一种重金属Fe3+和Cr6+的快速检测试剂盒及其应用

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和cr6 对单原子铈纳米酶类氧化酶活性增强的程度差异研发一种在同一体系中fe3 和cr6 的检测方法。[0006]本发明提供了一种重金属fe3 和cr6 的快速检测方法，包括：单原子铈纳米酶溶液、底物试剂、缓冲液以及待测样品；所述单原子铈纳米酶是具有类氧化酶活性的纳米酶，对重金属fe3 和cr6 具有特异性；所述单原子铈纳米酶溶液其溶剂为乙醇和5%nafion溶液组成的混合溶剂；所述底物是指能够在氧化酶作用下会生成颜色变化的物质；所述缓冲液是酸性的醋酸盐缓冲液。[0007]进一步的，重金属fe3 和cr6 的快速检测方法包括（50-150）：1体积分数的乙醇：5%nafion溶液溶解的单原子铈纳米酶0.08-0.12μm、二甲基亚砜溶解的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）1-5mm，ph为2.0-4.0的醋酸盐缓冲液以及待测样品。[0008]所述tmb会在单原子铈纳米酶的类氧化酶作用下生成蓝色氧化产物tmbox，在652nm处产生特征吸收峰。[0009]本发明中fe3 和cr6 能分别加速单原子铈纳米酶类氧化酶活性完成对tmb的氧化，基于时间差异实现在同一体系中fe3 和cr6 的检测。[0010]优选的，重金属fe3 和cr6 的快速检测体系为99：1体积分数的乙醇：5%nafion溶液溶解0.08-0.12μm的单原子铈纳米酶、二甲基亚砜溶解的tmb为2mm，ph为3.6的醋酸盐缓冲液以及待测样品。[0011]另一方面，本技术开发一种重金属fe3 和cr6 的快速检测试剂盒，试剂盒中利用上述的检测方法及单原子铈纳米酶。[0012]另一方面，本发明提供一种重金属fe3 和cr6 的快速检测方法的应用。应用包括重金属污染物检测，食品安全检测等。所述食品包括小麦、桃、玫瑰花茶、红茶、芹菜、菠菜、油炸鸡肉、冷冻鸡肉等的检测。[0013]另一方面，本发明提供一种重金属fe3 和cr6 的快速检测试剂盒的应用。应用包括重金属污染物检测，食品安全检测等。所述食品包括小麦、桃、玫瑰花茶、红茶、芹菜、菠菜、油炸鸡肉、冷冻鸡肉等的检测。[0014]其他方面，本发明提供了一种重金属fe3 和cr6 的快速检测试剂盒及其应用，包括：（1）单原子铈纳米酶类氧化酶活性的验证和评估，（2）快速检测试剂盒检测体系的构建。[0015]一方面，本发明提供上述单原子铈纳米酶类氧化酶活性的验证和评估，包括：氧化底物分子特征吸收峰、类氧化酶最佳反应条件和拟合参数大小；所述氧化底物分子特征吸收峰是指氧化底物tmb被单原子纳米酶氧化后再652nm处产生的特征吸收峰；所述类氧化酶最佳反应条件，反应ph2.0-4.0、反应温度20-40℃、反应时间10-15min和单原子铈纳米酶溶液浓度0.1-0.16μm；所述拟合参数为：最大反应速率（vmax）为1.14×10-8ms-1、米氏常数（km）为0.20mm和酶活力（sa）为7.72u/mg；类氧化酶活性验证和评估过程为：在96孔板中加入170μl的ph3.6的醋酸盐缓冲液，再加入20μl的tmb溶液，最后再加入10μl的单原子铈纳米酶溶液，混合均匀后在10min内观察溶液颜色是否变为蓝色，且通过酶标仪在652nm处检测是否有特征吸收峰。若溶液颜色变为蓝色，且在652nm处有特征吸收峰，即说明单原子铈纳米酶具有类氧化酶活性，反之则无。[0016]在上述同样的体系中，测试其酶活力sa以及酶动力学参数vmax和km以此来评价单原子铈纳米酶类氧化酶活性的大小。