一种高产赤藓糖醇的菌株及其发酵产赤藓糖醇的方法

1.本发明涉及食品发酵技术领域，尤其是涉及一种高产赤藓糖醇的菌株及其发酵产赤藓糖醇的方法。


背景技术：

2.赤藓糖醇是一种分子量为122.12、熔点为126℃的四碳多元醇。它是一种低热量的甜味剂，同时赤藓糖醇口感好、不致龋齿、结晶好。所以在食品工业领域有较为广泛的应用。赤藓糖醇的热量只有蔗糖的10％左右，在整个的消化过程中，由于分子量较小能够被小肠直接吸收，并随尿液排出体外。由于赤藓糖醇不通过胰腺消化，因此不会引起胰岛素的变化而导致血糖升高，不影响糖的整个代谢过程。很适合作为糖尿病患者的甜味剂。赤藓糖醇的大规模生产是通过利用葡萄糖发酵来实现的。这种方法始于上个世纪90年代，发酵过程以水解的小麦和玉米淀粉作为主要的碳源。赤藓糖醇是由酵母菌，如三角酵母(trigonopsisvarabilis)，毛孢子菌属(tichosporon sp.)，原酵母(torula sp.)，木兰假丝酵母(candida magnoliae)和小丛梗孢属(monilella sp.)等酵母类真菌发酵产生的。较高初始浓度的葡萄糖，有利于高渗微生物的赤藓糖醇的合成。一般情况下，如果微生物能够耐受较高的糖浓度和较高的渗透压，则初始葡萄糖浓度的增加会提高其成品率和产量。
3.解脂亚罗酵母是目前主要的赤藓糖醇生产菌种，以天然菌种为主，人工遗传改造的菌种在产品安全性和生产稳定性上存在隐患(合成赤藓糖醇的重组解脂亚罗酵母菌的构建方法及其菌株。发明人：程海荣，王楠，池萍。申请号：202010069250.6)。解脂亚罗酵母需要在高渗透压的发酵环境下才能积累赤藓糖醇。天然菌种耐渗透压的能力有限，体现为接种在含有30％以上浓度葡萄糖或甘油中时生长延滞期长，代谢速度缓慢，总发酵时间一般需要超过100小时(一种赤藓糖醇发酵生产方法。发明人：杨顺保，王瑞昌，张培红，卢佩龙，付松，崔怀成。申请号：201910901559.4)。
4.另一方面，为了避免染菌，初始发酵培养基需要升温至120℃并保温灭菌，消耗了大量蒸汽；灭菌后培养基需要降温至30℃左右，进一步增加了能耗。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种高产赤藓糖醇的菌株及其发酵产赤藓糖醇的方法。本发明通过创造性劳动，设计了条件对野生型解脂亚罗酵母进行耐高渗透压的适应性进化，来获得可以在高浓度葡萄糖形成的极高渗透压下快速生长和代谢的菌种。利用这一菌种进行赤藓糖醇的发酵生产，由于培养基底物浓度极高，杂菌无法生长，所以无需高温灭菌即可接种发酵。本发明还创造性地使用了全细胞回收再次利用的发酵方法，缩短了生产时间，同时减少污染物的排放。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种高产赤藓糖醇的菌株，其分类命名为解脂亚罗酵母(yarrowia lipolytica)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24118。
其its序列如seq id no.2所示。
8.优选的，所述菌株由自然界筛选后经过适应性进化获得。
9.产赤藓糖醇菌株筛选的方法为：将从自然界采集的蜂蜜中收集到的样品放入富集培养基(葡萄糖400g/l，蛋白胨5g/l，酵母膏5g/l)中，于30℃、200r/min摇床培养4天，取适量稀释液涂布于筛选平板培养基(木糖醇400g/l，蛋白胨5g/l，酵母膏5g/l，琼脂15％)上，30℃培养3天；挑选菌落较大并且形态类似于酵母的菌株，用无菌牙签挑出，接种到含有发酵培养基的24孔深孔板中，将深孔板固定到摇床上，在30℃，200r/min条件下培养3-4天后检测发酵液。
10.发酵液中的赤藓糖醇含量采用高效液相色谱检测，色谱柱为氨基柱，流动相为乙腈:水(80:20)，流速为1.0ml/min，柱温40℃，进样量20μl，检测器为示差检测器。标品(葡萄糖、赤藓糖醇)浓度均为1g/l。
