一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料及其制备方法和应用

1.本发明属于食品杀菌领域，具体涉及一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.食物和水是至关重要的资源，极易受到大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的污染。食源性致病菌常存在于面包、剩饭、牛奶等营养丰富的食物中，人体误食或感染后通常会引起食物中毒、皮肤溃烂、免疫系统功能下降等危害，严重时甚至导致脑膜发炎和休克。食源性致病菌引起的人类健康问题已成为全球首要的公共卫生问题。
3.芬顿反应是指双氧水(h2o2)在酸性条件下被fe
2
催化产生氧化性极强的羟基自由基(
·
oh)。产生的
·
oh对细菌表现出比双氧水(h2o2)更强的毒性，能够有效地、无选择地杀灭细菌，因此具有广谱抗菌性，并且解决了细菌耐药性的问题。传统的芬顿体系氧化利用率不高、应用的ph范围较窄，为了使h2o2快速而有效的分解，需要开发更强的芬顿催化剂。
4.金属有机框架(mofs)是由金属位点和有机配体形成的一种结晶多孔材料，具有高比表面积，高孔隙率和分散良好的活性中心，其拓扑结构可调。mofs已被广泛研究用作非均相类芬顿催化剂，其活性中心(金属位点)通过化学键得以稳定，该化学键足够牢固以稳定其结构，使材料坚固耐用，同时又足够弱而不妨碍其活性。mofs作为芬顿催化剂可以催化h2o2分解生成
·
oh，因此具有较强抗菌活性，也不存在细菌耐药性的问题，但常规的mofs仍摆脱不了催化效果较差、使用剂量较大等缺陷，无法达到有效的灭菌效果。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于提供一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的制备方法，该方法操作简单，成本低，有望用于工业化生产。
6.本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料，该金属有机框架杀菌材料可以高效的催化h2o2分解生成
·
oh。
7.本发明的再一目的在于提供上述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的应用。所述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料用于抑制食源性致病菌。该金属有机框架杀菌材料在细菌悬浮液中可作为芬顿催化剂催化h2o2分解成具有强杀菌能力的
·
oh，同时超声辅助不仅提高了mofs的比表面积和中孔结构，还增强了催化活性位点间的电荷转移，并结合三金属离子的协同催化效应，极大的增强了金属有机框架的催化活性和抗菌活性，达到高效杀菌的目的。
8.本发明的目的通过以下技术方案实现：
9.一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的制备方法，包括如下步骤：
10.s1：将醋酸镍、醋酸钴、醋酸亚铁与2-氨基对苯二甲酸在溶剂中反应，获得混合液；
11.s2：将混合液进行超声处理，获得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料；
12.所述超声处理的条件：超声功率为400～600w，超声时间为0.5～1.5h，优选为1h；温度为室温。
13.所述溶剂为n,n-二甲基甲酰胺和甲醇中的至少一种。
14.步骤s1中所述醋酸镍、醋酸钴和醋酸亚铁的物质的量之比为1:3:6～6:3:1，优选为1:(0.5～1.5):(0.5～1.5)，更优选为1:1:1。
15.步骤s1中所述2-氨基对苯二甲酸的物质的量与醋酸镍、醋酸钴和醋酸亚铁总的物质的量之比为1:2～2:1，优选为1:1。
16.步骤s1中所述反应的时间为20～40min。反应的温度为室温。
17.步骤s1中所述反应在搅拌的条件下进行，搅拌的转速为200～400rpm。
18.步骤s1的具体步骤：将醋酸镍、醋酸钴和醋酸亚铁溶于溶剂中，得到a液；将2-氨基对苯二甲酸溶于溶剂中，得到b液；然后在搅拌的条件下，将a液与b液在室温下混合反应，获得混合液。
19.所述a液中溶剂与b液中溶剂的体积比为1:1～3:1，更优选的为2:1。
20.a液中醋酸镍、醋酸钴和醋酸亚铁总物质的量与溶剂的体积比为1mmol:(5～15)ml；
21.b液中2-氨基对苯二甲酸物质的量与溶剂的体积比为1mmol：(4～10)ml。
22.步骤s2中超声处理后，将体系进行后续处理。所述后续处理是指离心，洗涤，干燥。所述洗涤是指采用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇分别进行洗涤；所述干燥为真空干燥。
23.所述采用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇分别进行洗涤，洗涤的次数为2～3次。
24.所述真空干燥的温度为55～65℃。
25.所述真空干燥的时间为10～15h。
26.s2中所述金属有机框架杀菌材料为网格状金属有机框架杀菌材料。