[0017]另一方面，本发明提供上述快速检测试剂盒体系的检测条件：本发明快速检测试剂盒的检测分析原理：利用单原子铈纳米酶具有类氧化酶活性，能在15min内催化氧化底物tmb显蓝。然而fe3 和cr6 均能显著促进单原子铈纳米酶表面氧化还原体系中ce4 与ce3 的电子转移加速tmb的氧化，缩短催化氧化时间。且单原子铈纳米酶对fe3 的亲和力高于cr6 ，两者分别能使单原子铈纳米酶在30s和60s内催化tmb变为蓝色。通过时间分辨观察体系的颜色变化及652nm处的吸光度，实现对食品基质中fe3 和cr6 的检测（图1）。[0018]具体检测过程为：分别将小麦、桃、玫瑰花茶、红茶、芹菜、菠菜、油炸鸡肉、冷冻鸡肉作为实际样品进行分析检测。将上述实际样品均匀称取约0.5g，加入5.0ml浓硝酸，1ml的30%h2o2进行微波消解20min后加水稀释定容至50.0ml，得到待测样液进行检测（图1）。[0019]借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：本发明基于fe3 和cr6 对增强单原子铈纳米酶类氧化酶活性的差异研发的快速检测试剂盒具有以下优点：（1）能在30s及60s内分别实现对fe3 和cr6 的检测，大大缩短了检测时间。[0020]（2）操作简易，不需要专业人员及大型仪器设备。附图说明[0021]图1为fe3 和cr6 检测原理及操作流程。[0022]图2为单原子铈纳米酶类氧化酶活性验证。图a为单原子铈纳米酶类氧化酶活性化学式及原子图；图b为单原子铈纳米酶类氧化酶活性验证的吸收光谱。[0023]图3为单原子铈纳米酶对底物的亲和力。图a为fe3 米氏方程；图b为fe3 双倒数图；图c为cr6 米氏方程；图d为cr6 双倒数图；图e为h2o2米氏方程；图f为h2o2双倒数图。[0024]图4为单原子铈纳米酶类氧化酶活性优化。图a为反应ph对类氧化酶活性的影响；图b为反应温度对类氧化酶活性的影响；图c为反应时间对类氧化酶活性的影响；图d为单原子铈纳米酶溶液浓度对类氧化酶活性的影响；图e为2mh2so4和2mnaoh条件下对类氧化酶活性的影响；图f为保存时间对类氧化酶活性的影响。[0025]图5为单原子铈纳米酶类氧化酶活性拟合参数；图a为米氏方程及双倒数图；图b为酶活力sa线性拟合图。[0026]图6为快速检测试剂盒体系优化；图a为fe3 与cr6 对tmb的催化氧化影响；图b为反应ph；图c为单原子铈纳米酶溶液浓度；图d为底物tmb浓度。[0027]图7为灵敏度分析。图a为fe3 检测的灵敏度实物检测图；图b为cr6 检测的灵敏度实物检测图。[0028]图8为特异性分析。[0029]图9为加标样品检测应用。图a为检测实物图；图b为fe3 检测结果；图c为cr6 检测结果。具体实施方式[0030]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。[0031]实施例1一种基于单原子铈纳米酶类氧化酶活性构建时间分辨传感器用于fe3 和cr6 检测方法的建立1、实验材料3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）由上海麦克林生化科技有限公司提供；二甲基亚砜（dmso）由阿拉丁试剂（上海）有限公司提供；k 、cu2 、cr3 、cd2 、ca2 、mg2 、pb2 、fe3 、na 、zn2 、sr2 、hg 、as3 、cr6 、al3 、f-、cl-、br-、so42-、no3-、po43-标准品溶液标准品由青岛泉畅科贸有限公司提供；醋酸钠、氢氧化钠、无水乙醇、冰乙酸、30%过氧化氢、浓硝酸由上海源叶生物科技有限公司提供。