同时检测单个免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的分析方法

1.本发明涉及生物质谱分析领域，特别涉及同时检测单个免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的分析方法。


背景技术：

2.免疫细胞可以参与免疫应答及相关的生命活动，免疫细胞包括淋巴细胞、肥大细胞、粒细胞、巨噬细胞等，其中淋巴细胞可以进行抗原识别、产生特异性的免疫应答，是免疫系统的基本成分，在细胞内分布广泛，主要分为t淋巴细胞、b淋巴细胞、k淋巴细胞和nk淋巴细胞四种类型。其中nk细胞数量少，在外周血和脾内脏中占淋巴细胞总数比例低，可非特异性直接杀伤靶向细胞，不需要预先抗原致敏和抗体参与，无mhc限制。其靶向细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞和较大的病原体等。研究免疫细胞的免疫功能，对疾病的诊疗具有重要的生物学意义。
3.以往对免疫细胞的代谢物进行研究往往采用细胞匀浆的方式，将细胞富集出来后破碎，再经过进一步的纯化后，进行常规的质谱分析，无法进行针对单细胞层面的细胞特异性分析，且往往需要细胞的数量较大。对于具有重要生物学和医学意义的人体疾病样本，往往免疫细胞的数量较少，其纯化后的数量无法满足常规色谱质谱分析的进样要求。
4.而对于疾病发生过程中，免疫细胞的功能发挥正常与否，需要针对病灶部位的少量免疫细胞进行分析，目前常用的分析手段如荧光分析，仅能针对单细胞的靶向蛋白进行研究，无法针对非靶向的多数蛋白进行分析，无法在细胞层面高效筛选疾病相关的功能蛋白。而采用扫描电镜和透射电镜等方式，仅能对细胞的形貌进行观察，从细胞形状及亚细胞结构的形变发现一些潜在的疾病相关的现象，难以对其形貌改变的分子机制进行深度的研究。
5.而单细胞代谢质谱分析，可以实现单个细胞水平的代谢物的分析，其代谢物与细胞的生理活动维持、功能行使及形貌的改变均有重要的联系，在单细胞层面进行单免疫细胞的代谢物的分析，有望对疾病的治疗、肿瘤的抑制，重建哺乳细胞的免疫应答等产生重要的指导作用，是对细胞靶向蛋白分析和形貌分析等技术的重要补充。


