一种同时检测细菌感染两种标志物的荧光免疫层析试纸条

1.本发明属于生物标志物诊断技术领域，具体涉及一种同时检测细菌感染两种标志物的荧光免疫层析试纸条。


背景技术：

2.近年来，随着科学的发展，科学技术的进步，以及广大人民群众的医疗需求，很多技术都逐步应用于检验临床，如荧光免疫层析技术、生物传感器技术、酶联免疫法、干化学法测定技、生物芯片技术，红外与远红外分光光度技术、胶体金免疫层析技术。其中应用最广泛的是荧光免疫层析技术和胶体金免疫层析技术，分别着重于定量检测技术和定性检测技术的研究，实现了一定规模的产业化。从而产生了即时检测这种行业。即时检验（poct），是体外诊断器械（ivd）的一个细分行业，是指实验室之外，靠近检测对象，并能及时报告结果的一个微型的移动检验系统便于在病人旁边进行的临床检测以及床边检测。不一定是由临床检验师来进行，而且是在采样现场即刻进行分析，快速得到检验结果的一类新方法。
3.荧光量子点免疫技术因具有特异性强、敏感性高、速度快、无放射性污染、仪器设备简单等优势，在临床诊断、生命分析、环境科学等领域得到了广泛应用。目前，采用荧光量子点免疫技术检测生物标志物的试剂，但现有技术中都是针对某一种生物标志物进行检测，该方法虽然能得到准确检测结果，但该单独方法检测，不仅检测成本较高，而且操作繁琐，检测耗时长，不利于多种生物标志物临床应用推广。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测细菌感染两种标志物的荧光免疫层析试纸条。所提供的层析试纸条可以同时检测c反应蛋白和降钙素。具有操作简易、反应时间短，可同时检测多个生物标志物等特点。
5.为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种同时检测两种标志物的荧光免疫层析试纸条，所述的试纸条包括：底板1、样品垫2、结合垫3、包被膜4和吸水垫5；其中，所述的结合垫3上包含有荧光量子点标记的炎症标志物crp的特异性抗体ab1-1溶液，炎症标志物pct的特异性抗体ab2-1溶液；所述包被膜上设置有t1、t2两条检测线和一条质控线。
6.进一步的，所述抗体ab1-1溶液、抗体ab2-1溶液的质量浓度均为20~60
µ
g/ml。
7.所述标记抗体ab1-1溶液、标记抗体ab2-1溶液的质量比为1：3。
8.优选地，所述抗体ab1-1溶液、抗体ab2-1溶液均以ph7.4、20mm的磷酸盐缓冲液为溶剂，还包括以下含量组分：20-60μg/ml荧光量子点标记的c反应蛋白特异性抗体ab1-1、质量浓度为0.375%的甘氨酸、10%蔗糖、0.2%碳酸钾、1%bsa、10%蔗糖。
9.所述两条检测线上分别包被有量子点偶联的c-反应蛋白特异性抗体ab1-2和量子点偶联的降钙素原特异性抗体ab2-2；所述的量子点自制量子点，量子点的发射波长为610nm。
10.所述ab1-2、ab2-2的浓度均为1mg/ml；标记ab1-1溶液和标记ab2-1溶液的体积比为1：3。
11.优选的，包被膜上包被的ab1-2、ab2-2均以划线速度为0.7
µ
l/cm的划线速度进行包被。
12.进一步的，所述吸水垫5布设在底板1的一端，样品垫2布设在底板的另一端，包被膜4和结合垫3布设在样品垫2和吸水垫5之间，所述的吸水垫5搭设在包被膜4的一端；所述的结合垫3搭设在包被膜4的另一端，样品垫2搭设在结合垫3上；样品垫2沿着的结合垫3以及包被膜4的方向层析。
13.进一步地，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有上述的同时检测两种标志物的荧光免疫层析试纸条。所述试纸条的制备方法包括：将荧光量子点标记crp的特异性抗体ab1-1溶液、pct的特异性抗体ab2-1溶液用喷金划膜仪器的喷金模式下进行喷金，烘干得到结合垫，将其与样品垫，底板，包被好的包被膜，吸水纸以及卡壳进行组成，将带检测样品从加样孔中加入，等待15min，用干式荧光免疫分析仪进行读数进行荧光强度检测，将其荧光强度带入各标志物的回归方程中，即可得到样品中各生物标志物的浓度。
14.本发明还提供了了上述同时检测两种标志物的荧光免疫层析试纸条在同时检测细菌感染两种标志物crp、pct中的应用。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种同时检测两种标志物的荧光免疫层析试纸条。所述试纸条以c反应蛋白（hscrp）和降钙素原（pct）为生物标志物，采用免疫双抗夹心法原理，利用特异性抗体的特异性结合检测生物标志物。本发明利用荧光量子点的荧光特性，先将其与不同标志物的特异性抗体ab分别进行标记，然后将标记有不同特异性位点的标志物的特异性抗体ab按照相应的浓度配成溶液，包被在硝酸纤维膜检测线（t线），实现在一个反应中同时检测两种生物标志物的目的。本发明制备的试纸条能有效区分不同生物标记物的荧光强度，且不同生物标志物的存在，不会对其他种类生物标志物的检测结果造成影响，无交叉反应。具有检测简单，操作简便，成本低，自动化水平高，时间短等显著优势；同时检测crp和pct两种细菌感染标志物，灵敏度高；试纸条对检测样品无特殊要求，不需要经过复杂的样品处理。本发明通过对标记工艺的探索及优化以及样品垫配方的探索与优化，在即时检验领域具有广阔的应用前景。