27.一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料通过上述制备方法制备得到。所述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料用于制备抗菌制品，特别是抑制食源性致病菌的制品。
28.一种抗菌制品，包括上述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料和h2o2。
29.所述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料和h2o2的质量摩尔比为(95～110)μg：(5～20)μmmol。
30.上述一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料在抑制食源性致病菌中的应用，包括如下步骤：将基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料和h2o2置于含细菌的样品中，进行杀菌处理。
31.所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。
32.所述含细菌的样品中细菌密度为105～108cfu/ml，优选的为106cfu/ml。
33.所述杀菌处理的时间为2～4h。杀菌处理的温度≥室温及其以上。
34.所述金属有机框架的最终浓度为95～105μg/ml，优选为100μg/ml。
35.所述h2o2的最终浓度为5～15mm，优选为10mm。
36.所述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料在抑制食源性致病菌中的应用是指利用基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料和h2o2的杀菌方法。
37.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
38.(1)本发明的基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的制备方法简单，无需复杂的仪器设备，成本低，有望用于工业化生产。
39.(2)本发明采用金属有机框架作为杀菌材料，其可作为芬顿催化剂催化h2o2分解成具有强杀菌能力的
·
oh，从而利用
·
oh对细菌进行灭活，且具有广谱抗菌性，对正常细胞具有较低的毒性，也不会产生抗菌耐药性。另外，基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料有效减少了杀菌材料和h2o2使用剂量，降低了毒副作用，且提高了杀菌材料和h2o2的利用率。
40.(3)相对于现有杀菌技术，本发明的金属有机框架杀菌材料是经过超声辅助制得的网格状二维纳米片材料，能催化h2o2分解成强毒性的
·
oh，同时超声辅助不仅提高了mofs的比表面积和中孔结构，还增强了催化活性位点间的电荷转移，并结合三金属离子的协同催化效应，极大的增强了金属有机框架的催化活性和抗菌活性，达到高效杀菌的目的。
附图说明
41.图1为实施例1所得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的扫描电子显微镜(sem)表征图(放大倍数为20000倍)；
42.图2为实施例1所得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的扫描电子显微镜(sem)表征图(放大倍数为5000倍)；
43.图3为实施例4所得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料ni6co3fe
1-mof的扫描电子显微镜(sem)表征图(放大倍数为20000倍)；
44.图4为实施例4所得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料ni6co3fe
1-mof的扫描电子显微镜(sem)表征图(放大倍数为5000倍)；
45.图5为实施例4中不同浓度的ni1co1fe
1-mof(a)和ni6co3fe
1-mof(b)材料对金黄色葡萄球菌的mic测试结果图，抗菌剂浓度从左到右依次为：6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。
具体实施方式
46.下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例所述的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或可通过现有方法制备得到。
47.实施例1～3中杀菌材料抗菌性能测试步骤：
48.(1)菌种的培养：取少量细菌的菌种在lb固体培养基上划线，然后将固体培养基至于37℃培养箱中培养。从lb固体培养基上挑取单菌落分散到100mllb液体培养基中，将液体培养基移到37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取培养到对数期的细菌悬液，离心获得细菌细胞。然后，用无菌生理盐水(ph7.0的质量浓度为0.9％nacl溶液)洗涤细胞3次，以除去生长培养基残留物，将细胞沉淀物重新分散在一定体积的无菌生理盐水中，并将细菌悬液进行稀释，保存备用；