11.产赤藓糖醇菌株适应性进化的方法为：将自然筛选获得的菌株，通过在摇瓶培养基中培养种子液，然后以1％(v/v)接种量转接至含有450g/l葡萄糖的摇瓶连续培养48h，取适量菌液在平板上分离获得单菌落，获得第一代适应性进化的菌株。接着，利用梯度增加葡萄糖浓度的24孔板小体积液体培养传代结合固体平板培养基分离的方式，以菌体比生长速率作为菌株筛选依据，迭代挑取单菌落传代培养，直至酵母生长受到严重影响则停止环境胁迫，实现稳定传代后筛选出耐渗透压性能提升的酿酒酵母适应性进化突变菌株。最后进行发酵实验，验证赤藓糖醇的合成速率及转化率。
12.一种所述高产赤藓糖醇的菌株在合成赤藓糖醇中的用途。
13.一种所述高产赤藓糖醇的菌株用于合成赤藓糖醇的方法，在第一批发酵结束后，回收全部菌体细胞，再次加入新鲜发酵培养基进行下一批次的发酵；所述方法包括如下步骤：
14.(1)菌种活化，将解脂亚罗酵母(yarrowia lipolytica)菌种cgmcc no.24118接种到ypd培养基，活化后制得活化的种子；
15.(2)种子培养，将步骤(1)活化后的种子接种到含有种子培养基的摇瓶中，培养后制得种子液；
16.(3)分批发酵，将步骤(2)制得的种子液接种在含有发酵培养基的发酵罐中，进行分批发酵；接种量为10-15％；
17.(4)细胞回用发酵，步骤(3)发酵结束后，分离发酵液中的细胞和可溶性产物，补加培养基成分，形成培养液，继续发酵；
18.(5)发酵结束后，发酵液中提纯赤藓糖醇。
19.步骤(1)中，ypd培养基的成分包括葡萄糖、蛋白胨和酵母粉，自然ph。
20.步骤(2)中，种子培养基的制备方法为：将酵母粉、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁于水中，调节ph6.4，高压灭菌后加入灭菌后的葡萄糖溶液。
21.步骤(2)中，种子培养基的成分为：12g/l酵母粉，6g/l柠檬酸铵，1.2g/l磷酸二氢钾，0.6g/l七水合硫酸镁，200g/l葡萄糖；ph为6.0。
22.步骤(3)中，发酵培养基的制备方法为：将葡萄糖、酵母粉、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氯化铜与适量消泡剂混合，加热溶解，调节ph至4.0，即得。
23.步骤(3)中，发酵培养基的成分为：320g/l葡萄糖，10g/l酵母粉，0.224g/l磷酸二
氢钾，0.448g/l七水合硫酸镁，0.0045g/l氯化铜；ph为6.0。
24.步骤(4)中，培养液中成分为：葡萄糖300-450g/l，氮源添加量10-50g/l，磷酸氢二钾添加量0.1-5g/l，磷酸二氢钾添加量0.1-5g/l，七水合硫酸镁0.5-2g/l，氯化铜10-30mg/l。
25.本发明有益的技术效果在于：
26.(1)本发明利用从自然界筛选到的微生物作为赤藓糖醇生产菌株，并且通过适应性进化提高其产量，与基因工程菌株相比，是一种非转基因菌株，避免了转基因的风险，有利于赤藓糖醇发酵实现高浓度、高转化率和高效率的统一，对相关行业技术提升具有重要促进作用。产品可以应用于食品行业。
27.(2)耐高渗酵母能够大量积累赤藓糖醇的机理是在高渗透压(高糖或高盐浓度)的环境中合成相容性的渗透物质，如赤藓糖醇，以适应环境。本发明利用适应性进化手段逐步增加环境中渗透压，使菌种应激性增强赤藓糖醇的合成，开发了一种高效的育种方法。
28.(3)本发明筛选并鉴定的赤藓糖醇生产菌株是解脂亚罗酵母，符合食品安全菌株的标准。该菌种的培养条件简单，在高渗透压环境下生长速度快，赤藓糖醇产量高，副产物少，应用于工业生产可以有效降低赤藓糖醇的生产成本。
29.(4)本发明生的可另一个有益的技术效果是利用细胞回用的发酵工艺，既减少了废弃物的排放，又节约了大量灭菌蒸汽，缩短了发酵时间。
附图说明
30.图1不同浓度葡萄糖环境下产赤藓糖醇菌株适应性进化的步骤；
31.图2为经过不同代次适应性进化后菌株产赤藓糖醇能力；
32.图3样品8-2发酵液的高效液相色谱结果；
33.图4为菌种在高渗透压环境下生长速率；
34.图5为不同温度下菌种在高渗透压环境下生长速率；
35.图6为适应性进化菌株突变基因的注释及其功能分类；
36.图7为适应性进化菌株突变位点在代谢途径中的分布(kegg分析)；
