一种检测SARS-CoV-2S蛋白的纳米抗体光电化学免疫传感器的构建方法和用途

一种检测sars-cov-2 s蛋白的纳米抗体光电化学免疫传感器的构建方法和用途
技术领域
1.本发明属于光电化学以及分析检测技术领域，涉及一种检测sars-cov-2 s蛋白的纳米抗体光电化学免疫传感器的构建方法和用途。


背景技术：

2.新型冠状病毒即sars-cov-2病毒，是一种与sars-cov-2病毒具有相似遗传性及相似性的病毒，故将其规定为严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(a.radbruch,h.d.chang. nature doi:10.1038/d41586-021-01557-z)。鉴于s蛋白是sars-cov-2病毒特异性识别位点，因此，迫切需要开发一种分析技术实现对sars-cov-2病毒s蛋白的快速、高灵敏和高特异性的筛查。
3.光电化学免疫传感器是一种利用抗原和抗体之间的特异性反应进行定量或定性检测特定目标物的浓度，具有响应速度快、灵敏度高、特异性强、背景电流低等优势，已经生物分析、临床医学、食品安全和环境监测领域受到广泛关注(g.chen,y.qin,l.jiao,et al.anal.chem. 2021,93,6881-6888)。
4.至今为止，构建光电化学免疫传感器检测sars-cov-2病毒s蛋白的报道鲜有可见。与传统抗体相比，纳米抗体，即重链抗体的可变结构域，具有高特异性、良好的溶解性、热稳定性以及化学稳定性(w.j.wei,z.t.rosenkrans,j.j.liu,et al.chem.rev.2020,120, 3787-3851)。因此，本发明利用光电化学免疫传感器与纳米抗体协同作用，构建纳米抗体基光电化学免疫传感器以实现对sars-cov-2病毒s蛋白的高特异性和高灵敏度检测。