49.(2)抑菌试验：将等体积的细菌悬液分别用空白对照液、h2o2、未经超声处理的金属有机框架 h2o2、金属有机框架杀菌材料 h2o2处理，置于37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取处理后的菌液100μl，按照平板涂布法接种到lb固体培养基，并将其置于37℃培养箱中培养，然后进行活菌菌落计数，研究其抗菌性能。杀菌率＝(对照组菌落数-实验组
菌落数)/对照组菌落数
×
100％。
50.步骤(1)所述菌种包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。
51.步骤(1)所述lb固体培养基的培养时间为24～48h，优选为36h。
52.步骤(1)所述lb液体培养基的培养时间为3.5～4h。
53.步骤(1)所述细菌悬液的细菌密度为105～108cfu/ml，优选为106cfu/ml。
54.步骤(2)所述细菌悬液的体积为5ml。步骤(2)所述空白对照液为无菌生理盐水。
55.步骤(2)所述未经超声处理的金属有机框架的最终浓度为95～105μg/ml，优选为100μg/ml。
56.步骤(2)所述金属有机框架的最终浓度为95～105μg/ml，优选为100μg/ml。
57.步骤(2)所述h2o2的最终浓度为5～15mm，优选为10mm。
58.步骤(2)所述震荡时间为2～4h，优选为2h。
59.步骤(2)所述lb固体培养基的培养时间为24～48h，优选为36h。
60.实施例1
61.一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料制备方法，其步骤如下：
62.(1)将物质的量之比为1:1:1(总物质的量为1mmol)的醋酸镍、醋酸钴和醋酸亚铁溶解到10mln,n-二甲基甲酰胺中得到a液，将1mmol的2-氨基对苯二甲酸溶解到5mln,n-二甲基甲酰胺中得到b液，然后在磁力搅拌下(转速300rpm)将a液倒入b液中，在室温下混合反应30min；
63.(2)将步骤(1)所述混合液在室温下超声处理1h(超声功率为500w)，处理结束后离心获得产物，并用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇各洗涤2次，然后在60℃下真空干燥12h得到杀菌材料(基于超声辅助的杀菌材料)，将其置于常温密封容器内保存。
64.未经超声处理的金属有机框架：按照步骤(1)相同的方法制备未经超声处理的金属有机框架，其中室温下混合反应时间为1.5h；然后洗涤，干燥，将制得的材料置于常温密封容器内保存。
65.图1为实施例1所得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的扫描电子显微镜(sem)表征图(放大倍数为20000倍)，显示了金属有机框架的形貌。
66.图2为实施例1所得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的扫描电子显微镜(sem)表征图(放大倍数为5000倍)，显示了金属有机框架的形貌。
67.所述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料在抑制食源性致病菌中的应用。
68.抗菌性能测试：
69.(s1)取少量金黄色葡萄球菌(atcc6538，菌种购自广东食品微生物安全工程技术研究中心开发中心)的菌种在lb固体培养基上划线，然后将固体培养基至于37℃培养箱中培养36h。从lb固体培养基上挑取单菌落分散到100mllb液体培养基中，将液体培养基移到37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取培养4.5h后的细菌悬液，离心获得细菌细胞。然后，用无菌生理盐水(ph7.0的质量浓度为0.9％nacl溶液)洗涤细胞3次，以除去生长培养基残留物，将细胞沉淀物重新分散在一定体积的无菌生理盐水中，并将细菌悬液的细菌密度稀释至106cfu/ml，保存备用；
70.(s2)将5ml步骤(s1)中的金黄色葡萄球菌悬液分别用无菌生理盐水(质量浓度为0.9％nacl溶液，50μl)(对照组、组别1)、h2o2(10mm)(组别2)、未经超声处理的金属有机框架
(100μg/ml) h2o2(10mm)(组别3)、金属有机框架杀菌材料(100μg/ml) h2o2(10mm)(组别4)处理，置于37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取处理2h后的菌液100μl，按照平板涂布法接种到lb固体培养基，并将其置于37℃培养箱中培养36h，然后进行活菌菌落计数，按以下公式计算杀菌率：
71.杀菌率＝(对照组菌落数-实验组菌落数)/对照组菌落数
×
100％
