AQP1突变型基因、蛋白、细胞系及其应用的制作方法

aqp1突变型基因、蛋白、细胞系及其应用
技术领域
1.本发明属于生物制品领域，涉及细胞与病毒疫苗领域，具体涉及aqp1突变型基因、蛋白、细胞系及其应用。


背景技术：

2.目前，大多数用于生产疫苗的细胞采用转瓶贴壁培养、微载体贴壁培养和悬浮培养三种模式，效率依次递增，生产成本依次递减。对于大规模工业疫苗生产而言，悬浮培养优于微载体培养和转瓶培养：从生产成本的角度看，细胞密度更高、病毒滴度更高、单位疫苗生产成本更小；从过程控制的角度看，悬浮培养细胞集中在一个大的生物反应器中培养，发酵参数易监测易调节、自动化程度高、批间差小、外源污染易控制。因此，悬浮培养将是细胞培养法生产抗病毒疫苗的趋势。
3.使细胞适应悬浮培养的策略有很多，例如使用特殊设计的低血清或无血清培养基，使用细胞摇瓶或者通过基因调控等等。然而，传统的驯化手段只针对一部分具备悬浮生长潜力的细胞有效，对于大部分细胞仍然束手无策。目前国内外能够应用于工业疫苗生产的悬浮细胞种类仍然十分稀缺，仅有bhk21、mdck、per.c6、age1、hek293、eb66和cap几种细胞。动物病毒疫苗生产仍然在大量使用一些生产效率低下的细胞或细胞系，如在家禽病毒培养中广泛应用的鸡胚成纤维细胞等原代细胞，以及鸡胚成纤维细胞系df-1等传代细胞系。为提高家禽疫苗生产效率，急需寻求新的悬浮驯化方法和技术，改变df-1细胞系等禽用细胞系的贴壁生长特性，实现规模化培养。
4.通过基因工程制备悬浮细胞系可以解决传统悬浮驯化方法在细胞产量、遗传背景和驯化时间等方面的不确定性和随机性。一些研究表明，改变细胞的某些贴壁相关基因可以使细胞适应悬浮培养。2005年有学者使用rna干扰技术抑制293t细胞中pten基因的表达能够令细胞失去贴壁能力，改变细胞形态(miseomata s，et al.2005)。2009年，chia chu通过在狗肾细胞mdck中过表达st6galnac5基因，成功实现了mdck细胞的悬浮培养(chia chu et al.2009)。但是，细胞失去贴壁能力并不代表细胞能够悬浮生长，很多贴壁基因的缺失并不能产生可悬浮细胞。另外，许多贴壁基因与癌症有密切关联，上述的pten基因即是一种抑癌基因，抑制该基因的表达很可能导致细胞发生癌变。st6galnac5也是癌症相关基因，过表达该基因的悬浮细胞可能存在癌变风险(huang d，et al.2015)。因此，在开发基因工程悬浮细胞系时，如何通过改变相关蛋白功能，而且在不产生致瘤风险的前提下，提高细胞的悬浮性能将是亟待解决的问题。
5.水通道蛋白(aquaporin，aqp)是细胞膜上一系列能高效选择性地转运水分子的特异性孔道，现已经发现了13个不同类型的水通道蛋白(aqp0-aqp12)，在涉及液体分泌和吸收的宿主细胞中表达，具有转运水、尿液、甘油等功能，并参与机体的多种生理机制。家禽细胞也能够表达多种aqp，其中aqp1可以在肾脏、胃、肠道、卵巢、输卵管等组织细胞中表达，还能在鸡胚绒毛尿囊膜外胚层、内胚层上皮细胞、血管内皮细胞中明显表达。目前还没有人研究报道过关于aqp1蛋白结构与家禽细胞贴壁生长状态之间存在何种关系。


技术实现要素：

6.发明目的：在家禽病理学研究过程中偶然发现，破坏aqp1蛋白结构可以导致家禽细胞贴壁生长状态发生明显改变，且连续传代不产生致瘤作用。因此，为了提高鸡胚成纤维细胞系df-1细胞(源自atcc细胞库，编号atcccrl-12203)的可悬浮性，本发明通过基因编辑敲除df-1细胞的aqp1基因跨膜区部分序列，改变aqp1蛋白功能，从而提高细胞悬浮生长能力，加速悬浮驯化，为禽病毒病疫苗规模化生产提供优秀细胞系。因此，本发明通过敲除或突变鸡胚成纤维细胞系df-1细胞中的aqp1基因，从而提高细胞悬浮驯化效率，而且不产生致瘤风险，研制可高密度培养的禽源细胞系。
7.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了aqp1突变型基因，所述aqp1突变型基因在aqp1野生型基因上缺失了第92-214位核苷酸。
8.其中，所述aqp1突变型基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.seq id no：1序列如下：