37.图8为分批发酵的过程曲线；
38.图9为细胞回用发酵的过程曲线；
39.图10回用次数对产物的影响。
具体实施方式
40.下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
41.实施例1产赤藓糖醇菌株的筛选
42.将从自然界采集的蜂蜜中收集到的样品放入富集培养基(葡萄糖400g/l，蛋白胨5g/l，酵母膏5g/l)中，于30℃、200r/min摇床培养4天，取适量稀释液涂布于筛选平板培养基(木糖醇400g/l，蛋白胨5g/l，酵母膏5g/l，琼脂15％)上，30℃培养3天；挑选菌落较大并且形态类似于酵母的菌株，用无菌牙签挑出，接种到含有发酵培养基的24孔深孔板中，将深孔板固定到摇床上，在30℃，200r/min条件下培养3-4天后检测发酵液。
43.发酵液中的赤藓糖醇含量采用高效液相色谱检测，色谱柱为氨基柱，流动相为乙
腈:水(80:20)，流速为1.0ml/min，柱温40℃，进样量20μl，检测器为示差检测器。标品(葡萄糖、赤藓糖醇)浓度均为1g/l。
44.在1.5ml离心管中加入200μl无菌水，从平板上刮取3-4环新鲜的酵母菌体于离心管中。振荡洗涤后8000g离心1min，吸尽上清液。在离心管中加入酵母裂解液100μl，振荡混匀后置于恒温金属浴中85℃反应15min，得到酵母染色体dna粗提液。
45.在pcr薄壁管中加入上述酵母染色体dna粗提液1μl，10
×
pcr缓冲液5μl、dntp mixture 4μl、30μmol/l的its区域序列上下游通用引物(tccgtaggtgaacctgcgg；tcctccgcttattgatatgc)各0.5μl、ex taq dna聚合酶0.2μl，补无菌水至50μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸1min，经过30个循环后，72℃再延伸6min。核苷酸序列测定参照bigdye terminator v3.1试剂盒说明书进行。将测序结果用sequence scanner v1.0软件进行分析，查看序列的长度及可信度。选择测序结果中可信度较高的区域，提交至ncbiblast网站进行比对。its序列如seq id no.1所示，菌种同源性＞98％。
46.实施例2产赤藓糖醇菌株的适应性进化
47.将自然筛选获得的菌株，通过在摇瓶培养基中培养种子液，然后以1％(v/v)接种量转接至含有450g/l葡萄糖的摇瓶连续培养48h，取适量菌液在平板上分离获得单菌落，获得第一代适应性进化的菌株。接着，利用梯度增加葡萄糖浓度的24孔板小体积液体培养传代结合固体平板培养基分离的方式，以菌体比生长速率作为菌株筛选依据，迭代挑取单菌落传代培养，直至酵母生长受到严重影响则停止环境胁迫，实现稳定传代后筛选出耐渗透压性能提升的酿酒酵母适应性进化突变菌株。最后进行发酵实验，验证赤藓糖醇的合成速率及转化率。获得一种高产赤藓糖醇的菌株，其分类命名为解脂亚罗酵母(yarrowia lipolytica)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24118。其its序列如seq id no.2所示，证明适应性进化未改变菌种种类，适应性进化后的菌株仍然为解脂亚罗酵母。
48.图1a为菌株适应性进化之前在含不同浓度葡萄糖的培养基中的生长情况，表明原始菌株的生长会受到高浓度葡萄糖的显著抑制；图1b为适应性进化的实施过程图示，经反复在高浓度葡萄糖的环境下培养细胞，以多孔板筛选出生长速率提高的菌株。
49.图2为经过不同代次(ad50表示在高浓度葡萄糖环境下培养50代)适应性进化后菌株产赤藓糖醇能力获得提升，表明适应性进化可以有效提升自然筛选菌株的生产性能。
50.实施例3
51.(1)菌种cgmcc 24118产赤藓糖醇培养及条件考察。