技术实现要素：

6.为对单个免疫细胞的代谢物进行分析，本发明提供以下技术方案：
7.一方面，本发明提供同时检测单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.步骤(1)，对待测样品进行密度梯度离心，获得包含免疫细胞的细胞悬液；
9.步骤(2)，使用免疫磁珠抗体对细胞悬液进行免疫磁珠筛选获得单一类型免疫细胞的细胞悬液；
10.步骤(3)，将免疫细胞细胞悬液放置于显微镜下，采用取样针进行单细胞取样，取样过程使用持续低负压吸取胞浆，脉冲高负压吸取细胞膜的双段式抽取法，提升同时检测
胞浆和细胞膜的代谢物的成功率；
11.步骤(4)，将取样针放置于离子化装置上，进行单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的离子化；
12.步骤(5)，使用质谱仪进行单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物离子化信息的检测，获得单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的质谱图。
13.在一些实施方案中，所述待测样品选自血液和组织。
14.在一些实施方案中，所述组织选自健康组织和患病组织，所述患病组织例如患癌组织。
15.在一些实施方案中，所述待测样品为组织时，先对组织进行酶解，然后进行密度梯度离心。
16.在一些实施方案中，所述密度梯度离心的介质包括但不限于为蔗糖、多聚蔗糖、氯化铯。
17.在一些实施方案中，所述密度梯度离心的介质选自蔗糖、多聚蔗糖、氯化铯。
18.在一些实施方案中，所述免疫细胞选自淋巴细胞(如nk细胞、t细胞、b细胞)、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞。
19.在一些实施方案中，所述取样针内灌注有电极内液，所述电极内液选自去离子水、蒸馏水、醋酸铵、甲酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、生理盐水、pbs、葡萄糖溶液。
20.在一些实施方案，对免疫细胞的单细胞悬液进行离心后加入裂解液进行细胞胞浆和细胞膜的代谢物的萃取，然后将细胞裂解液灌注至取样针中进行分析。
21.在一些实施方案中，所述裂解液选自水、甲醇和乙腈。
22.在一些实施方案中，所述取样针开口直径为1-2.5微米。
23.在一些实施方案中，所述持续低负压为0.1-30kpa，持续》1s。
24.在一些实施方案中，所述脉冲高负压为31kpa-1000kpa，持续0.01-1s。
25.在一些实施方案中，在将取样针放置于离子化装置上之前，还包括将取样针针尖插入去离子水中，浸入1-5秒钟，洗去针尖表面粘附的单细胞缓冲溶液的步骤。
26.在一些实施方案中，为了防止针尖的溶液蒸发干燥而发生堵塞，取样针应尽快放置于单细胞进样针离子化装置上，优选的放置时间为60秒内。
27.在一些实施方案中，将取样针针尖放置在距离质谱入口2-10毫米的位置进行离子化。
28.在一些实施方案中，质谱仪的进样采集开始早于离子化操作，以保证获得单细胞胞浆和细胞膜的代谢物的信号。
29.在一些实施方案中，所述胞浆和细胞膜的代谢物包括但不限于鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和乳糖神经酰胺。
30.在一些实施方案中，所述胞浆和细胞膜的代谢物选自鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和乳糖神经酰胺。
31.另一方面，本发明提供小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
32.(1)在免疫细胞细胞悬液中加入候选小分子抑制剂；
33.(2)根据上述方法测定候选小分子抑制剂处理免疫细胞后待抑制物的信号强度，分析候选小分子抑制剂对待抑制物的抑制效果，从而筛选小分子抑制剂。
34.在一些实施方案中，所述待抑制物选自鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和乳糖神经酰胺。
35.在一些实施方案中，所述候选小分子抑制剂为磷脂酶c抑制剂d609。
36.本发明还可用于能够增强细胞功能、促进细胞内生物化学反应的药物、酶激动剂和激素等的细胞激动剂的筛选。本发明还可选用不同的表面抗体，实现循环肿瘤细胞、癌细胞等的细胞的胞浆和细胞膜的代谢物的同时质谱分析。
37.在一些实施方案中，所述持续低负压，为持续时间超过(且包含)1秒钟的，气压为0.1-30kpa的负压，用于实现nk细胞内胞浆的抽取。
38.在一些实施方案中，所述持续低负压采用但不限于用1ml的注射器实现。
39.在一些实施方案中，所述持续低负压，为持续时间为0.01-1s秒钟的，气压为31kpa-1000kp a的负压，用于实现nk细胞的细胞膜抽取，采用机械真空泵实现。
40.在一些实施方案中，d609，全称二硫代碳酸o-(八氢-4,7-甲桥-1h-茚-5-基)酯钾盐，是一种选择性的磷脂酰胆碱特异性的磷脂酶c抑制剂；化学式为，c
11h15
kos2；结构式为：
[0041][0042]
有益效果
[0043]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0044]
1.本发明采用免疫分选和单细胞质谱结合的方式，实现了同时检测单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的质谱分析。
[0045]
2.由于脂质存在于细胞膜中，在取样过程中容易产生脱落，本发明使用持续低负压吸取胞浆，脉冲高负压吸取细胞膜的双段式抽取法，显著提升同时检测胞浆和细胞膜的代谢物的成功率。
[0046]
3.本发明提出了免疫磁珠-显微取样-质谱的联合分析方法，通过选用特异性抗体，高选择性地筛选免疫细胞，区分多种免疫细胞类型，从而针对单种免疫细胞进行单细胞质谱分析。
附图说明
[0047]
图1示出了本发明同时检测哺乳动物单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的分析方法流程图。
[0048]
图2示出了联合免疫磁珠-显微取样-质谱法同时检测哺乳动物单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的分析方法的示意图，包括细胞分散；免疫磁珠分选；胞浆和细胞膜的显微取样；对胞浆和细胞膜的代谢物进行离子化；同时获取胞浆和细胞膜的代谢物信号。
[0049]
图3示出了单细胞显微取样的示意图，包括针尖抵达细胞；针尖吸入细胞胞浆和细胞膜的代谢物。
[0050]
图4示出了流式分选nk细胞(cd3-cd16