技术实现要素：

5.本发明旨在利用au纳米颗粒@tio2纳米复合材料对可见光的较大吸收和快速响应等性质，对检测系统起到一个信号放大的作用。引入对sars-cov-2 s蛋白特异性识别的纳米抗体，基于空间位阻效应机制，构建纳米抗体基光电化学免疫传感器，实现对sars-cov-2病毒s蛋白的快速、高灵敏度、高稳定性检测的目的。
6.本发明是通过一下技术手段实现上述技术目的。
7.一种检测sars-cov-2病毒s蛋白纳米抗体基光电化学免疫传感器的构建方法，按照下述步骤进行：
8.(1)制备au@tio2纳米复合材料：
9.首先，将一定量的浓氨水溶液添加至乙醇和去离子水的混合溶液中，并逐滴添加钛酸四丁酯，继续搅拌至混合均匀，进行恒温反应，反应结束后，将溶液进行离心、去离子水和无水乙醇洗涤数次，干燥后的样品进行空气煅烧，记为tio2材料。
10.然后，称取一定量的tio2粉末溶解于无水乙醇中，随后，加入氯金酸溶液和二水柠檬酸三钠溶液，并在室温下保持搅拌一段时间。最后的样品经过离心、去离子水和无水乙醇洗涤，真空干燥，记为au@tio2纳米复合材料。
11.所述的浓氨水溶液和钛酸四丁酯的用量比为0.5～2ml：0.4～2ml；所述乙醇和去离子水的混合溶液中，乙醇和去离子水的体积比例为3：1～6：1。
12.所述恒温反应的温度为30～60℃，时间为12h；空气煅烧反应的温度为400～600℃，时间为2h。
13.所述的tio2粉末、氯金酸溶液和二水柠檬酸三钠溶液的用量比例为0.01～0.05g：0.24μl： 1～3ml，其中，氯金酸溶液的浓度为5mg/ml，二水柠檬酸三钠溶液的浓度为0.01～1mg/ml。
14.所述的真空干燥的温度为60℃，干燥时间为12h。
15.(2)au@tio2/ito电极的制备：
16.将一定量的au@tio2纳米复合材料分散于去离子水中，超声分散均匀，得到稳定且均匀的悬浊液；然后将上述悬浊液滴涂于ito导电玻璃表面上，红外灯下干燥后，pbs溶液冲洗并室温晾干，即得到au@tio2/ito电极。
17.所述的悬浊液用量为50μl，其中，悬浊液为浓度0.2～1.4mg/ml，pbs溶液浓度为6.7 mmol/l。
18.(3)nb/au@tio2/ito电极的制备：
19.将一定量的sars-cov-2病毒s蛋白纳米抗体(nb)滴涂于步骤(2)制备的au@tio2/ito 电极表面上，室温孵育一定时间后，pbs冲洗并室温晾干，得到纳米抗体基光电化学免疫传感器，即nb/au@tio2/ito电极。
20.所述sars-cov-2病毒s蛋白纳米抗体的理论分子量为15.33kda，浓度为0.015～2.03 mg/ml，用量为10μl，孵育时间为12～24h。
21.(4)bsa/nb/au@tio2/ito电极的制备：
22.将步骤(3)制备的nb/au@tio2/ito电极浸润于bsa溶液中，反应一段时间，pbs冲洗并室温晾干，得到bsa/nb/au@tio2/ito电极，即为检测sars-cov-2病毒s蛋白的纳米抗体基光电化学免疫传感器。
23.所述的bsa溶液质量分数为1～10wt％，用量为10μl，反应时间为10～50min。
24.将本发明制得的纳米抗体基光电化学免疫传感器用于检测sars-cov-2病毒s蛋白的用途，具体步骤如下：
25.步骤1、标准曲线的测定：
26.取一系列不同浓度的sars-cov-2病毒s蛋白(sp)滴涂于bsa/nb/au@tio2/ito电极表面上，孵育一定时间后，室温自然干燥，pbs冲洗后，再室温晾干，得到的电极为 sp/bsa/nb/au@tio2/ito；
27.将制备的sp/bsa/nb/au@tio2/ito电极作为工作电极，ag/agcl作为参比电极，pt作为对电极，在含有一定浓度的抗坏血酸的pbs溶液作为电解质，在零伏偏压下测得其光电流响应值，得到一系列的浓度-光电流对应关系，进而得到s蛋白的标准曲线；
28.步骤2、取一定量待测液滴涂于bsa/nb/au@tio2/ito电极表面上，室温自然干燥，pbs 冲洗，再室温晾干，所制得的电极记作sp/bsa/nb/au@tio2/ito；
29.将制备sp/bsa/nb/au@tio2/ito电极作为工作电极，ag/agcl作为参比电极，pt作为对电极，在含有一定浓度的抗坏血酸的pbs溶液作为电解质，在零伏偏压下测得其光电流响应值，将光电流值带入标准曲线换算可得pbs溶液中s蛋白的浓度。
溶解于30ml的无水乙醇中，将配置好的氯金酸(浓度为5mg/ml，含量为0.24μl)和二水柠檬酸三钠溶液(浓度为0.01mg/ml，含量为2ml)添加至上述混合溶液中，并在室温下搅拌30min，最后的样品经过离心、无水乙醇和去离子水洗涤，于60℃真空烘箱中干燥12h，收集的样品au@tio2纳米复合材料。
48.(3)纳米抗体基光电化学免疫传感器的制备：首先是ito导电玻璃预处理过程，将ito 导电玻璃分别在去离子水、乙醇中依次超声清洗半小时后，用去离子水多次冲洗。然后将导电玻璃放入0.1mol/l naoh溶液中，将其煮沸，并保持30min，用去离子水清洗并吹干待用。配置1mg/ml au@tio2的水溶液，将其放入超声机中进行超声分散，得到稳定且均匀的悬浊液；然后，移取50μl悬浊液滴涂于预处理的ito导电玻璃上，在红外灯下干燥2小时，pbs 溶液冲洗并室温晾干，所制得的修饰电极记作au@tio2/ito。接下来，用移液枪移取10μlsars-cov-2的纳米抗体(浓度为2.03μg/ml)滴涂于au@tio2/ito电极表面，室温孵育18 h后，pbs冲洗并室温晾干，得到纳米抗体基光电化学免疫传感器，即nb/au@tio2/ito电极。最后将质量分数为5wt％的bsa溶液(10μl)浸润滴加至nb/au@tio2/ito电极，保持浸渍30min，pbs冲洗并室温晾干，得到bsa/nb/au@tio2/ito电极。
