N,S-GQDs/CoOOH纳米复合物及其制备方法和应用

n,s-gqds/coooh纳米复合物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于n,s-gqds/coooh荧光探针的构建及其在体外和体内抗坏血酸检测中的应用。


背景技术：

2.维生素c，也被称为抗坏血酸(aa)，是一种抗氧化剂，也是维持机体正常生理功能的重要维生素之一。研究表明，人体内aa的含量与心血管疾病、动脉硬化、尿路结石、坏血病等多种疾病密切相关。
3.目前检测aa的技术和方法有荧光法、高效液相色谱法(hplc)、毛细管电泳法、酶联免疫吸附法（elisa）、化学发光法和电化学分析法等。这些方法中高效液相色谱法虽准确性和选择性良好，但对样品的要求较高，仪器昂贵；毛细血管电泳法材料处理过程复杂、程序繁琐、耗时；elisa仪器设备要求较高以及液体废物难以处理；光纤化学传感需要专业的人员；化学发光和电化学法虽然所用仪器简单、分析时间短，但选择性较差。而荧光分析法是一种简单、快速、灵敏度较高的检测方法。
4.迄今为止，已有有机荧光染料、金属纳米团簇、二维纳米薄片（coooh）和半导体量子点等纳米材料用荧光法检测aa，但有机荧光染料存在光稳定性差、coooh和半导体量子点溶解度低、金属纳米团簇毒性大等缺点限制了它们的应用。因此，研究一种生态友好、生物相容性良好和灵敏度高的荧光新材料检测aa是十分迫切的。石墨烯量子点（gqds）作为一类新型的有前途的荧光材料，结合了石墨烯和量子点的优异性能，在化学传感、生物成像和光电子器件等领域受到广泛关注。如何提高了gqds的量子产率，改善gqds的光学性能，提高检测方法的灵敏性和选择性，拓宽其在生物体中的应用是目前需要进一步解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种n,s-gqds/coooh纳米复合物及其制备方法和应用，所述n,s-gqds/coooh纳米复合物作为荧光探针检测抗坏血酸（aa），进一步提高检测方法的灵敏性和选择性。
6.为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供一种n,s-gqds/coooh纳米复合物，包括n,s掺杂的石墨相氮化碳量子点n,s-gqds和具有荧光猝灭作用的氢氧化氧钴coooh。
7.进一步地，所述n,s-gqds平均粒径为1~5 nm；所述coooh为六边形层状纳米片，尺寸范围为75~85 nm。例如：n,s-gqds的平均粒径为1.0nm、3.0nm、3.5 nm、4.0nm、5.0nm，coooh的尺寸大小为75nm、80 nm、85 nm。
8.根据本发明的另一方面，提供以上所述的n,s-gqds/coooh纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：步骤一，n,s掺杂的石墨相氮化碳量子点的制备：将柠檬酸和l-半胱氨酸混合后加热反应，将得到的液体溶解在超纯水中，透析后的溶液经冷冻干燥得到n,s-gqds固体粉末；步骤二，coooh纳米片的制备：将naoh溶液和cocl2溶液均匀混合，向混合溶液中逐
滴加入naclo溶液，搅拌至溶液中没有棕色物质再生成；将得到的棕色悬浮液超声后，放入离心机中离心，得coooh纳米片，将得到的纳米片用纯净水洗涤2-3次；步骤三，n,s-gqds/coooh 纳米复合物的制备：将步骤二制得的coooh纳米片中加入n,s-gqds溶液混合并用纯净水稀释，将上述混合溶液超声制得n,s-gqds/coooh纳米复合物溶液，得到的纳米复合物溶液经冷冻干燥制备n,s-gqds/coooh纳米复合物固体粉末。
9.进一步地，步骤一中，所述的柠檬酸和l-半胱氨酸反应的质量比为10:3。
10.进一步地，所述的naoh和cocl2的质量比为164:1；所述的超声时间为5-20 min。
11.进一步地，步骤三中，所述的coooh纳米片水溶液的浓度为10-60 μg/ml，例如：coooh纳米片的浓度为10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60 μg/ml；所述的超声时间为5-20 min。
12.根据本发明的另一方面，提供以上所述的n,s-gqds/coooh纳米复合物在检测抗坏血酸含量和生物成像中的应用。
