一种减毒沙门氏菌和PD-1抗体抑制剂联合药物及其在制备治疗肿瘤药物中的应用的制作方法

一种减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物及其在制备治疗肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.免疫检查点阻断剂是目前国际抗恶性肿瘤药物开发的热点，以pd-1抗体抑制剂为例，pd-1抗体可通过结合t细胞表面的pd-1受体，解除肿瘤的免疫抑制状态，从而有效抑制与缓解恶性肿瘤的发展进程（sharma et al., science 2015, 348(6230):56-61）。肿瘤pd-1抗体抑制剂治疗方案（immune checkpoint inhibitor：ici）欲获得好的治疗效果还需要肿瘤被t细胞高度浸润（sznol et al.，cancer j 2014, 20(4):290-295），表面表达高水平的抑制性检查点pd-1（flemming et al., nat rev drug discov 2012, 11(8):601）。很多恶性肿瘤缺乏浸润性t细胞，对ici反应低，导致pd-1抗体的临床应用有效率不高，仅为10-30%（sznol et al., cancer j 2014, 20(4):290-295）。因此，如何在肿瘤部位诱发更多t细胞出现，启动肿瘤的t细胞反应，这是pd-1抗体治疗的关键因素。
3.近年来恶性肿瘤的细菌治疗正在成为新兴的抗肿瘤治疗方法，其中包括了利用减毒沙门氏菌进行肿瘤治疗。细菌的抗肿瘤能力不仅与自身固有的抗肿瘤活性有关，还与宿主的免疫反应（包括炎症反应和t细胞依赖性免疫反应）有关（lee et al., appl microbiol biotechnol 2011, 92(6):1251-1260; lee et al., j immunother 2009, 32(4):376-388）。除此之外，细菌在肿瘤组织中的聚集能够增加宿主免疫细胞的穿透能力（duon et al., exp mol med 2019, 51(12):1-15; lou et al., nanomicro lett 2021, 13(1):37）。
4.目前，缺乏一种改善pd-1抗体治疗有效性的有效方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供了一种减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物及其在制备治疗肿瘤药物中的应用，能够改善pd-1抗体治疗有效性的有效方法，将鼠伤寒沙门氏菌与pd-1抗体联合应用治疗恶性肿瘤的方案。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明的一种减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物，所述的减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物为减毒鼠伤寒沙门氏菌与pd-1抗体抑制剂联用，所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌为所述细菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009及其基因改造菌株；pd-1抗体抑制剂为pd-1抗体卡瑞利珠单抗。
7.本发明所述的减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.进一步地，鼠伤寒沙门氏菌与pd-1抗体阻断剂的给药时间间隔和次数具体为：给细菌后第四天开始给药pd-1纳米抗体，每次间隔两天，给药三次；pd-1抗体阻断剂的给药方
式为腹腔或静脉给药。
9.进一步地，不同剂量的减毒沙门氏菌vnp20009和pd-1抗体阻断剂，分别为vnp20009：2
×
104；2
×
105，2