72.计算得到组别2、组别3和组别4的杀菌率分别为1.97％、85.12％和99.54％，表明单独10mm的h2o2对金黄色葡萄球菌几乎没有杀菌效果；100μg/ml的未经超声处理的金属有机框架和10mm的h2o2能杀灭大部分金黄色葡萄球菌；而100μg/ml的金属有机框架杀菌材料和10mm的h2o2的协同作用几乎可以完全杀灭金黄色葡萄球菌。
73.实施例2
74.一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的制备方法，其步骤如下：
75.(1)将物质的量之比为1:1:1(总物质的量为1mmol)的醋酸镍、醋酸钴和醋酸亚铁溶解到10mln,n-二甲基甲酰胺中得到a液，将1mmol的2-氨基对苯二甲酸溶解到5mln,n-二甲基甲酰胺中得到b液，然后在磁力搅拌下(转速300rpm)将a液倒入b液中，在室温下混合反应30min；
76.(2)将步骤(1)所述混合液在室温下超声处理1h，处理结束后离心获得产物，并用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇各洗涤2次，然后在60℃下真空干燥12h得到杀菌材料，将其置于常温密封容器内保存。
77.未经超声处理的金属有机框架：按照步骤(1)相同的方法制备未经超声处理的金属有机框架，其中室温下混合反应时间为1.5h；然后洗涤，干燥，将制得的材料置于常温密封容器内保存。
78.所述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料在抑制食源性致病菌中的应用。
79.抗菌性能测试：
80.(s1)取少量沙门氏菌(atcc14028，菌种购自广东食品微生物安全工程技术研究中心开发中心)的菌种在lb固体培养基上划线，然后将固体培养基至于37℃培养箱中培养36h。从lb固体培养基上挑取单菌落分散到100mllb液体培养基中，将液体培养基移到37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取培养3.5h后的细菌悬液，离心获得细菌细胞。然后，用无菌生理盐水(ph7.0的质量浓度为0.9％nacl溶液)洗涤细胞3次，以除去生长培养基残留物，将细胞沉淀物重新分散在一定体积的无菌生理盐水中，并将细菌悬液的细菌密度稀释至106cfu/ml，保存备用；
81.(s2)将5ml步骤(s1)中的沙门氏菌悬液分别用无菌生理盐水(质量浓度为0.9％nacl溶液，50μl)(对照组、组别1)、h2o2(10mm)(组别2)、未经超声处理的金属有机框架(100μg/ml) h2o2(10mm)(组别3)、金属有机框架杀菌材料(100μg/ml) h2o2(10mm)(组别4)处理，置于37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取处理2h后的菌液100μl，按照平板涂布法接种到lb固体培养基，并将其置于37℃培养箱中培养36h，然后进行活菌菌落计数，按以下公式计算杀菌率：
82.杀菌率＝(对照组菌落数-实验组菌落数)/对照组菌落数
×
100％
83.计算得到组别2、组别3和组别4的杀菌率分别为1.77％、74.28％和98.23％，表明10mm的h2o2对沙门氏菌几乎没有杀菌效果；100μg/ml的未经超声处理的金属有机框架和
10mm的h2o2能杀灭大部分沙门氏菌；而100μg/ml的金属有机框架杀菌材料和10mm的h2o2的协同作用几乎可以完全杀灭沙门氏菌。
84.实施例3
85.一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的制备：同实施例1。
86.未经超声处理的金属有机框架：同实施例1。
87.所述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料在抑制食源性致病菌中的应用。
88.抗菌性能测试：
89.(s1)取少量大肠杆菌(atcc700728，菌种购自广东食品微生物安全工程技术研究中心开发中心)的菌种在lb固体培养基上划线，然后将固体培养基至于37℃培养箱中培养36h。从lb固体培养基上挑取单菌落分散到100mllb液体培养基中，将液体培养基移到37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取培养3.5h后的细菌悬液，离心获得细菌细胞。然后，用无菌生理盐水(ph7.0的质量浓度为0.9％nacl溶液)洗涤细胞3次，以除去生长培养基残留物，将细胞沉淀物重新分散在一定体积的无菌生理盐水中，并将细菌悬液的细菌密度稀释至106cfu/ml，保存备用；
90.(s2)将5ml步骤(s1)中的大肠杆菌悬液分别用无菌生理盐水(质量浓度为0.9％nacl溶液，50μl)(对照组、组别1)、h2o2(10mm)(组别2)、未经超声处理的金属有机框架(100μg/ml) h2o2(10mm)(组别3)、金属有机框架杀菌材料(100μg/ml) h2o2(10mm)(组别4)处理，置于37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取处理2h后的菌液100μl，按照平板涂布法接种到lb固体培养基，并将其置于37℃培养箱中培养36h，然后进行活菌菌落计数，按以下公式计算杀菌率：
91.杀菌率＝(对照组菌落数-实验组菌落数)/对照组菌落数