49.(4)目标分析物s蛋白的配制：分别配置15fg/ml、35fg/ml、75fg/ml、0.15pg/ml、 0.35pg/ml、0.75pg/ml、1.5pg/ml、4.5pg/ml、7.5pg/ml、15pg/ml、75pg/ml、0.15ng/ml、 0.75ng/ml、1.5ng/ml、7.5ng/ml、15ng/ml等浓度，有待检测。
50.(5)光电化学检测方法和条件：电化学实验使用chi660e电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，利用传统的三电极体系：修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和 ag/agcl电极为参比电极。激发光源为300w氙灯(pls-sxe300，北京泊菲莱科技有限公司)。电化学实验均在室温、含有0.1mol/l抗坏血酸的pbs溶液(6.7mmol/l,ph＝7.4)，不施加任何偏压。eis实验在含有5mmol/l fe(cn)
63-/4-和0.1mol/l kcl的磷酸盐缓冲溶液(通过配置 0.1mol/l的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠互调，使ph值为7.0制得，其浓度为0.1mol/l)中进行，频率范围为0.01hz～10khz，初始电位为0.24v，交流振幅为5mv。
51.图1为au@tio2纳米复合材料的x射线衍射(xrd)图。由图可知，au@tio2纳米复合材料的衍射峰与tio2的xrd谱图一致，同时可以发现au的衍射峰，证明au@tio2纳米复合材料的成功制备。
52.图2为au@tio2纳米复合材料的扫描(sem)和高倍透射电镜(hrtem)图，其中a 为sem，b为hrtem图。从图2a中可以发现一些堆叠的纳米颗粒和球状，同时纳米颗粒生长在球状体表面；从图2b通过晶格间距可以发现au纳米颗粒成功生长至tio2球体表面。
53.图3为au@tio2纳米复合材料的固体紫外漫反射(drs)图。当引入au纳米颗粒后，纳米复合材料在可见光和紫外光的吸收明显增强，特别是在可见光区域，同时au在550nm 波长处存在宽而强的吸收峰，说明au纳米颗粒的表面等离子共振效应促进了tio2对可见光的利用率，有利于产生更多的光生电子-空穴对，使其具有较好的光电性能。
54.图4为au@tio2/ito的电化学阻抗(eis)图，其中a为tio2/ito，b为au@tio2/ito。本发明所制备的材料的阻值通过对工作电极进行交流阻抗来检测，进一步研究该复合材料转移电子的能力，半径越小，说明其转移电子的能力越强，从图4中可以看出，au@tio2/ito 的电子转移速度比tio2/ito快，说明au的存在促进了光生电荷的高效传输，使其复合材料表现出优异的光电性能。
55.图5为au@tio2/ito的光电流响应图，其中a为tio2/ito，b为au@tio2/ito，c为 nb/au@tio2/ito，d为bsanb/au@tio2/ito，e为sp/bsanb/au@tio2/ito。光照射下，不同材料制备的电极对光响应不同，产生的光电流强度也不同。因此可以根据不同工作电极产生不同强度的光电流来说明不同材料对光的不同响应，光电流越强说明工作电极在光照下光生电子与空穴的分离效率较高。从图5中可以看出，本发明所制备的复合材料表现出相比于tio2较高的光电流值，这说明引入au纳米颗粒后，抑制了tio2体相和表面光生载流子的复合，促进了光生电子与空穴的分离/转移，使复合材料具有更好的光电性能，这个结果与eis 图结果吻合。分别修饰纳米抗体、bsa、s蛋白以后，电极的光电流呈现降低趋势，说明在电极表面存在空间位阻，加速了光生载流子的复合，这些结果说明成功构建了光电化学免疫传感器，并有望实现高效检测sars-cov-2病毒s蛋白。
56.图6为nb/au@tio2/ito检测s蛋白的光电流响应图，其中a为检测不同浓度为s蛋白的光电流图，s蛋白浓度分别为15fg/ml、35fg/ml、75fg/ml、0.15pg/ml、0.35pg/ml、0.75 pg/ml、1.5pg/ml、4.5pg/ml、7.5pg/ml、15pg/ml、75pg/ml、0.15ng/ml、0.75ng/ml、 1.5ng/ml、7.5ng/ml、15ng/ml，b为s蛋白浓度-光电流的线性关系图。从图6可以看出，随着s蛋白浓度的增加，传感器的光电流信号逐渐降低且呈现一定的线性关系，线性范围为 15fg/ml～15ng/ml，线性方程是i＝
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0.482lgc 2.824(r2＝0.995,c:15fg/ml～15ng/ml)，检出限低至5fg/ml。