cd56

)的纯度效果图。
[0051]
图5示出了通过本发明的方法分析获得的在外周血、肝脏和肝癌组织单免疫nk细胞中七种鞘磷脂的质谱图。
[0052]
图6示出了通过本发明的方法分析获得的卵磷脂等脂质在外周血、肝脏和肝癌组织单免疫nk细胞中的质谱图。
[0053]
图7示出了通过本发明的方法分析获得的在外周血、肝脏和肝癌组织单免疫nk细胞中七种鞘磷脂的信号水平统计图。其中横坐标为鞘磷脂的种类，纵坐标为信号强度。
[0054]
图8示出了通过本发明的方法分析获得的在外周血、肝脏和肝癌组织单免疫nk细胞中鞘磷脂合成的上游通路相关的代谢物(丝氨酸/serine，二氢鞘胺醇/sphinganine，二氢神经酰胺/dihydroceramide，鞘胺醇/sphingosine，乙酰胆碱/acetylcholine，胆碱/choline，磷酸胆碱/phosphorylcholine)的信号水平统计图。
[0055]
图9示出了鞘磷脂的合成通路。
[0056]
图10示出了通过本发明的方法分析获得的六种鞘磷脂的二级质谱碎片指认图。
[0057]
图11示出了通过本发明的单免疫细胞质谱和常规液相质谱获得的鞘磷脂的线性范围。
[0058]
图12示出了通过本发明的方法获得的单免疫nk细胞与0、25、100、和400um的d609抑制剂作用后的鞘磷脂质谱图。
具体实施方式
[0059]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0060]
实施例1.联合免疫磁珠-显微取样-质谱法同时检测单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的分析方法
[0061]
本发明中联合免疫磁珠-显微取样-质谱法同时检测单免疫细胞胞浆和细胞膜的代谢物的分析方法包括以下步骤：
[0062]
步骤1，将人的新鲜外周血液用蔗糖作为离心介质进行密度梯度离心法，单核细胞和淋巴细胞密度不同，梯度离心后可以分离，淋巴细胞在上清液中，离心分离，取上清液，上清液中包含淋巴细胞的单细胞悬液；将经过伦理委员会批准的人的新鲜正常组织或癌组织切碎成小碎块，然后放置于pbs或者nk细胞完全培养基(语纯生物(nexell)生命科技有限公司，cc000)内进行0.25％胰酶酶解消化30分钟细胞间质，采用梯度密度离心法获得淋巴细胞的单细胞悬液；
[0063]
步骤2，在从外周血、正常组织和癌组织获得的淋巴细胞悬液中加入免疫磁珠抗体，并使用磁性免疫磁珠分选柱(美天旎，mini-macs)，进行nk细胞的高特异性分选，获得纯度高达90％以上的靶向免疫细胞单细胞悬液(如图4所示)；并将nk细胞重悬于单细胞磷酸缓冲溶液(pbs缓冲液)中；
[0064]
步骤3，将单细胞悬液样本滴涂于培养皿中，进行显微镜下微区定位，硼硅酸盐取样针(sutter b100-50-10)针尖需要放置于显微镜下确认取样针开口尺寸，针尖开口直径为1-2.5微米，在取样针内灌注电极内液(185mm醋酸铵，80mm碳酸氢铵混合液)，将针固定在显微操作平台上并与气泵相连，进行单免疫细胞取样；取样针在吸住nk细胞进行取样的过程中及取样成功后移出单细胞悬液的过程中，保持气泵的持续性低负压加持(0.1-30kpa，》1s)，吸入胞浆，然后脉冲高负压吸取细胞膜(31kpa-1000kpa，0.01-1s)，使nk细胞膜吸在取样针针尖(如图3所示)，将取样针取出，并将针尖插入去离子水中，浸入3秒钟，洗去针尖表
面粘附的单细胞磷酸缓冲溶液(pbs缓冲液)，以降低离子抑制；
[0065]
步骤4，将取样针放置于单nk细胞进样针离子化装置上，采用感应式电极，避免取样针被污染进行单细胞离子化，输出波形调节为正弦波，电压频率调节为1000hz，电压vpp为3kv，针尖距离质谱入口2-10毫米，太近容易碰碎针尖，太远离子化效果不好；
[0066]
