一种物理质控品及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及临床凝血检验技术领域，具体涉及一种物理质控品及其制备方法和应用。


背景技术：

2.血栓弹力图，1948年由德国人hartert发明，它能从一份血样完整地监测从凝血开始至凝块形成及纤维蛋白溶解的全过程。对凝血因子、纤维蛋白、血小板聚功能以及纤维蛋白溶解等方面进行凝血全貌的检测和评估。血栓弹力图仪临床运用需要良好质量控制，才能得到及时有效准确的诊断结果。血栓弹力图采用物理和化学的方法检测血液凝固状态。在37℃条件下，抗凝全血在圆柱形的检测杯中，以4
°
45
′
角(频率0.1hz)，来回摆动，血凝块形成、回缩、溶解，产生的扭转力以及黏弹性传导至杯盖和悬垂丝，扭转力转换成电子信号，通过a/d转换盒从而在电脑上形成血栓弹力图。因此血栓弹力图仪的质量直接影响临床评价结果，血栓弹力图仪的准确性和稳定性显得尤为重要，评价和控制血栓弹力图仪稳定性的质控品也就成了临床检验的关键。
3.目前，市场上控制血栓弹力图仪的质控品主要来源于人、猪、牛、马等动物的血浆，质控品制备工艺中必须含有冷冻干燥。因质控品中含有大量的凝血因子，具有酶活性，异常天气(高温，大于37℃)下很难保持良好且持久的活性，同时检测过程中易受其他试剂的干扰，存在稳定性不高、无法耐受高温、无法在室温下储存运输的问题。
4.现有技术cn108132352b公布了血栓弹力图仪无血清质控品及其用途，通过调节丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺、过硫酸盐、稳定剂(碳素或矿物油)等在水溶液中的比例，制备一种化学成分明确的无机物聚合物，实现对仪器进行低凝、高凝、正常凝血三种状态下工作状态的检验或者矫正，保证检测数据的稳定和可靠。但现有技术仍然存在以下问题：
5.1)本方案使用试剂丙烯酰胺类成分具有神经肌肉毒性和致癌性、四甲基乙二胺具有致毒致癌性，导致该方案制备的质控品的安全性得不到保证；
6.2)本方案中因四甲基乙二胺在室温下长期放置易失活，导致该方案制备的质控品稳定性欠缺，且仍然存在不易长期保存、不耐受温度的问题，无法满足每日检测的质控品质量的稳定性要求。


技术实现要素：

7.本发明意在提供一种物理质控品，以解决现有技术中物理质控品因原料致毒致癌、制备工艺复杂、成本较高以及稳定性欠缺，从而导致检测准确度和精确度均欠缺的问题。
8.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种物理质控品，其原料包括琼脂和水。
9.本方案的原理和优点是：
10.1、相比于现有技术中质控品原料致毒致癌，本方案的质控品溶质为琼脂，溶剂为水，琼脂为自海藻中提取的多糖，广泛应用于食品、各种饮料、科研、药膏基质等，因此本发明技术方案的物理质控品安全性极好。
11.2、相比于现有技术中质控品制备工艺复杂、成本较高，本方案的质控品按重量称取琼脂，按体积量取水，长期存储时分离存放，使用时合并加热熔化即可；制备过程无需冷冻干燥，无需调配，其制备工艺简单、成本低廉。
12.3、与现有技术中质控品需要添加酶活性成分、化学活性成分、稳定剂相比，本发明技术方案中无需添加任何酶活性成分、化学活性成分和稳定剂，仅需琼脂。申请人通过不同处置温度(2-8℃、25℃、60℃、100℃)对多类型原料进行筛选(涉及猪血浆凝块类(添加或不添稳定剂)、聚丙烯酰胺凝胶类(添加或不添稳定剂)、海藻酸及钠盐凝胶类(添加或不添稳定剂)、鸡蛋白凝块类(添加或不添稳定剂)、琼脂凝块类(添加或不添稳定剂))，发现：随着温度升高，无论是未添加稳定剂还是添加稳定剂的猪血浆凝块类、聚丙烯酰胺凝胶类、海藻酸及钠盐凝胶类、鸡蛋白凝块类成分的血栓弹力图反应性均明显降低，100℃条件下完全丧失，均无法形成良好的血栓弹力图；而琼脂凝块类成分无论是未添加稳定剂还是添加稳定剂在0-100℃均表现出非常好的稳定性，形成良好的血栓弹力图。