5%nafion由上海生物科技有限公司提供、fcp96296孔板由上海碧云天生物技术有限公司提供、cnw进样小瓶由上海睿齐实业有限公司提供。[0032]生活饮用水、自来水取自生活所在地；菠菜、芹菜、桃、油炸肉、冷冻肉、红茶、玫瑰花茶及小麦均购买于当地生活超市。[0033]2、传感器的设计原理利用单原子铈纳米酶具有类氧化酶活性，能在15min内催化氧化底物tmb显蓝。然而fe3 和cr6 均能显著促进单原子铈纳米酶表面氧化还原体系中ce4 与ce3 的电子转移加速tmb的氧化，缩短催化氧化时间。且单原子铈纳米酶对fe3 的亲和力高于cr6 ，两者分别能使单原子铈纳米酶在30s和60s内催化tmb变为蓝色。通过时间分辨观察体系的颜色变化及650nm处的吸光度，实现对食品基质中fe3 和cr6 的检测（图1）。[0034]3、单原子铈纳米酶类氧化酶活性验证在96孔板中加入170μl的0.2mph3.6的醋酸盐缓冲液，再加入20μltmb（溶解于dmso中），最后再加入10μl单原子铈纳米酶溶液，混合均匀后在10min内观察溶液颜色是否变为蓝色，且通过酶标仪在652nm处检测是否有特征吸收峰。若溶液颜色变为蓝色，且在652nm处有特征吸收峰，即说明单原子铈纳米酶具有类氧化酶活性（图2）。反之则无。[0035]4、检测机理验证基于h2o2产生•oh能促进单原子铈纳米酶结构中ce3 与ce4 之间的电子转移，从而增强其类氧化酶活性。然而fe3 和cr6 同样也能促进单原子铈纳米酶结构中ce3 与ce4 之间的电子转移，增强其类氧化酶活性。因此，我们通过酶动力学实验计算单原子铈纳米酶与fe3 、cr6 与h2o2三者之间的亲和力大小判断三者促进电子转移的快慢。分别在0.125、0.25、0.375、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25和2.5μg/mlfe3 溶液（图3a,b）；0.125、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7和8μg/mlcr6 溶液（图3c,d）及0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75、0.875、1、1.125和1.25mh2o2溶液中（图3e,f）进行了酶动力学参数实验，验证及比较单原子铈纳米酶与三者的亲和力大小。发现单原子铈纳米酶对fe3 的亲和力强于cr6 ，强于h2o2，因为fe3 的米氏常数km值最小、cr6 的米氏常数为次之、h2o2最大，由此可以证明fe3 、cr6 比传统的h2o2更能显著增强单原子铈纳米酶类氧化酶活性，提高其催化速率。[0036]实施例2检测条件优化结果1、单原子铈纳米酶类氧化酶活性优化为了使其类氧化酶活性能最大程度发挥，我们对其可能的影响因素进行了优化，如反应ph（图4a）、反应温度（图4b）、反应时间（图4c）和单原子铈纳米酶溶液浓度（图4d），以及酸碱耐受性（图4e）和保藏时间（图4f）。因此，最优的反应条件为：ph3.6醋酸盐缓冲液、反应时间12min、反应温度37℃以及单原子铈纳米酶浓度为0.124μm。[0037]2、单原子铈纳米酶类氧化酶活性拟合参数在最佳的反应条件下评估单原子铈纳米酶类氧化酶活性的大小。通过计算酶动力学参数vmax、km（图5a）及其酶活力sa（图5b）来评价单原子铈纳米酶类氧化酶活性的大小。[0038]因此，最终的反应数据为：vmax为1.14×10-8ms-1、km为0.20mm以及sa为7.72u/mg。