13.基于本发明所述的n,s-gqds/coooh 纳米复合物，本发明提供一种检测抗坏血酸aa含量的方法，包括以下步骤：步骤一：将n,s-gqds/coooh荧光探针固体粉末溶解到缓冲溶液中用作检测液，将其与不同浓度的aa标准溶液混合，测定加入aa前检测液的荧光强度f0以及不同aa浓度下检测体系的荧光强度f，计算相对荧光强度1/(f-f0)，以aa的浓度（1/c）为横坐标，相对荧光强度1/(f-f0)为纵坐标，确定aa浓度和相对荧光恢复强度的关系，绘制标准曲线；步骤二：将检测液和未知浓度的aa待测样品混合，记录荧光强度；步骤三：从标准曲线中得到待测样品中aa的含量。
14.coooh能够通过荧光共振能量转移过程使n,s-gqds的荧光几乎完全猝灭。aa能够将coooh还原为co
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，使n,s-gqds从coooh纳米片上脱落，恢复体系荧光。在aa浓度2.0 μm-82.0 μm范围时，1/c与1/( f-f0)具有良好的线性关系（线性相关系数r2为0.996）且符合lineweaver-burk方程（公式1-2），说明n,s-gqds/coooh纳米复合物对aa具有良好的响应，检测限（lod）为48.3 nm，在11次重复测定n,s-gqds/coooh（0.7 mg/ml）的溶液后得到的相对标准偏差（rsd）为3.20 %，说明该方法具有良好的重现性，该荧光探针具有较高的灵敏度和良好的选择性。
15.本发明所述复合物具有低毒性，良好的光稳定性和生物相容性，可应用于体外和体内aa检测。
16.基于本发明所述的n,s-gqds/coooh纳米复合物，本发明提供一种荧光探针检测细胞内抗坏血酸aa含量的方法，包括如下步骤：步骤一：用培养基将细胞孵育在培养箱中直至细胞达到对数生长期；步骤二：将细胞接种于96孔板中孵育，弃去培养液，用含有不同浓度n,s-gqds/coooh纳米复合物（0-250μg/ml）孵育细胞；步骤三：弃去上清，每孔再加入mtt溶液继续孵育细胞；步骤四：加入二甲基亚砜dmso震荡；用酶标仪记录每个孔的吸光度值，测定 n,s-gqds/coooh纳米复合物的细胞毒性。
17.步骤五：将细胞接种于激光共焦皿上孵育用于细胞成像；步骤六：第一组细胞用培养基孵育作为对照组；第二组细胞用含有n,s-gqds/
coooh纳米复合物培养基孵育；第三组细胞先用含有n,s-gqds/coooh纳米复合物培养基孵育，再向皿中加入aa继续孵育；步骤七：上述三组细胞均需先弃去培养液，用pbs缓冲液冲洗，再用多聚甲醛固定，用激光共聚焦显微镜记录荧光图像。
18.基于本发明所述的n,s-gqds/coooh纳米复合物，本发明提供一种荧光探针检测斑马鱼体内抗坏血酸aa的方法，包括如下步骤：步骤一：孵育斑马鱼的受精卵，用培养液冲洗三次，使用光学显微镜筛选发育良好的胚胎，将其均匀分配到两个6孔板中；步骤二：在第一个6孔板中用含有不同浓度n,s-gqds/coooh纳米复合物孵育斑马鱼胚胎，观察斑马鱼的存活数目，计算存活率；步骤三：第二个6孔板用含有不同浓度n,s-gqds/coooh纳米复合物孵育斑马鱼胚胎，观察斑马鱼的体型，计算畸形率；步骤四：将斑马鱼分成三组，第一组斑马鱼胚胎仅用培养液孵育，作为对照组；第二组斑马鱼胚胎用含有n,s-gqds/coooh纳米复合物的培养液孵育；第三组斑马鱼胚胎先用含有n,s-gqds/coooh纳米复合物的培养液孵育，后用含不同量aa的培养液孵育；用蒸馏水冲洗孔板后使用激光共聚焦记录三组斑马鱼胚胎的荧光图像。
19.本发明涉及石墨相氮化碳量子点复合物荧光探针的构建及其生物应用。首先制备了n,s掺杂的石墨相氮化碳量子点（n,s-gqds），将其和纳米猝灭剂氢氧化氧钴组合，猝灭n,s-gqds的荧光。基于化学氧化还原调节荧光的原理，建立了一种体外和体内检测抗坏血酸（aa）的方法。该探针制备方法简单，光学性质稳定，灵敏度高，生物相容性好，对于研究墨相氮化碳量子点在生物体内的功能具有重要的意义。
附图说明