×
106，所述的单位为cfu/只；pd-1抗体，给药剂量分别为：1.6，3.2，8，所述的单位为mg/kg。
10.更进一步地，所述的减毒沙门氏菌为通过静脉注射、腹腔注射、口服给药、皮下给药、瘤内给药途径进行联合治疗。
11.进一步地，减毒沙门氏菌和pd-1抗体阻断剂联合应用后，小鼠的恶性肿瘤生长得到显著抑制，存活时间显著延长，具有显著的协同增效作用。
12.有益效果：本发明发现减毒沙门氏菌与pd-1抗体联合应用产生了显著增强的恶性肿瘤治疗作用，荷瘤小鼠的肿瘤生长都得到显著抑制，存活时间得到延长。减毒沙门氏菌vnp20009及其突变菌株作为低毒易培养的细菌，成本低廉，具有大规模推广应用的前景。
13.与现有技术相比，本发明具有如下优点：（1）选择兼性厌氧型细菌鼠伤寒沙门氏菌vnp20009及其突变菌株，因为其具有良好的肿瘤靶向性和抑制肿瘤的效果，具有安全性好的特点。
14.（2）选择减毒沙门氏菌vnp20009作为pd-1抗体的增效剂，是因为vnp20009可以增加荷瘤小鼠组织中免疫细胞的浸润，增加肿瘤组织中诸如pd-l1等免疫检查点抑制剂水平的表达。
附图说明
15.图1为本发明的减毒沙门氏菌vnp20009和pd1抗体（苏州盛迪亚生物医药公司）联用后小鼠黑色素瘤的肿瘤生长倍增时间（*p＜0.05，**p＜0.01）。1、pbs组（1.83天）；2、pd1抗体组（2.08天）；3、vnp20009组（6.62天）；4、vnp20009和pd1抗体联用组（7.84天）。
16.图2为本发明的减毒沙门氏菌vnp20009和pd1抗体（苏州盛迪亚生物医药公司）联用后小鼠黑色素瘤的肿瘤延滞时间（*p＜0.05，**p＜0.01）。1、pbs组（9.83天）；2、pd1抗体组（11.21天）；3、vnp20009组（17.16天）；4、vnp20009和pd1抗体联用组（19.86天）。
具体实施方式
17.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
18.实施例1本发明的一种减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物，所述的减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物为减毒鼠伤寒沙门氏菌与pd-1抗体抑制剂联用，所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌为所述细菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009及其基因改造菌株；pd-1抗体抑制剂为pd-1抗体卡瑞利珠单抗。
19.本发明所述的减毒沙门氏菌和pd-1抗体抑制剂联合药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
20.鼠伤寒沙门氏菌与pd-1抗体阻断剂的给药时间间隔和次数具体为：给细菌后第四天开始给药pd-1纳米抗体，每次间隔两天，给药三次；pd-1抗体阻断剂的给药方式为腹腔或
静脉给药。
21.不同剂量的减毒沙门氏菌vnp20009和pd-1抗体阻断剂，分别为vnp20009：2
×
104；2
×
105，2
×
106，所述的单位为cfu/只；pd-1抗体，给药剂量分别为：1.6，3.2，8，所述的单位为mg/kg。
22.所述的减毒沙门氏菌为通过静脉注射、腹腔注射、口服给药、皮下给药、瘤内给药途径进行联合治疗。
23.减毒沙门氏菌和pd-1抗体阻断剂联合应用后，小鼠的恶性肿瘤生长得到显著抑制，存活时间显著延长，具有显著的协同增效作用。
24.试验例1联用方案在小鼠黑色素瘤上的抗肿瘤效果（1）小鼠黑色素瘤模型的建立b16f10小鼠黑色素瘤细胞在dmem细胞培养基中生长至指数生长期后用0.5% 胰酶消化，接着1000 rpm/min离心3 min，去除上清培养液后用pbs洗涤2次后进行细胞计数，最后用 pbs重悬细胞将细胞终浓度调整为2
×
10