步骤5，轨道阱质谱为exactive plus质谱仪(thermofisher scientific，ca，usa)，其采集参数为：质量扫描范围60-900，质量分辨率140000，agc阈值1e6，正离子模式，s-lens射频电平50％，毛细管传输温度275℃，平均谱帧数1帧，采集时间5min，且先于离子化阶段启动，先于离子化阶段启动可以保证单细胞的代谢物离子化信息全部被质谱采集，不会造成信息丢失；
[0067]
步骤6，在对单个nk细胞的分析中，本发明检测到多达42种脂质成分，包括七种鞘磷脂(sm(d34:1)、sm(d36:2)、sm(d38:0)、sm(d36:1)、sm(d36:0)、sm(d32:2)、sm(d41:2)，图5)、磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)和乳糖神经酰胺(la)(图6)。在单个nk细胞中检测到7种不同的sm分子(图5)。对不同来源的nk细胞的单免疫细胞分析显示，与肝nk细胞和外周nk细胞的鞘磷脂含量相比，肿瘤内nk细胞的总体鞘磷脂水平显著降低。具体而言与肝nk细胞和外周nk细胞相比，肿瘤内nk细胞中5种sm分子(sm(d34:1)(d34:1表示存在含34个碳原子和1个不饱和双键的烷基链)、sm(d38:0)(d38:0表示存在含38个碳原子和0个不饱和双键的烷基链)、sm(d36:1)(d36:1表示存在含36个碳原子和1个不饱和双键的烷基链)、sm(d36:0)(d36:0表示存在含36个碳原子和0个不饱和双键的烷基链)和sm(d32:2)(d32:2表示存在含32个碳原子和2个不饱和双键的烷基链)的水平显著降低(与肝nk细胞和外周nk细胞相比均为p《0.05)(图7)。癌症中丝氨酸代谢失调，而丝氨酸是鞘磷脂从头生物合成的前体代谢物。将细胞和培养基分别进行丝氨酸的质谱检测，与单独培养的nk细胞相比，与癌细胞共同培养的nk细胞显示丝氨酸水平显著降低(细胞外和细胞内水平)(图8和图9)，细胞的丝氨酸检测结果为细胞内丝氨酸水平，培养基中丝氨酸检测结果为细胞外水平。此外，鞘磷脂的合成一般通过两个路径进行，如图9所示，其中一条与神经酰胺的合成有关(例如，鞘胺醇、二氢神经酰胺和二氢鞘胺醇)，另一条与卵磷脂的合成有关(例如乙酰胆碱、胆碱和磷酸胆碱)，神经酰胺和卵磷脂最终在酶的作用下，合成了鞘磷脂。对这两条通路的相关合成代谢物进行单细胞检测，发现在与癌细胞共同培养的nk细胞中，与sm生物合成相关的其他代谢物(例如，鞘胺醇、二氢神经酰胺和二鞘胺醇)显著减少(p《0.05，图8和图9)。磷脂酰胆碱(pc)也可用作sm生物合成的前体，肿瘤内nk细胞与肝nk细胞或外周nk细胞中磷脂酰胆碱或相关上游代谢物(例如乙酰胆碱、胆碱和磷酸胆碱)相比水平没有变化(图8和图9)。这些结果共同表明，观察到的肿瘤内nk细胞sm水平的降低似乎是由某些癌细胞相关的丝氨酸代谢失调引起的。
[0068]
实施例2.鞘磷脂的二级质谱定性
[0069]
根据实施实例1的步骤1和步骤2操作，获得单免疫nk细胞悬液，在其中加入100微升纯甲醇进行细胞裂解，获得细胞裂解液，并注入进样器中。
[0070]
步骤3，离子阱质谱为ltq质谱仪(thermofisher scientific，ca，usa)，其采集参数为：质量扫描范围60-900，正离子模式，s-lens射频电平60％，毛细管传输温度275℃，平均谱帧数1帧，碰撞碎裂能量，35ev，母离子选取质量范围1.0da，ltq质谱仪用于串联质谱分析，串联质谱为ltq质谱仪内配备的一种检测方式；
[0071]
步骤4，采用串联质谱(ms/ms)对nk细胞裂解液进行了验证性分析，选取典型的6种鞘磷脂分析物进行分子碎片分析，如图10所示，鞘磷脂sm(d34:1)母离子703.6，其通过二级碎片分析，获得与结构相关的特征子离子[sm(d34:1)-o h]