附图说明
16.图1是试纸条架构示意图；图2是试纸条检测卡结构示意图；图3是试纸检测结果判断图；图4是crp标准曲线；图5是pct标准曲线。
17.图中：1、底板，2、样品垫，3、结合垫，4、包被膜，5、吸水纸，6、检测线，7、质控线，8、加样孔，9、视窗，10、卡壳。
具体实施方式
18.本发明公开了一种同时检测crp和pct的荧光免疫层析试纸条及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述同时检测crp和pct的荧光免疫层析试纸条已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述同时检测crp和pct的荧光免疫层析试纸条进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
19.试剂：荧光量子点是课题组自制；c反应蛋白特异性抗体ab1-1的货号为金斯瑞hscrp-12d4#；c反应蛋白特异性抗体ab1-2的货号为金斯瑞crp-2r4#；降钙素原特异性抗体ab2-1的货号为霍尔姆斯pct-1020e#；降钙素原特异性抗体ab2-2的货号为pct-1020a#。
20.实施例1如图1所示的同时检测细菌感染的两种标志物的荧光免疫层析试纸条，包括底板1、样品垫2、结合垫3、包被膜4和吸水垫5。其中，所述的吸水垫5布设在底板1的一端，样品垫2布设在底板的另一端，包被膜4和结合垫3布设在样品垫2和吸水垫5之间，所述的吸水垫5搭设在包被膜4的一端；所述的结合垫3搭设在包被膜4的另一端，样品垫2搭设在结合垫3上；用于检测的样品液体通过样品垫2沿着的结合垫3以及包被膜4的方向层析；所述的结合垫3上包含有荧光量子点标记的炎症标志物crp、pct的抗体ab1-1、ab2-1，抗体ab1-1、ab2-1的质量浓度均为20~60
µ
g/ml，将制作完毕的试纸条布设在的检测卡内，便于进一步的血液样本的检测。
21.在包被膜4上分别设置有t1、t2两条检测线6和一条质控线7，t1处包被cpr抗体ab1-2，t2处包被pct抗体ab2-2，浓度均为0.5～1.5mg/ml，划膜量为0.7
µ
l/cm；质控线7包被有羊抗鼠igg多克隆抗体，浓度为1～2mg/ml，划膜量为0.7
µ
l/cm。检测线6处t2检测线与t1检测线间隔3.5mm，t1检测线与质控线7之间间隔距离为3.5mm。所述的样品垫2、结合垫3为玻璃纤维素膜材质，包被膜4为硝酸纤维素膜（nc膜）材质，底板1为pvc胶板材质，吸水垫5为吸水纸材质。
22.图2是试纸条检测卡结构示意图；如图2所示，在检测卡上设有加样孔8和视窗9，加样孔8对应于所述量子点免疫层析试纸条的样品垫2上，视窗9对应于检测线6和质控线7上。
23.本发明采用量子点免疫层析法，将层析技术与量子点标记技术相结合，定量检测人血液样本中的两种炎症标志物：crp、pct；将自制量子点分别与两株高特异性的鼠源抗人crp、pct抗体ab1-1、ab2-1相偶联形成ab-q，并将其预喷金于结合垫的玻璃纤维素膜上；在加样孔8上侧的硝酸纤维素膜（nc膜）上检测线6处t1、t2处分别含有包被在硝基纤维素膜中的两株抗原（crp、pct）不同表位的二抗体（ab1-2/ab2-2）；nc膜上质控线7处包被羊抗鼠igg多克隆抗体。当样本中含有一种或多种待检抗原（ag）时，ag与量子点标记的ab-1结合形成抗原抗体复合物ag-ab-1-q，由于层析作用复合物沿试纸条向前移动，经过检测线6区域时与预包被的ab-2进行反应，形成免疫夹心复合物ab-2-ag-1-ab-q而显现荧光条带；未与ab-2结合的样本继续前移，通过质控线7区域与羊抗鼠igg结合形成复合物igg-ab-1-q并显现荧光条带。若样本中不含待检抗原ag，则仅质控线7显现荧光条带；检测样本时，先将检测卡
置于干净平坦的台面上，然后垂直缓慢滴加100
µ
l人血液样本于检测卡的加样孔8处，等待15分钟后，用干式荧光免疫分析仪进行读数进行荧光强度检测，根据检测线6和质控线7的荧光情况判读结果。将其荧光强度带入各标志物的回归方程中，即可得到样品中各生物标志物的浓度。图3是试纸检测结果判断图；如图3所示，当质控线和两条检测线均有颜色条带，表明双阳性；当质控线有条带，检测线仅有一条带，表明结果单阳性；质控线有条带，检测线没有条带表明结果为阴性；其他情况表明试纸条无效。