通过大量研究筛选出耐受高温(100℃)的物理质控品原料琼脂。申请人单用琼脂制备而成的物理质控品即能表现出良好的血栓弹力图反应性，具备优良的稳定性。现有技术制备的质控品均依赖于冷链储存运输，而本方案制备的物理质控品耐受0～100℃高温，仅需常温即可完成储存和运输，有效保证质控品的稳定性。
13.4、与现有技术中质控品易受凝血因子干扰剂(如氯化钙、肝素钠、枸橼酸钠等)影响相比，本方案质控品中无酶活性成分，不受凝血因子干扰剂的干扰，因此本方案物理质控品具有更好的使用稳定性；申请人实验发现，将常温运输的质控品应用于血栓弹力图仪检测时结果稳定，具体显示为批内方差和批间方差均小于行业标准(≤10％)，符合物理质控品的稳定性要求和精确性检测标准；因此本方案质控品可为临床检验提供质量可靠、价格低廉的优质服务。
14.优选的，所述物理质控品包括质控品i、质控品ⅱ和质控品ⅲ。采用上述方案，将加热后的质控品置入血栓弹力图样品杯中，质控品中琼脂逐渐冷却形成凝块，血栓弹力图仪描记质控品凝块形成过程的各项参数(r、k、angle、ma等)，形成血栓弹力图。其中质控品i、质控品ⅱ、质控品ⅲ形成的血栓弹力图参数能够基本覆盖临床样本检测值，便于操作者准确有效地控制和校准血栓弹力图仪。
15.优选的，所述质控品ⅰ中琼脂的浓度为4mg/ml≤浓度＜6mg/ml。采用上述方案，血栓弹力图仪描记质控品凝块形成的血栓弹力图中r值范围为4.6～5.7，质控品中琼脂浓度较低，有效模拟血栓弹力图仪在血液低凝状态下的凝血参数。
16.优选的，所述质控品ⅱ中琼脂的浓度为6mg/ml≤浓度＜8mg/ml。采用上述方案，血栓弹力图仪描记质控品凝块形成的血栓弹力图中r值范围为2.1～3.6，质控品中琼脂浓度居中，有效模拟血栓弹力图仪在血液正常状态下的凝血参数。
17.优选的，所述质控品ⅲ中琼脂的浓度为8mg/ml≤浓度≤11mg/ml。采用上述方案，质控品ⅲ在血栓弹力图仪中得到的血栓弹力图的r值为2.1～3.1，质控品中琼脂浓度较高，有效模拟血栓弹力图仪在血液高凝状态下的凝血参数。
18.优选的，一种物理质控品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
19.s1：准备溶剂：量取水，将水装于管中密封保存；
20.s2：准备溶质：称取琼脂，将琼脂装于管中密封保存；
21.s3：制备物理质控品：将s2中水加入至s1中琼脂，混匀后熔化即得。
22.采用上述方案，质控品与水分离存放和运输，使用时将质控品与水按比例添加，混匀后加热使琼脂完全熔化，快速配制工作状态的质控品，使得质控品更加便于储存、运输，保证其稳定性。
23.优选的，在s1中，所述水为自来水、去离子水和纯化水中任意一种。去离子水为不含离子的水，纯化水为不含离子及有机物的水，采用上述方案，便于保证琼脂熔化后的分散性和均匀性，同时进一步降低质控品的成本。
24.优选的，在s1中，所述水的用量为0.5～10ml。采用上述方案，可根据实际检测血栓弹力图仪需要的质控品量进行配置质控品。
25.优选的，在s3中，所述熔化温度为100℃。琼脂具有95℃以上熔化、40℃以下凝固的特性，采用上述方案，完全符合琼脂的高熔点和低凝点的特性，琼脂自熔点降温至凝点的过程足够完成血栓弹力图仪的检测和校准测试。