×
100％
92.计算得到组别2、组别3和组别4的杀菌率分别为1.88％、50.94％和93.33％，表明10mm的h2o2对大肠杆菌几乎没有杀菌效果；100μg/ml的未经超声处理的金属有机框架和10mm的h2o2能杀灭部分大肠杆菌；而100μg/ml的金属有机框架杀菌材料和10mm的h2o2的协同作用可以杀灭绝大部分大肠杆菌。
93.实施例4
94.一种基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料的制备方法，其步骤如下：
95.(1)将物质的量之比为6:3:1(总物质的量为1mmol)的醋酸镍、醋酸钴和醋酸亚铁溶解到10mln,n-二甲基甲酰胺中得到a液，将1mmol的2-氨基对苯二甲酸溶解到5mln,n-二甲基甲酰胺中得到b液，然后在磁力搅拌下(转速300rpm)将a液倒入b液中，在室温下混合反应30min；
96.(2)将物质的量之比为1:1:1(总物质的量为1mmol)的醋酸镍、醋酸钴和醋酸亚铁溶解到10mln,n-二甲基甲酰胺中得到a液，将1mmol的2-氨基对苯二甲酸溶解到5mln,n-二甲基甲酰胺中得到b液，然后在磁力搅拌下(转速300rpm)将a液倒入b液中，在室温下混合反应30min；
97.(3)将步骤(1)、(2)所述混合液分别在室温下超声处理1h(超声功率为500w)，处理结束后离心获得产物，并用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇各洗涤2次，然后在60℃下真空干燥12h分别得到杀菌材料ni6co3fe
1-mof和ni1co1fe
1-mof，将其置于常温密封容器内保存。
98.图3为实施例4所得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料ni6co3fe
1-mof的扫描
电子显微镜(sem)表征图(放大倍数为20000倍)，显示了金属有机框架的形貌。
99.图4为实施例4所得基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料ni6co3fe
1-mof的扫描电子显微镜(sem)表征图(放大倍数为5000倍)，显示了金属有机框架的形貌。
100.所述基于超声辅助的金属有机框架杀菌材料在抑制食源性致病菌中的应用。
101.抗菌性能测试：
102.(s1)取少量金黄色葡萄球菌(atcc6538，菌种购自广东食品微生物安全工程技术研究中心开发中心)的菌种在lb固体培养基上划线，然后将固体培养基至于37℃培养箱中培养36h。从lb固体培养基上挑取单菌落分散到100mllb液体培养基中，将液体培养基移到37℃培养箱中在摇床上以150rpm的速度震荡，取培养4.5h后的细菌悬液，离心获得细菌细胞。然后，用无菌生理盐水(ph7.0的质量浓度为0.9％nacl溶液)洗涤细胞3次，以除去生长培养基残留物，将细胞沉淀物重新分散在一定体积的无菌生理盐水中，并将细菌悬液的细菌密度稀释至108cfu/ml，保存备用；
103.(s2)分别取杀菌材料ni6co3fe
1-mof和ni1co1fe
1-mof配置成1mg/ml的无菌水溶液，在超声下分散均匀后，分别将悬浮液稀释成一系列浓度梯度的受试液，浓度分别为800、600、400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/ml。
104.(s3)分别取2.5ml步骤(s2)中不同浓度的受试液和2.5ml双倍lb液体培养基在试管中混合均匀。然后取100μl步骤(s1)中制备的菌悬液(108cfu/ml)，接种于含有不同浓度的mofs材料和双倍lb液体培养基的试管中，作为实验组。另取100μl步骤(s1)中制备的菌悬液，接种于不含mofs材料的5ml lb液体培养基中，作为阳性对照组。只含有5ml lb液体培养基的试管作为阴性对照组。将受试试管放入恒温摇床中(速度为150rmp/min)，在37℃下培养过夜，观察实验结果，以测定所制备的ni6co3fe
1-mof和ni1co1fe
1-mof的最小抑菌浓度(mic)。
105.mic是指抑制细菌生长所需药物的最低浓度，在试验时可将肉眼未见细菌生长的最低药物浓度视为mic。
106.图5为实施例4中不同浓度的ni1co1fe
1-mof(a)和ni6co3fe
1-mof(b)材料对金黄色葡萄球菌的mic测试结果图，抗菌剂浓度从左到右依次为：6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。
107.由图5可知，无抗菌效果的试管中金黄色葡萄球菌大量生长繁殖，最终导致培养液浑浊。而当试管中营养液保持澄清透明时，则认为金黄色葡萄球菌的生长受到了抑制，开始出现澄清透明的试管所对应的抗菌剂浓度即为mic，因此，ni1co1fe
1-mof的mic是200μg/ml，ni6co3fe
1-mof的mic是300μg/ml。表明ni1co1fe
1-mof比ni6co3fe
1-mof具有更好的抗菌性能。
108.不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。