685.6/[sm(d34:1)-c3h9n h]

644.5/[sm(d34:1)-c
16h30
o h]

463.3，证实样品存在鞘磷脂sm(d34:1)；鞘磷脂sm(d38:0)母离子761.6，其通过二级碎片分析，获得与结构相关的特征子离子[sm(d38:0)-c3h9o h]

702.6/[sm(d38:0)-c5h
14
no4p h]

578.6，证实样品存在鞘磷脂sm(d38:0)；鞘磷脂sm(d36:1)母离子769.6，其通过二级碎片分析，获得与结构相关的特征子离子[sm(d36:1)-c3h9n k]

710.5/[sm(d36:1)-c5h
12
n h]

645.5/[sm(d36:1)-c5h
14
no4p k]

586.5/[sm(d36:1)-c
18h34
o h]

465.3，证实样品存在鞘磷脂sm(d36:1)；鞘磷脂sm(d36:0)母离子771.6，其通过二级碎片分析，获得与结构相关的特征子离子[sm(d36:0)-c3h9n k]

712.6/[sm(d36:0)-c5h
12
n h]

647.6/[sm(d36:0)-c5h
14
no4p k]

588.6，证实样品存在鞘磷脂sm(d36:0)；鞘磷脂sm(d42:2)母离子813.6.6，其通过二级碎片分析，获得与结构相关的特征子离子[sm(d42:2)-c3h9n h]

754.6/[sm(d42:2)-h2o h]

795.7/[sm(d42:2)-c5h
14
no4p h]

630.6，证实样品存在鞘磷脂sm(d42:2)；鞘磷脂sm(d43:2)母离子837.6，其通过二级碎片分析，获得与结构相关的特征子离子[sm(d43:2)-c3h9n k]

778.6/[sm(d43:2)-c5h
13
no4p h]