52.样品中c-1和c-2为初始条件对照，酵母粉用量10g/l；8-1和8-2，酵母粉用量8g/l；6-1和6-2，酵母粉用量为6g/l；4-1和4-2酵母粉用量为4g/l；mn-1和mn-2是在对照的基础上加入了0.025mm的一水合硫酸锰(几乎与氯化铜等量)；zn-1是在对照的基础上加入了0.025mm的七水合硫酸锌。在摇瓶发酵过程中，可以明显观察到，0～48h，摇瓶中均有较多泡沫，泡沫高度几乎可达摇瓶瓶口。48～72h，4g/l酵母粉用量的摇瓶，泡沫开始逐渐减少，直至微量存在，72h后又开始起泡，但是泡沫较少；6g/l、8g/l酵母粉用量的摇瓶规律与4g/l酵母粉用量的摇瓶一致，但不同阶段随着酵母粉用量增加均有所延长。各样品条件如表1所示；样品8-2发酵液的高效液相色谱结果如图3所示，主要产物为赤藓糖醇，副产物极少。
53.表1
[0054][0055][0056]
结果显示，初始糖浓度控制在280
±
10g/l能够达到较高的糖醇转化率；酵母粉用量为6～8g/l为较适宜的培养基条件，可达到预期发酵水平。
[0057]
(2)高渗透压环境下生长速率
[0058]
如图4所示，在含350g/l葡萄糖的高浓度条件下，原始菌株的最大比生长速率为0.58h-1
，适应性进化后最大比生长速率提升至1.22h-1
。表明适应进化可以显著提升菌株在
高渗透压条件下的生长。
[0059]
(3)不同温度下高渗透压环境下生长速率
[0060]
如图5所示，在含350g/l葡萄糖的高浓度条件下，分别在不同的温度条件下培养菌株。结果显示，适应性进化前后菌株生长的温度适应性无明显变化，生理形状相近。
[0061]
实施例4菌种cgmcc 24118的基因组重测序结果
[0062]
对所获得的适应性进化菌株菌种cgmcc 24118进行全基因组的测序及相对于出发菌株的比较基因组学分析。通过illumina miseq平台测序仪和对适应性进化菌株的基因组dna测序。对测序结果原始图像数据利用软件bcl2fastq(v2.17.1.14)进行图像碱基识别和初步质量分析，得到原始测序数据，其中包含测序序列信息及与其对应的测序质量信息。对低质量数据进行过滤，使用二代测序数据质量统计软件cutadapt(v1.9.1)对测序原始数据去除污染及接头序列后得到的高质量数据质量信息如表2所示。
[0063]
表2
[0064]
长度(nt)读取数目碱基数目q20(％)q30(％)gc(％)n(ppm)149.1924263946361985510398.0594.2946.7210.26
[0065]
q20(％)、q30(％)：分别计算phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比，表明测序结果的可靠性；
[0066]
gc(％)：计算碱基g和c的数量总和占总的碱基数量的百分比；
[0067]
n(ppm)：每百万碱基中n的数量。
[0068]
以适应性进化前的基因组序列为参考基因组，对菌株cgmcc 24118的基因组进行比对，共鉴定出52231个突变，包含43127个单核苷酸突变(single nucleotide polymorphisms,snp)和9104个单核苷酸插入或缺失突变(insertion-deletion，indel)。经过进一步筛选，对有效变异位点进行注释分析，在所有的snp和indel突变中，11687个位于外显子区域，9666个分布于基因间区。基因上游的单核苷酸突变均占有较大比重，这意味着酵母耐高渗透压胁迫的适应性机制很可能与基因表达水平的调控密切相关。
[0069]
将获得的snps和indels突变与go数据库进行了比较分析，以研究适应性进化菌株cgmcc 24118为了高渗透压而在基因功能层面发生的变化。由图6的go富集分析发现，突变基因在代谢过程(metabolic process)、催化活力(catalytic activity)和细胞过程(cellularprocess)中出现富集，这表明上述功能的相关基因通过影响酵母耐受高渗透压的能力促进赤藓糖醇的合成。
[0070]