10.atggccagtgaattcaaaaagaaaatgttctggagggcggtggtggctgagttcctcgccatgatcctctttatttttatcagcattggctgttctgcggtgcccacttgaacccggcggtgaccctgggcctcctgctgagctgccagatcagcatcttcaaggcgctgatgtacatcctcgcccagtgcctgggggcagtggtggccaccgccatcctgtccggagtcacctcctctctgccctacaactccctggggctcaatgcgcttgcaaaaggaatcaatgcaggccaaggactaggaattgaaatcattgctactctccagctggttttgtgcgttcttgccaccacagaccggagaaggaatgatgtctcaggatcagcacctctggccattggtctctctgttgccttgggacatctccttgcaattgattacaccggttgtggaattaacccagccagatcttttggctcagcactgattgccaacaactttgaaaatcattggatcttctgggttggcccaatcattggaggagcaggtgctgccctgatctatgacttcatcctggctcccagaagcagtgacctgactgatcgcgtgaaggtgtggaccagcggccaagtagaagagtatgatctggaaggagatgatatgaactccagagttgaaatgaagccaaaataa
11.本发明内容还包括编码所述的aqp1突变型基因的突变型蛋白。
12.其中，所述突变型蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
13.seq id no：2如下：
14.masefkkkmfwravvaeflamilfifisigfcgahlnpavtlglllscqisifkalmyilaqclgavvatailsgvtsslpynslglnalakginagqglgieiiatlqlvlcvlattdrrrndvsgsaplaiglsvalghllaidytgcginparsfgsaliannfenhwifwvgpiiggagaaliydfilaprssdltdrvkvwtsgqveeydlegddmnsrvemkpk.
15.本发明内容还包括表达盒、表达载体、细胞系或重组菌株，其含有所述的aqp1突变型基因。
16.本发明内容还包括aqp1突变型df-1细胞系，其含有所述的aqp1突变型基因。
17.本发明内容还包括所述的aqp1突变型df-1细胞系的制备方法，包括以下步骤：通过扩增测序获取了df-1细胞的aqp1基因序列，在其第二外显子中蛋白编码起始密码子后设计sgrna，应用crispr/cas9基因编辑技术，对df-1细胞的aqp1基因的第1、2跨膜区的第92-214位核苷酸实施基因敲除，经过克隆筛选纯化获得aqp1突变型df-1细胞，命名为df-1/aqp1-细胞。
18.其中，所述sgrna的靶向序列如seq id no：3所示。
19.seq id no：3：atcagcattggctcggctct；
20.其中，所述克隆筛选中采用的pcr引物序列如seq id no：4和seq id no：5所示。
21.seq id no：4：gggcagagaaagaggagagat；
22.seq id no：5：agtagagggggacagcaaagt；
23.本发明内容还包括所述的突变型基因、所述的突变型蛋白、所述的表达盒、表达载体、细胞系或重组菌株在细胞悬浮培养或在制备传染性法氏囊病毒疫苗中的应用。
24.有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明通过基因编辑敲除df-1细胞的aqp1基因中第1、2跨膜区间隔序列，改变了aqp1蛋白功能，获得的aq p1突变型细胞具有更好的易悬浮性，且遗传性状稳定，能够应用到家禽病毒疫苗生产中，替代传统细胞疫苗生产工艺，大幅度提高生产效能。
附图说明
25.图1为转染后df-1细胞pcr鉴定结果，m为dna marker，1为转染后的细胞培养物，2-4为未转染细胞对照、空白对照和培养液对照。各泳道中437bp条带为未编辑的扩增产物，315bp大小条带为编辑后的突变基因扩增产物，其他为非特异性扩增条带。
26.图2为df-1/aqp1-和df-1细胞表达aqp1蛋白的跨膜位点预测情况。2a为df-1/aqp1-细胞株aqp1编码基因跨膜位点的预测图，其中33-51aa为膜内区；2b为亲本df-1细胞aqp1编码基因跨膜位点的预测图，其中36-54aa为膜外区。