20.图1 (a)为coooh的tem图；(b) n,s-gqds/coooh纳米复合物的tem图；图2为n,s-gqds/coooh纳米复合物的x-射线衍射谱图；图3为n,s-gqds/coooh纳米复合物的傅里叶红外光谱图；图4 为n,s-gqds/coooh纳米复合物的xps总谱图；图5为不同浓度aa对n,s-gqds/coooh纳米复合物荧光强度的影响；图6 为n,s-gqds/coooh纳米复合物的荧光强度与aa浓度的lineweaver-burk标准曲线；图7为n,s-gqds/coooh纳米复合物检测mcf-7细胞内aa的荧光成像图；(a-c) 为mcf-7细胞未经n,s-gqds/coooh纳米复合物处理的明场、暗场和重叠图；(d-i) 为mcf-7细胞经n,s-gqds/coooh纳米复合物处理的明场、暗场和重叠图；(g-o) 为mcf-7细胞经n,s-gqds/coooh纳米复合物 aa处理的明场、暗场和重叠图（蓝色和绿色通道的激发波长分别为405 nm和488 nm）；图8为n,s-gqds/coooh纳米复合物检测斑马鱼内aa的荧光成像图(a-c)为 斑马鱼胚胎未经n,s-gqds/coooh纳米复合物处理时的明场、暗场和重叠图；(d-i)为 mcf-7细胞经n,s-gqds/coooh纳米复合物处理后的明场、暗场和重叠图；(g-u) 为斑马鱼胚胎经不同浓度n,s-gqds/coooh纳米复合物 aa处理后的明场、暗场和重叠图（蓝色和绿色通道的激发波
长分别为405 nm和488 nm。
具体实施方式
21.下面通过一些实施例对本发明要求保护的技术方案作进一步说明。实施例是用于解释本发明实施方案，并不超出本发明主题的范围，本发明保护范围不受所述实施例的限定。除非另作特殊说明，本发明中所用材料、试剂均可从本领域商业化产品中获得。
22.实施例1：n,s-gqds/coooh纳米复合物的合成n,s-gqds的制备：将1.0 g柠檬酸和0.3 g l-半胱氨酸混合加入25 ml的圆底烧瓶中，在电热套中升温至240℃下加热10 min，反应物液化，颜色由白色变为淡黄色最后变为橙色。将得到的液体溶解在10 ml的超纯水中，用透析膜（1000 da）在超纯水中透析8 h，透析后的溶液经冷冻干燥得到n,s-gqds固体粉末。
23.coooh纳米片的合成：将naoh溶液（200 μl，0.8 m）和cocl2溶液（3 ml，10 mm）均匀混合，向混合溶液中逐滴加入naclo溶液（200 μl，0.2 m），搅拌至溶液中没有棕色物质再生成。将得到的棕色悬浮液超声10 min之后，放入4000r/min的离心机中离心20 min，得coooh纳米片，最后将得到的纳米片用纯净水洗涤2-3次。n,s-gqds的平均粒径为3.5 nm，coooh的尺寸大小为80 nm。
24.n,s-gqds/coooh 纳米复合物的合成：在上述制得的coooh纳米片水溶液（30 μg/ml）中加入100 μl n,s-gqds溶液，用纯净水稀释到15 ml。将混合物超声10 min制得n,s-gqds/coooh纳米复合物溶液。获得的溶液经冷冻干燥，得到n,s-gqds/coooh纳米复合物固体粉末以备后续实验使用。
25.图1（a）为coooh的tem图，（b）为n,s-gqds/coooh 纳米复合物的tem，内插图为n,s-gqds/coooh 纳米复合物tem的放大图。图2是n,s-gqds、coooh和n,s-gqds/coooh纳米复合物的xrd图。n,s-gqds、coooh和n,s-gqds/coooh纳米复合物的ft-ir图和xps图分别如图3和图4。
26.实施例2：n,s-gqds/coooh纳米复合物的合成n,s-gqds和coooh纳米片的合成同实施例1。n,s-gqds的平均粒径为3.5 nm，coooh的尺寸大小为80 nm。
27.n,s-gqds/coooh 纳米复合物的合成：在制得的coooh纳米片水溶液（10 μg/ml）中加入100 μl n,s-gqds溶液，用纯净水稀释到15 ml。将混合物超声10 min制得n,s-gqds/coooh纳米复合物溶液。获得的溶液经冷冻干燥，得到n,s-gqds/coooh纳米复合物固体粉末以备后续实验使用。
28.实施例3：n,s-gqds/coooh纳米复合物的合成n,s-gqds和coooh纳米片的合成同实施例1。n,s-gqds的平均粒径为3.5 nm，coooh的尺寸大小为80 nm。
29.n,s-gqds/coooh 纳米复合物的合成：在制得的coooh纳米片水溶液（60 μg/ml）中加入100 μl n,s-gqds溶液，用纯净水稀释到15 ml。将混合物超声10 min制得n,s-gqds/coooh纳米复合物溶液。获得的溶液经冷冻干燥，得到n,s-gqds/coooh纳米复合物固体粉末以备后续实验使用。