24.实施例2本实施例中制备包含有量子点标记的炎症标志物crp抗体、pct抗体，具体步骤为：采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和n-羟基丁二酰亚胺 (nhs) 活化偶联法偶联量子点标记抗体。取10
µ
l量子点（qd）溶液用20mm pb（ph7.4）稀释至60
µ
l，加入的edc 摇匀两分钟，再加入的nhs ，避光涡旋30min进行活化，再分别加入炎症标志物抗体ab1-1和ab2-1，低速涡旋15min后，于摇床，37℃，265rmp条件下，标记3h。3h后，加入牛血清白蛋白（bsa）进行封闭1h。封闭结束后，在转速为18500转的转速，4℃条件下离心20min，弃去上清液，用恢复液（0.375%的甘氨酸、1%bsa、0.2%碳酸钾、10%蔗糖）将pct体积恢复到200
µ
l，将crp体积恢复到100
µ
l即为制备好的量子点标记crp抗体、量子点标记pct抗体。
25.实施例3本实施例中制备结合垫、包被膜、样品垫。
26.结合垫的具体制备方法为：用结合垫处理液（20mmph7.4 pb、0.2%吐温、0.2�sein、0.5%s17）均匀涂布在玻璃纤维素膜上，置于37℃烘箱，过夜烘干。将荧光量子点标记c反应蛋白特异性抗体ab1-1的溶液用喷金划膜仪器的喷金模式下进行喷金，将荧光量子点标记降钙素原特异性抗体ab2-1的溶液用喷金划膜仪器的喷金模式下进行喷金，37℃，30min烘干得到含有荧光量子点-一抗复合物的结合垫。
27.包被膜的制备方法为：将抗原crp、pct不同表位的抗体即二抗（ab1-2/ab2-2）用20mmpb（ph7.2~7.4）调节至浓度为0.5～1.5mg/ml，分别0.7
µ
l/cm划线在nc膜的检测线6的t1、t2处；将羊抗鼠igg用20mmpbs（ph7.2~7.4）调节至浓度为1～2mg/ml，1
µ
l/cm划线在nc膜的质控线7处；检测线6处t2检测线与t1检测线间隔3.5mm，t1检测线与质控线7之间间隔距离为3.5mm。划线完毕后置于烘箱中37℃过夜鼓风干燥。
28.样品垫的制备方法为：用样品垫处理液（20mmph7.4 pb、0.2%吐温、0.2�sein、0.5%s17、0.06mg/mlhrb-5、0.03mg/mlhrb-7）均匀涂布在玻璃纤维素膜上，置于37℃烘箱，过夜烘干。
29.实施例4包含有量子点标记的两种炎症标志物（crp/pct）抗体（ab）的偶联液的处理方法的具体步骤为：荧光量子点标记c反应蛋白一抗的溶液（crpab1-1）通过划金工艺包被在硝基纤维素膜上：首先在硝基纤维素膜上t2线下侧8mm处，划一条封闭液，划线条件为1.5
µ
l/cm，在烘箱烘10min后，在同样的位置以0.5
µ
l/cm的速度进行划金，37℃烘30min。荧光量子点标记降钙素原一抗的溶液（pctab2-1）通过喷金工艺，以4μl/cm的速度喷涂在结合垫上，置于烘箱中37℃鼓风干燥0.5小时。
30.实施例5：标准曲线绘制（1）crp标准曲线制备取不同浓度的crp校准品进行测试定标，其定标数据如表1和图4所示。
31.表1. crp校准品定标数据浓度（ng/ml）0.0980.1950.3910.7811.5633.1256.250荧光值650680702.5731750806.5924浓度（ng/ml）12.50025.00050.000100.000170.000200.000340.000荧光值1943.53248560210721.5160221704226546.5结果显示，crp定标方程为y = 2e-07x
2 0.0085x
ꢀ‑ꢀ
4.737，r2＝0.9986。
32.（2）pct标准曲线制备取不同浓度的pct校准品进行测试定标，其定标数据如表2和图5所示。
33.表2. pct校准品定标数据浓度（ng/ml）0.0240.0490.0980.1950.3910.781荧光值100233229.5358.57291465.5浓度（ng/ml）1.5633.1256.25012.50025.00050.000荧光值313771018918.515731.52329229004结果显示，pct定标方程为y = 2e-07x
2 0.0085x
ꢀ‑ꢀ
4.737，r2＝0.9986。
34.可见，本发明提供的检测试剂盒的线性良好，说明检测试剂盒具有检测结果准确可靠的特点，同时本发明所述试剂盒能够同时检测两种生物标志物，具有操作简便，结果准确性好的特点。
35.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。