6 个/ml。每只c57bl/6 小鼠接种100 μl于小鼠腋下脂肪垫处，即2
×
10
5 个/只。接种后小鼠饲养于清洁级动物房中，待小鼠肿瘤体积生长至约100 mm3时进行后续实验。
25.（2）给药方式不同剂量的减毒沙门氏菌vnp20009及其突变菌株和pd-1抗体，分别为vnp20009：2
×
104，2
×
105，2
×
106（单位：cfu/只）；卡瑞利珠单抗，给药剂量分别为：1.6，3.2，8（单位：mg/kg）；每组10只小鼠，观察肿瘤生长状况。减毒沙门氏菌和卡瑞利珠单抗都呈现出较好的剂量依赖性地抗肿瘤疗效；从中进行最佳组合筛选。
26.荷瘤小鼠随机分组后，先腹腔注射细，在注射细菌后第三天腹腔注射卡瑞利珠单抗，之后每隔2天给药一次，一共给药三次。
27.pd-1抗体卡瑞利珠单抗为苏州盛迪亚生物医药公司生产。
28.筛选出最佳联用剂量组合后（细菌：2
×
10
6 cfu/只；卡瑞利珠单抗：8 mg/kg），分别设置pbs组，2、pd1抗体组，3、vnp20009组，4、vnp20009和pd1抗体联用组。每组10只。pbs组仅腹腔注射100 ml无菌的pbs。肿瘤体积的计算按照公式v = length
ꢀ×ꢀ
width2×
0.52 计算获得。每隔一段时间对特定组别小鼠进行肿瘤大小的量取并经计算后用于绘制肿瘤生长曲线图，数值以sd
±
sem表示。
29.在小鼠黑色素瘤模型中，vnp20009和卡瑞利珠单抗联用组的肿瘤生长倍增时间由pbs对照组的1.83天，卡瑞利珠单抗组的2.08天、vnp20009组的6.62天增加至7.84天（图1），联用组的肿瘤生长倍增时间分别比卡瑞利珠单抗组延长276.9%、比vnp20009组延长18.4%；并且即使vnp20009组的肿瘤生长倍增时间也比卡瑞利珠单抗组延长218.2%；与pbs对照组相比，卡瑞利珠单抗组治疗后肿瘤生长倍增时间时间延长13.7%，vnp20009组治疗后肿瘤生长倍增时间延长261.7%，vnp20009和卡瑞利珠单抗联用组的肿瘤生长倍增时间延长328.4%。与pbs对照组相比，vnp20009和卡瑞利珠单抗联用组的肿瘤生长倍增时间延长328.4%，远远大于卡瑞利珠单抗组治疗后肿瘤生长倍增时间延长13.7%和vnp20009组治疗后肿瘤生长倍增时间延长261.7%之和（275.4%）；vnp20009和卡瑞利珠单抗联用组疗效所致的肿瘤生长倍增时间延长的幅度与卡瑞利珠单抗组和vnp20009组单独治疗后疗效所致的
各组肿瘤生长倍增时间延长幅度的加和的理论值相比，是两组疗效加和的理论值的1.19倍，因此，vnp20009和卡瑞利珠单抗联用确实产生了协同增效的治疗效果。
30.vnp20009和卡瑞利珠单抗联用后小鼠黑色素瘤的肿瘤生长延滞时间由pbs组的9.83天、卡瑞利珠单抗组的11.21天和vnp20009组的17.16天延长至19.86天（图2）。联用组的肿瘤生长延滞时间分别比卡瑞利珠单抗组延长77.2%、比vnp20009组延长15.7%，并且即使vnp20009组的肿瘤生长延滞时间也比卡瑞利珠单抗组延长53.1%。与pbs对照组相比，卡瑞利珠单抗组治疗后肿瘤生长延滞时间延长14.0%，vnp20009组治疗后肿瘤生长延滞时间延长74.6%，vnp20009和卡瑞利珠单抗联用组的肿瘤生长延滞时间延长102.0%。与pbs对照组相比，vnp20009和卡瑞利珠单抗联用组的肿瘤生长延滞时间延长102.0%，远远大于卡瑞利珠单抗组治疗后肿瘤生长延滞时间延长14.0%与vnp20009组治疗后肿瘤生长延滞时间延长74.6%之和（88.6%），vnp20009和卡瑞利珠单抗联用组疗效所致的肿瘤生长延滞时间延长的幅度与卡瑞利珠单抗组和vnp20009组单独治疗后疗效所致的各组肿瘤生长延滞时间延长幅度的加和理论值相比，是两组疗效加和的理论值的1.15倍，因此，vnp20009和卡瑞利珠单抗联用确实产生了协同增效的治疗效果。
31.上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。