说明。
73.首先、培养实验老鼠的离体心肌细胞与心肌组织，并进行离体心脏灌注培养和准备实验鼠的活体心脏组织。
74.然后、为了检测细胞内电信号，采用活体或者离体的可兴奋型心肌细胞作为研究、测试和应用对象。将细胞培养于多孔板，进行实验时，通过微操作台，将阳离子聚合物修饰的纳米针电极器件调节高度，逐渐压附于细胞上方。如果纳米针穿透细胞膜，电极接触到细胞内环境，就可以记录到细胞内的电信号。通常胞内电信号与标准的动作电位形状相似。通过数据分析，可以计算获得纳米针传感器记录电信号的幅值大小。为了评价传感器电信号记录的灵敏度，采用金标准膜片钳技术同步记录同个细胞的动作电位，进而计算胞内电位幅值与标准动作电位幅值的比例，确定纳米针传感器记录胞内信号的灵敏性，同时根据两种记录方法的噪声水平可以计算得到信噪比，从而全面评估纳米针传感器配合光电透膜技术记录胞内电信号的基本性能。
75.细胞内电信号记录持续性评估：利用纳米针传感器记录到胞内电信号的记录后，由于细胞膜穿孔后纳米裂缝的融合，会使胞内电信号质量降低甚至快速消失，因此，需要对胞内电信号记录的持续性进行评估，通过信号幅值与形态的评估，分析电信号性质与质量的变化情况。本项目将探索多种pei修饰条件、不同纳米针几何结构(直径、长度、间距)、纳米针压附细胞条件的优化，对延长纳米传感器件胞内电信号持续记录时间的作用与影响。
76.细胞内电信号记录准确性评估：胞内电信号准确性也是评估纳米传感器记录功能的重要环节。采用纳米针传感器与膜片钳同步记录同个电兴奋细胞的胞内信号，采用信号等比例压缩的信号分析方法，直接对比两种记录信号的形状是否相近，直观评价两者的相似性。同时采用数据相关性计算方法，分析两者相关系数是否接近1，从理论上进一步评估将两个信号相似性。此外，根据纳米针传感器记录的神经细胞、心脏起搏细胞、心房肌细胞、心肌细胞各自胞内电信号特点(如时程、各特征期间)，与膜片钳记录的标准动作电位特征进行对比，评估纳米针传感器记录的离子通道活动相关信号的准确性。
77.实验结果数据如下：参阅图5，图5(a)表示电穿孔后器件记录到典型的细胞内动作电位，图5(b)表示器件记录到的多通道细胞内动作电位。参阅图6及图7，图6表示单个细胞内动作电位峰被按时间均匀划分成25段，取24个特征点；图7表示多通道24个特征点所对应电压值的热图，由图7记录到的胞内信号第9-15个特征点的电压值较高，其余特征点的电压值较低，与金标准膜片钳的微纳传感器记录到的胞内信号相似。
78.以上是对本发明的较佳实施进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做作出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。