26.优选的，一种物理质控品在检测和校准血栓弹力图仪中的应用。将质控品置入血栓弹力图样品杯中，温度由100℃逐渐冷却至37℃，琼脂逐渐冷却形成凝块，血栓弹力图仪描记质控品凝块形成过程的各项参数(r、k、angle、ma等)，形成血栓弹力图。质控品中琼脂浓度与r、k、angle、ma相关性强，质控品i、质控品ⅱ、质控品ⅲ形成的血栓弹力图参数能够基本覆盖完临床样本检测值，能够准确有效地控制和校准血栓弹力图仪。
附图说明
27.图1为本发明实验例1中预测质控品中琼脂浓度与血栓弹力图参数的量效关系图。
28.图2为本发明实施例1检测所得血栓弹力图。
29.图3为本发明实施例2检测所得血栓弹力图。
30.图4为本发明实施例3检测所得血栓弹力图。
31.图5为本发明实施例1～3、对比例1检测所得血栓弹力图的对比图。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
33.本发明质控品与水分离存放和运输，使用时将质控品与水按比例添加，再于100℃加热后完全熔化，快速配制工作状态的质控品，熔化后的琼脂水溶液(即质控品)置入血栓弹力图样品杯中，温度由100℃逐渐冷却至37℃，琼脂逐渐冷却形成凝块，血栓弹力图仪描记质控品凝块形成过程的各项参数(r、k、angle、ma等)，形成血栓弹力图。质控品中琼脂浓度与r、k呈负相关，与angle、ma呈正相关，4～10mg/ml琼脂水溶液包括质控品i、质控品ⅱ、质控品ⅲ，形成的血栓弹力图参数能够基本覆盖完临床样本检测值。通过建立质控品的赋值范围，然后用质控品测量血栓弹力图仪，对照质控品的赋值范围，检测值位于赋值范围内
则正常，否则异常。
34.以具体实施例展示一种物理质控品及其制备方法和在检测和校准血栓弹力图仪中的应用。其中实施例1～3分别展示质控品ⅰ～ⅲ的制备及检测，对比例显示空白对照水作为质控品对血栓弹力图仪进行检测；实施例1～3、对比例1中制备及检测的质控品在成分和用量上差异如表1所示。以实施例1为例，说明制备和检测质控品的操作步骤。具体如下：
35.实施例1：物理质控品ⅰ的制备
36.s1：准备溶剂：取水按1ml/瓶规格分装于塑料管中密封室温保存。
37.s2：准备溶质：称取琼脂5mg，置于塑料管中密封室温保存。
38.s3：制备质控品ⅰ：取1支s2中准备的琼脂，轻敲管壁使琼脂粉末落于底部，开盖后加如s1中准备的水，封盖后上下颠倒5次，于100℃加热10min，再上下颠倒5次，立即检测，若不能立即检测，应于100℃条件下维持。
39.表1实施例1～3、对比例1的原料差异
40.实施例琼脂/mg水/ml产品实施例151质控品ⅰ实施例271质控品ⅱ实施例391质控品ⅲ对比例1-1空白对照
41.实验例1：质控品中琼脂浓度与血栓弹力图参数的量效关系
42.如实施例1所示方式配置琼脂浓度为4～11mg/ml的质控品，共计制备12组质控品(4mg/ml、5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.6mg/ml、7mg/ml、7.7mg/ml、8mg/ml、8.8mg/ml、9mg/ml、9.9mg/ml、11mg/ml)。
43.采用血栓弹力图仪(美国血液技术公司，teg5000)对质控品分别进行预期结果、均匀性(精密度)检测，具体如下：
44.1、检验步骤：
45.a.装载样品杯。
46.b.加340μl混合均匀的样品于样品杯中。
47.c.按照血栓弹力图仪使用要求进行检测，直到ma(血块强度)值确定。
48.2、预期结果：
49.随机抽取同批次的3瓶质控品进行检测，重复3次，每次测量结果应符合r、k、angle、ma均应在标示赋值范围内的要求。
50.根实验结果参照以琼脂浓度为x轴，血栓弹力图参数(r、k、angle、ma)为y轴，分别进行线性相关模拟，求得相关系数及线性相关方程，实验结果及得出的琼脂浓度与血栓弹力图参数的量效关系如图1所示。
51.实验例2：质控品ⅰ～ⅲ、对比例1在血栓弹力图仪中的检测及结果：