[0039]3、快速检测试剂盒体系优化分别将相同浓度的fe3 、cr6 加入到相同的体系中，探究fe3 、cr6 种类对tmb催化氧化的影响（图6a）；通过设置ph为2.0、3.6、4.5、6.0、7.0和8.0的naac-hac缓冲液，探究反应ph对检测体系性能的影响（图6b）；通过设置0.0177、0.0354、0.0531、0.0632、0.0885、0.1062和0.1239μm的单原子铈纳米酶溶液的浓度，探究其浓度对检测体系性能的影响（图6c）；通过设置0.5、1、1.5、2、2.5和3mm的tmb浓度，探究其浓度对检测体系性能的影响（图6d）。因此，最优的检测条件为：ph3.6的醋酸盐缓冲溶液、单原子铈纳米酶溶液浓度为0.08-0.12μm；底物tmb浓度为2mm。[0040]实施例3检测方法的灵敏度测定根据上述优化体系，分别对fe3 和cr6 的灵敏度进行探究，在fe3 灵敏度分析中，随着fe3 浓度的增加，体系在30s时的颜色变化增强，当浓度达到2.75μg/ml时，继续提高fe3 的浓度吸光度值开始下降，60s之后可以观察到加入有高浓度fe3 溶液的体系颜色由30s时的蓝色变为绿色再变成为蓝黑色，直到最终颜色退却。主要原可能高浓度的fe3 导致体系出现沉淀使吸光度值下降。因此，fe3 的浓度在0.25、0.375、0.5、0.75、1、1.25和1.5μg/ml线性范围内与652nm处的吸光度呈现很好的线性关系，线性回归方程为y=0.44x 0.15，计算所得检出限lod为34.72ng/ml（图7a）。与此同时，在相同的体系中加入不同浓度的cr6 ，随着其浓度的增加，在开始的30s内，未出现任何颜色变化，直到60s后体系呈现出不同的颜色变化，且颜色一直保持稳定状态，未出现颜色减退现象。因此，cr6 的浓度在0.5、0.75、1、2、3、4和5μg/ml线性范围内与652nm处的吸光度呈现很好的线性关系，线性回归方程为y=0.16x 0.18，计算所得检出限lod为93.65ng/ml（图7b）。最终fe3 和cr6 所得lod值均在国家规定的要求范围内，表明所构建的fe3 和cr6 检测方法具有可行性。[0041]实施例4检测方法的选择性验证探究了检测体系对fe3 和cr6 的选择性，在最佳的检测条件下探究了在不同阴阳离子作用下fe3 、cr6 能否特异性增强单原子铈纳米酶类氧化酶活性。可发现只有fe3 和cr6 的加入能在短时间内使得体系由无色状态变为蓝色，在652nm处的吸光度值显著高于其他离子（图8）。[0042]实施例5加标样品检测应用在10个样品的检测过程中发现，加入fe3 后在30s内几乎都呈现出相似的蓝色变化，其中生活饮用水、自来水管水和菠菜中的蓝色程度相对较深（图9a），在652nm处的吸光度值较高。所构建的时间分辨传感器对fe3 的回收率分别为88.66-113.24%，标准偏差为0.62-2.75%。且实验发现在60s之后，除了生活饮用水、自来水管水体系中的蓝色几乎没褪色以外其他样品体系都呈现出不同程度的褪色。加入cr6 的体系在前30s内均未出现任何颜色变化，但在60s之后各个样品呈现出不同的颜色变化，其中菠菜、小麦的蓝色最深（图9a）。通过记录在60s时的吸光度变化来计算出检测体系对cr6 回收率为85.49-111.22%，标准偏差为0.97-4.34%。并且本文构建的检测方法对fe3 与cr6 的检测结果与icp-ms仪器的最终检测结果几乎一致（图9b-c），说明了本发明构建的检测方法具有对实际样品检测的可行性。[0043]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12当前第1页12