30.实施例4：荧光光谱法检测aa
将实施例1获得的n,s-gqds/coooh纳米复合物用作检测液，将其与不同浓度的aa标准溶液混合，测定加入aa前检测液的荧光强度f0以及不同aa浓度下检测体系的荧光强度f（图5），计算相对荧光强度1/(f-f0)，以aa的浓度（1/c）为横坐标，相对荧光强度1/(f-f0)为纵坐标，确定aa浓度和相对荧光恢复强度的关系（图6）。当aa浓度从2.0 μm增加到82.0 μm时，1/c与1/( f-f0)具有良好的线性关系（线性相关系数r2为0.996），检测限（lod）为48.3 nm，在11次重复测定n,s-gqds/coooh（0.7 mg/ml）的溶液后得到的相对标准偏差（rsd）为3.20 %，说明该方法具有良好的重现性。
31.实施例5：血清中aa的检测将血浆与乙腈以体积比为1:1混合摇匀，静置大约3 min后，将混合液放在4000 r/min的离心机中离心15 min，取上清液并用微孔滤膜过滤（0.45 μm）。血样使用前需用pbs（ph=7.4，10 mm）缓冲溶液稀释100倍。将同等浓度的n,s-gqds/coooh纳米复合物检测液均分成三份，各加入等体积10.0 μm，45.0 μm，80.0 μm的aa标准溶液，记录混合溶液的荧光强度，从标准曲线中得到测得的aa含量，与标准溶液的浓度对比得aa的加标回收率在96.0 %-98.4 %之间（表1），实验结果说明使用该策略检测可以检测血清中的aa。
32.表1 血清中aa的回收率实验结果实施例6：橘子汁中aa的检测：取一定量的橘子汁，将混合物用分液漏斗进行过滤，收集的滤液以4000 rpm/min的转速离心20 min，获得上清液，通过微孔滤膜（0.22 m）过滤。最后，用pbs（ph=7.4, 10mm）缓冲溶液将滤液稀释600倍，测定橘子汁中aa的含量。将同等浓度的n,s-gqds/coooh纳米复合物检测液均分成三份，各加入等体积10.0 μm，45.0 μm，80.0 μm的aa标准溶液，记录混合溶液的荧光强度，从标准曲线中得到测得的aa含量，通过以下公式计算加标回收率。得aa的加标回收率在99.0%-101.5%之间（表2），实验结果说明使用该策略检测可以检测血清中的aa。
33.加标回收率(%) = 式中k0、k1、k2分别代表检测量，加标浓度，实测量表2 橘子汁中aa的回收率实验结果
实施例7：细胞成像的应用：用含有10 %牛胚胎胎血清（fbs）和1%青霉素-链霉素的1640培养基，将mcf-7（人类乳腺癌细胞）细胞孵育在37℃，5% co2的培养箱中。将mcf-7细胞接种于激光共焦皿上孵育用于细胞成像。mcf-7细胞分组和具体孵育步骤如下：第一组mcf-7细胞用1640培养基孵育4 h，将其作为对照组；第二组mcf-7细胞用含有50 μg/ml n,s-gqds/coooh纳米复合物的1640培养基孵育4 h；第三组mcf-7细胞先用含有50 μg/ml n,s-gqds/coooh纳米复合物的1640培养基孵育4 h，再向皿中加入40 μm的aa继续孵育1 h。上述三组细胞均需先弃去培养液，用pbs缓冲液冲洗三次，再用多聚甲醛固定10 min，然后用激光共聚焦显微镜在405 nm和488 nm激发波长下记录荧光图像。成像结果如图7所示，说明了n,s-gqds/coooh纳米复合物可以应用于细胞成像同时可以识别细胞中的aa。
34.实施例8：斑马鱼体内成像的应用：斑马鱼体内成像过程是将胚胎分为三组。一组斑马鱼胚胎仅用e3培养液孵育10 h，作为对照组。第二组斑马鱼胚胎用含有90 μg/ml n,s-gqds/coooh纳米复合物的e3培养液（ph=6.0）孵育10 h；第三组斑马鱼胚胎先用含有90 μg/ml n,s-gqds/coooh纳米复合物的e3培养液孵育，10 h后弃去培养液用含不同量aa（50 μm和100 μm）的e3培养液孵育1 h。在激光共聚焦成像之前二次蒸馏水洗涤三次，用一次性吸管将斑马鱼置于载玻片上，最后用显微镜在405nm和488 nm激发波长下记录三组斑马鱼胚胎的荧光图像。结果如图8所示，说明n,s-gqds/coooh纳米复合物可以识别生物系统中的aa。
35.对比实施例1：单独的coooh纳米薄片没有荧光，不能用于荧光法检测aa。
36.对比实施例2：将n,s-gqds与aa（10-2 m）混合，n,s-gqds的荧光强度基本不变，表明单独的n,s-gqds不能用于aa检测。