kegg主要将生物代谢通路划分为以下类别：细胞过程(cellular processes)、环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、新陈代谢(metabolism)、生物体系统(organismal systems)，每一类又被系统分为二级分类，统计二级分类中各生物代谢通路上的基因数目，结果如图7所示。结果表明，除一些编码存在但缺乏体内表达证据的假定蛋白(hypothetical protein)或未知功能的基因外，涉及到的基因功能包括碳水化合物代谢、转录调控、细胞生长、细胞壁合成、氨基酸和其它物质的转运等。这些基因突变导致的途径变化是适应性进化菌株对高渗透压耐受性提升和赤藓糖醇产量提升的分子基础。
[0071]
实施例5分批发酵
[0072]
一种高产赤藓糖醇的菌株用于合成赤藓糖醇的方法，包括如下步骤：
[0073]
(1)菌种活化培养：将1ml解脂亚罗酵母(yarrowia lipolytica)菌种cgmcc no.24118接种至装有100mlypd培养基(包括葡萄糖、蛋白胨和酵母粉，自然ph)的500ml摇瓶中，于30℃恒温培养18～19h。
[0074]
(2)种子培养：将经过活化的种子全部转接到含2l种子培养基(12g/l酵母粉，6g/l柠檬酸铵，1.2g/l磷酸二氢钾，0.6g/l七水合硫酸镁，200g/l葡萄糖；ph为6.0)的5l摇瓶中，30℃，200rpm摇床培养6～8h。
[0075]
(3)分批发酵：30l罐培养基中接种量10％，30℃发酵，通过流加氨水控制初始ph为6.0，发酵前期生长阶段通过流加氨水控制ph为6.0；初始罐压0.08mpa；发酵过程中调节通气量使其控制在0.5vvm；通过do与转速偶联的方式控制发酵过程中do为20～30％；每隔4-6h取样检测od600、ph、残留葡萄糖(dns法)；发酵至残糖耗尽或do开始快速反弹超过70％时停罐，停罐后夹套升温至80℃，维持30min，然后结束发酵；
[0076]
30l罐培养基的配制：称取葡萄糖7.04kg，于7l水内加热溶解，定容至8l，灭菌后待用。称取酵母粉200g，磷酸二氢钾4.48g，七水合硫酸镁8.96g，氯化铜90mg，取适量水溶解后定容至10l，加入适量消泡剂一并于发酵罐中，进行实消，消后体积约12l。火圈接种前加入已灭菌的8l葡萄糖，即30l发酵罐装液量为20l。
[0077]
不同发酵时间下，发酵情况如表3所示，所筛选的菌种经过适应性进化后，可以在100h以内发酵288.9g/l葡萄糖生成152g/l赤藓糖醇。生产水平与现有生产菌种相当，具有实际应用的价值。如图8所示。
[0078]
表3
[0079]
[0080][0081]
实施例6
[0082]
一种高产赤藓糖醇的菌株用于合成赤藓糖醇的方法，包括如下步骤：
[0083]
(1)、(2)、(3)步骤同实施例5；
[0084]
(4)细胞全回用发酵：
[0085]
分批发酵结束后，使用板框过滤机或袋式过滤机回收酵母细胞，或者采用离心机回收发酵液中的细胞。
[0086]
细胞回用发酵方法：配制450g/l的葡萄糖溶液，80℃溶解后加入回收获得的细胞，至细胞浓度56.3(od
600
)，分别补充以下培养基成分至相应的终浓度：酵母粉30g/l，磷酸二氢钾1g/l，七水合硫酸镁1.5g/l，氯化铜25mg/l。设定温度31℃，通风量为1vvm，搅拌转速与溶氧关联，维持溶氧浓度为30％附近，开始发酵，发酵周期70h。
[0087]
不同发酵时间下，发酵情况如表4和图9所示；
▲
为葡萄糖浓度，单位为g/l，
■
为细胞浓度，单位为1，
●
为赤藓糖醇浓度，单位为g/l。结果显示，细胞回用发酵58h后，产物赤藓糖醇的浓度即可达到151.6g/l，而分批发酵达到同样的产物浓度需要90h以上，细胞回用发酵显著缩短了发酵时间，提高了生产效率。
[0088]
表4
[0089]
[0090][0091]
由表4可以看出，细胞回用发酵58h，赤藓糖醇产量达到150.5g/l，接近传统分批发酵98h的产量(见表3)，生产强度由最高1.64提高至2.61g/l/h，显著降低了生产成本。
[0092]
细胞回用发酵第一批后，重复回收细胞，进行第二批细胞回用发酵，如此重复。结果显示，细胞可较稳定地回用八批次，赤藓糖醇产量仍高于100g/l，节约了种子制备和发酵初期的大量人力、物力和时间成本。如图10所示。