27.图3为df-1/aqp1-细胞在传代过程中观察图片。3a为即将传代时，长满的细胞；3b为无需胰酶消化，经过简单吹打后的细胞；3c为吹打分散后接种新瓶，生长24h的细胞；3d为接种后生长48h的细胞。
28.图4为df-1/aqp1-和df-1细胞摇瓶培养的生长曲线。
29.图5为df-1/aqp1-和df-1细胞的裸鼠成瘤试验。5a为df-1/aqp1-细胞组裸鼠，5b为cef细胞组，5c为阳性对照组。红色箭头为注射部位或成瘤部位。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场采购获得的常规产品。
31.实施例1df-1/aqp1-细胞的构建
32.1.1 sgrna设计与制备
33.根据ensembl数据库中所登录的鸡aqp1基因序列(ensgalg00000005209)，选择其第2外显子中起始密码子附近-20～437nt序列，应用设计工具(genscript.com)在线设计引导rna序列，命名为aqp1_g1(表1)，并与人、猴、牛、羊基因组进行比对分析脱靶效应。设计并合成aqp1_g1体外转录引物，按照商品化的一步法sgrna体外转录试剂盒(inovogen科技)说明书进行pcr扩增和sgrna转录，并将sgrna浓度调整为400ng/μl。
34.表1试验所用sgrna及体外转录引物
[0035][0036]
1.2转染
[0037]
df-1细胞来源于atcc细胞库(编号atcc crl-12203)，培养细胞使其处于对数生长期，传代至24孔板中制备长满90％孔底的细胞单层。取2.5μl的1.1中转录后的sgrna，与2.5μl的商品化cas9蛋白(genescript公司，5μm)先后加入到第一个1.5ml管中混匀，室温反应10分钟后加入20μl buffer crispr缓冲液得到cas9/grna复合物。按照商品化crispr rnp转染试剂盒(viromer，origene)说明书，在第二个1.5ml管中配置转染试剂25μl(0.4μl viromer 24.6μl buffer crispr)，并与第一个管中的cas9/grna复合物迅速等体积混匀，室温孵育15分钟后加入到24孔板中，培养72小时。
[0038]
1.3基因缺失细胞系的克隆筛选
[0039]
转染后72小时，将24孔板中的转染细胞消化重悬成单个细胞，以96孔板有限稀释法进行亚克隆。挑选长出单一细胞克隆的孔，以建立的pcr方法(引物见表2)筛选aqp1基因缺失的细胞克隆。
[0040]
表2试验所用缺失鉴定引物与测序引物
[0041][0042]
将选育的df-1/aqp1-细胞以pbs清洗3次后，按照10000个细胞/ml的密度以pbs重悬，取200μl上清，利用dna/rna抽提试剂盒提取核酸。以提取细胞rna作为模板，使用设计的引物aqp1f和aqp1r进行rt-pcr扩增，挑选出现缺失条带的细胞进一步培养。
[0043]
经过第一轮细胞亚克隆培养和pcr鉴定，获得了一株pcr出现120bp左右缺失条带的克隆(见附图1)，选择该株进一步亚克隆纯化，获得生长良好、pcr鉴定为纯净的基因缺失的细胞克隆株，扩大传代并保存，命名为df-1/aqp1-。
[0044]
1.4 df-1/aqp1-株基因测序鉴定
[0045]
根据ensemb1数据库中所登录的鸡aqp1基因序列(ensgalg00000005209)设计引物，同1.3所述对df-1/aqp1-株的aqp1蛋白编码基因进行全长扩增并测序(引物aqp1wf和aqp1wr见表3)。测序结果与参考基因中相关序列进行比对。
[0046]
表3试验所用缺失鉴定引物与测序引物
[0047][0048]
测序比较发现，df-1/aqp1-细胞的aqp1基因编码区全长为693bp，与亲本株813bp
相比，crispr系统在aqp1_g1靶序列近pam位点发生了双链断裂，切口处造成超过120bp碱基缺失，经随机修复重新连接，形成基因突变型。与亲本细胞相比，突变型细胞株缺失了92～214nt区域共计123bp碱基序列，同时出现3bp因随机修复的插入碱基(见序列表seq id no：1)。推导其氨基酸序列并与亲本细胞进行比对，突变型细胞的aqp1基因编码230aa蛋白，较亲本细胞突变了31-72aa处共42aa(其中缺失了40aa)，覆盖第1和第2跨膜区间隔序列(图2)。df-1/aqp1-株的aqp1基因编码序列和其氨基酸序列见seq id no：2。
[0049]