654.6，证实样品存在鞘磷脂sm(d43:2)。这个结果与在实施实例1的单细胞中检测到的鞘磷脂的信息一致。证实实施例1中测到的鞘磷脂成分是正确的。
[0072]
实施例3.鞘磷脂的单个免疫细胞质谱和液相色谱质谱定量分析
[0073]
步骤1，分别配置0.2、1、5、20、50mg/l的鞘磷脂sm(d34:1)和sm(d36:1)标准溶液；
[0074]
步骤2，将取样针固定于显微操作平台上并按照单细胞取样的方式，吸取鞘磷脂标准溶液；
[0075]
步骤3，取样针放置于单细胞进样针离子化装置上，采用感应式电极进行单细胞离子化，输出波形调节为正弦波，电压频率调节为1000hz，电压vpp为3kv，针尖距离质谱入口2毫米；
[0076]
步骤4，轨道阱质谱为exactive plus质谱仪(thermofisher scientific，ca，usa)，其采集参数为：质量扫描范围60-900，质量分辨率140000，agc阈值1e6，正离子模式，s-lens射频电平50％，毛细管传输温度275℃，平均谱帧数1帧，采集时间5min，且先于离子化阶段启动，先于离子化阶段启动可以保证单细胞的代谢物离子化信息全部被质谱采集，不会造成信息丢失；
[0077]
步骤5，将鞘磷脂溶液灌注进色谱进样瓶中，放置于自动进样器中；
[0078]
步骤6，色谱质谱联用仪tripletof 5600 (ab sciex,america)的参数设置如下，c18分析柱，流动相a包含10mm乙酸铵和0.1％的甲酸水溶液，流动相b包含10mm乙酸铵和0.1％的甲醇：异丙醇：水(60:40:1)溶液，梯度洗脱流程：0-2min，35-80％流动相b；2-7min，80-100％流动相b；7-17min，100％流动相b；色谱质谱联用仪用于作为参考的测试仪器，轨道阱质谱用于检验本发明提出的方法。
[0079]
本方法进行了标准品的基准测试，我们评估了本发明的方法与lc-ms在检测参考标准鞘磷脂(sm(d34:1)和sm(d36:1))方面的分析性能(图11)，浓度范围为0.2至50mg/l。采用单免疫细胞法，sm(d34:1)标准曲线的斜率为2.021
×
10-2
，r2＝0.9925，rsd＝7.6％，sm(d36:1)标准曲线的斜率为2.012
×
10-2
，r2＝0.9977，rsd＝7.3％。采用液相色谱-质谱法，
sm(d34:1)标准曲线的斜率为1.977
×
10-2
，r2＝0.9981，rsd＝4.0％，sm(d36:1)标准曲线的斜率为1.979
×
10-2
，r2＝0.9923，rsd＝3.3％。说明本方法与传统的标准色谱质谱法在对鞘磷脂的标准溶液的分析中获得的线性范围和灵敏度相当。说明本方法与标准色谱质谱法在标准品的分析中可以取得相同的分析效果。而根据实施例1，本发明的优势在于可以实现单个细胞的鞘磷脂分析。而液相色谱仅能实现多细胞裂解液的鞘磷脂分析。
[0080]
实施例4.免疫细胞在鞘磷脂合成酶小分子抑制剂(d609)处理后的脂质信号变化
[0081]
参考实施例1的步骤1和步骤2，将获得的nk细胞放置于含有用于激活nk细胞的5ng/ml的白细胞介素-15(il-15)和100u/ml的白细胞介素-2(il-2)的nk细胞完全培养基中培养，将包含25、100、400μm/l的d609(medchemexpress，83373-60-8)或磷酸缓冲溶液直接添加到细胞上清液中24小时。
[0082]
参考实施例1的步骤3、步骤4和步骤5，获得单免疫细胞的鞘磷脂信号，发现鞘磷脂合成酶小分子抑制剂(d609)降低了外周血nk细胞(正常供体)的sm水平(图12)。图12中加粗的线条表示7种鞘磷脂，纵坐标代表信号强度，细胞在接受d609处理后，鞘磷脂的含量整体呈下降的趋势，且随着药物浓度的提高，鞘磷脂的下降程度增加，d609的浓度达到400μm浓度时，鞘磷脂的信号强度最低。说明d609具有抑制nk细胞鞘磷脂合成的效果。nk细胞鞘磷脂合成酶受阻，会导致细胞的鞘磷脂含量降低。
[0083]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。