52.采用血栓弹力图仪(美国血液技术公司，teg5000)对质控品分别进行预期结果、均匀性(精密度)检测，具体如下：
53.1、检验步骤：
54.a.装载样品杯。
55.b.加340μl混合均匀的样品于样品杯中。
56.c.按照血栓弹力图仪使用要求进行检测，直到ma(血块强度)值确定。
57.2、预期结果：
58.随机抽取同批次的3瓶质控品进行检测，重复3次，每次测量结果应符合r、k、angle、ma均应在标示赋值范围内的要求。
59.3、均匀性：
60.随机抽取同批次的10瓶质控品进行检测，重复10次，根据式(1)、式(2)、式(3)计算10次检测结果的平均值标准差(sd)及变异系数(cv)，结果应符合r、k、angle、ma的变异系数(cv)均应≤10％的要求。
61.(1)
62.(2)
63.(3)
64.实施例1～3、对比例1检测的血栓弹力图效果比较如图1所示。结果显示，质控品(质控品i、质控品ⅱ、质控品ⅲ)均可形成良好的血栓弹力图，而水无法形成良好的血栓弹力图，质控品与水呈明显差异，说明物理质控品具体良好的血栓弹力图反应性。
65.其中实施例1制备所得质控品i的检测结果如表2和图2所示，实施例2制备所得质控品ⅱ的检测结果如表3和图3所示，实施例3制备所得质控品ⅲ的检测结果如表4和图4所示，实施例1～3、对比例1的的检测结果对比如图5所示。
66.表2实施例1检测结果
[0067][0068]
表3实施例2检测结果
[0069][0070]
表4实施例3检测结果
[0071][0072]
本发明技术方案首次采用非动物血浆类、非活性物质类的试剂作为物理质控品的成分。根据血栓弹力图仪的实验结果，如表2、表3和表4所示，质控品ⅰ、质控品ⅱ、质控品ⅲ的r值、k值、angle值、ma值的变异系数(cv)均小于10％，符合要求(要求r值、k值、angle值、ma值的变异系数(cv)均应≤10％)。在与水的对比实验中发现，如图1、图2、图3和图4所示，本发明技术方案质控品(质控品i、质控品ⅱ、质控品ⅲ)均可形成良好的血栓弹力图。使用本方案制备的质控品作为血栓弹力图仪检测的物理质控品，结果稳定，能通过不同比例的
琼脂溶液评价血栓弹力图的稳定状态。
[0073]
实验例3：质控品ⅰ、质控品ⅱ、质控品ⅲ的赋值：
[0074]
随机抽取同批次的20瓶质控品进行检测，重复20次，根据式(1)、式(2)、式(3)计算20次检测结果的平均值标准差(sd)，根据式(4)计算质控品的赋值范围。
[0075]
(4)
[0076]
采用血栓弹力图仪(美国血液技术公司，teg5000)对质控品分别进行赋值，实验结果见表5、表6。
[0077][0078]
表6物理质控品赋值统计表
[0079]
赋值范围r(min)k(min)angle(deg)ma(mm)
质控品ⅰ赋值范围4.6-5.75.5-8.326.1-35.644.9-62.4质控品ⅱ赋值范围2.1-3.61.8-2.848.6-70.067.2-91.7质控品ⅲ赋值范围2.1-3.11.4-2.455.4-7867.9-98.1
[0080]
实验数据表明，本方案质控品在高温加热后完全融化，呈均匀分散真溶液。当质控品置入血栓弹力图样品杯中，温度由100℃逐渐冷却至37℃，琼脂逐渐冷却形成凝块，血栓弹力图仪描记质控品凝块形成过程的各项参数(r、k、angle、ma等)，形成血栓弹力图。质控品中琼脂浓度与r、k、angle、ma相关性强，质控品i、质控品ⅱ、质控品ⅲ形成的血栓弹力图参数能够基本覆盖完临床样本检测值，能够准确有效地控制和校准血栓弹力图仪。
[0081]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。