综上，本实施例将df-1细胞敲除aqp1基因近n端部分序列，筛选获得一株细胞克隆，该细胞的分子特征是其aqp1蛋白缺少第1和第2跨膜区间隔序列，以下简称df-1/aqp1-细胞。
[0050]
实施例2 df-1/aqp1-细胞的生长特性
[0051]
2.1 df-1/aqp1-细胞贴壁培养与形态观察
[0052]
配置含有5％新生牛血清的dmem培养基(gibco)作为细胞生长液，以吸管吹打分散df-1/aqp1-细胞，按照每t25培养瓶1
×
106个细胞的浓度传代，同时对亲本株同上方式传代，观察细胞形态与生长状态。突变型克隆株df-1/aqp1-的细胞形态与亲本细胞相比无明显差别，但是突变株细胞贴壁后易于机械分散，尤其是在细胞进入对数生长后期和平台期，通过吸管吹打即可脱离瓶壁，分散成单个细胞或4-16个细胞团。分瓶传代后，细胞铺展好，仍能够贴壁生长，呈较为均匀的多角或梭样结构(见图3)。
[0053]
2.2 df-1/aqp1-细胞悬浮培养
[0054]
对数生长期的细胞按照5
×
105cells/ml的浓度接种到125ml摇瓶中，加入含有5％血清的30ml dmem培养基。5％co2摇床37℃条件下150rpm培养72小时。1,200rpm离心5min收集细胞，重新用30ml培养基悬浮和分瓶，以细胞初始浓度5
×
105cells/ml进行继代培养。如果72小时后，细胞浓度超过1
×
106cells/ml，则需降低初始接种密度为1
×
105cells/ml至3
×
105cells/ml。如果培养72小时后细胞浓度低于1
×
106cells/ml，则更换新鲜培养基继续培养。同时设置未突变的亲本df-1细胞作为对照细胞，同样进行摇瓶培养，与处理组进行比较。连续传代并观察记录每72小时的细胞浓度，可见亲本df-1细胞在连续悬浮培养5代均不能稳定达到1
×
106cells/ml，而df-1/aqp1细胞在悬浮培养第2代48小时，即可达到1
×
106cells/ml，连续培养5代细胞生长基本稳定(图4)。
[0055]
实施例3 df-1/aqp1-细胞成瘤性试验
[0056]
选取生长状态好，处于对数生长期的df-1/aqp1-细胞，在细胞生长至80-90％满时，收集细胞。用pbs或者无血清培养基重悬细胞至5
×
107个细胞/ml。同时设置5
×
107个细胞/ml的cef作为阴性对照组，1
×
107个细胞/ml的bhk-21细胞作为阳性对照组。选择5-8周龄裸鼠，体重18-20g左右，颈背部皮下接种细胞，每组5只，每只0.2ml。接种前将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团。接种后连续观察35天至12周，检查有无结节或肿瘤。接种后，阳性对照组裸鼠在接种部位出现明显肿块，直径可达10mm，精神委顿，采食减退。阴性对照组小鼠和试验组小鼠均未见结节或可疑肿瘤组织，精神、饮食无异常表现(图5)，35天和12周后剖检及组织切片检测均未发现有肿瘤细胞。
[0057]
实施例4 df-1/aqp1-细胞aqp1突变的传代稳定性
[0058]
将df-1/aqp1-细胞连续传代20代以上，取第20代样品，按照实施例1中全长测序所用引物及步骤，扩增aqp1编码区全长约693bp目的片段，送生工生物工程(上海)有限公司测
序，测序结果与突变细胞系早期代次的aqp1编码序列进行比对，其序列同源性100％，未出现任何回复突变，df-1/aqp1-株的遗传较为稳定。
[0059]
实施例5 df-1/aqp1-细胞培养传染性法氏囊病毒疫苗抗原的初步应用
[0060]
对数生长期的df-1/aqp1-田胞按照5
×
105cells/ml的浓度接种到125ml摇瓶中，加入30ml dmem培养基，5％co2摇床150rpm培养48小时，按照0.005moi接种传染性法氏囊病毒bjq902株(山东绿都生物科技有限公司疫苗毒株)。继续悬浮培养72小时，期间定时测定葡萄糖消耗程度，当葡萄糖浓度低于1g/l时，补加至4g/l。以tcid
50
测定法检测传染性法氏囊病毒含量。应用悬浮培养的df-1/aqp1-细胞增殖传染性法氏囊病毒，在接种病毒后36-48小时内，病毒效价可达10
9.1
tcid
50
/ml，与传统贴壁培养法培养的相同数量df-1亲本细胞相比，如表4，其单位产量可提高3.98-19.95倍。
[0061]
表4试验接种传染性法氏囊病毒后病毒增殖比较(tcid
50
/ml)
[0062] 批次1批次2批次3摇瓶悬浮培养10
9.1
10
8.9
10
9.1
传统贴壁培养10
8.1
10
7.6
10
8.5