一种由肉苁蓉萃取物中富集及分离苯乙醇苷类化合物的方法与流程

1.本发明涉及中药肉苁蓉(herba cistanche)的萃取工艺，尤其是涉及由肉苁蓉萃取物中富集及分离苯乙醇苷类化合物的工艺方法，包括由肉苁蓉萃取物中富集並分离出松果菊苷(echinacoside)、类叶升麻苷(acteoside)及异类叶升麻苷(isoacteoside)等苯乙醇苷类化合物。


背景技术：

2.中药肉苁蓉(herba cistanche)取自列当科(orobanchaceae)肉苁蓉属植物的带鳞叶肉质茎，在《神农本草经》中被列为上品，为传统常用补益中药材，有“沙漠人参”的美誉，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，主治男子阳痿、女子不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等病症。
3.管花肉苁蓉(cistanche tubulosa)是肉苁蓉属多年生寄生草本植物的一种，主产于中国西北各省的沙漠、荒漠等干燥地带，依赖吸取寄主植物红柳的养分维生，因此又名为南疆大芸、红柳大芸，属于罕见而贵重的药材。管花肉苁蓉用于提高肾功能、增强记忆力、调节免疫功能、抗老年痴呆、抗衰老、抗疲劳等多方面的功效，已经于2005年被列入《中国药典》中。
4.从上世纪的八十年代初，日本学者开始系统的研究肉苁蓉属植物的化学成分和药理活性，发现苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉属植物的主要活性成分，具有抗氧化、促进物质代谢、改善学习记忆、增强性功能等作用，并对多种苯乙醇苷类化合物单体进行了深入的研究(sato t,et al.yakugaku zasshi,1985,105(12):1131)，关于肉苁蓉的功效研究还有大量文献报导(jimenez c,et al.nat prod rep,1994,11(6):591-606；cometa f,et al.fitoterapia,1993,64(3):195-217；deng min,et al.pharmacoe sin,2004,25(10):1276-1284)，《中国药典2010》也将苯乙醇苷类化合物中的松果菊苷(echinacoside)及毛蕊花糖苷(acteoside，即类叶升麻苷)作为评价肉苁蓉质量的指标成分。
5.因此，开发一种由肉苁蓉中富集及分离苯乙醇苷类化合物的工艺，对于充分利用肉苁蓉资源、控制及改善萃取物制剂质量具有至关重要的意义。
6.大孔吸附树脂分离纯化技术目前广泛应用在分离天然产物有效成分，可用于纯化苷类、黄酮类等化合物，它与一般色谱分离方式不同，特别适合应用于工业化大规模生产流程，其优势在于吸附容量大、再生简单、效果可靠等，是目前天然产物分离纯化领域中最有效益值的方法之一。
7.本发明人经过不断努力试验，最终研究出一种由肉苁蓉萃取物中富集及分离苯乙醇苷类化合物的工艺，利用疏水性大孔吸附树脂富集肉苁蓉萃取物的苯乙醇苷类化合物，再以梯度极性洗脱剂洗脱，将松果菊苷(echinacoside)、类叶升麻苷(acteoside)及异类叶升麻苷(isoacteoside)等肉苁蓉的关键药理活性成分分离。洗脱液可分别干燥，得到高纯度的松果菊苷、类叶升麻苷及异类叶升麻苷制剂；也可依需求将洗脱液直接合并或调整比例后合并干燥，得到质量稳定可控的肉苁蓉萃取物制剂。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种由肉苁蓉萃取物中富集及分离苯乙醇苷类化合物的方法。所述方法包含如下步骤：
9.(a)取由肉苁蓉制得的一粗萃液，通过一富集管柱，使所述粗萃液中的苯乙醇苷类化合物吸附于所述富集管柱内填装的疏水性大孔吸附树脂；
10.(b)以第一洗脱剂洗脱，得到含有松果菊苷的第一洗脱液；
11.(c)以第二洗脱剂洗脱，得到含有类叶升麻苷的第二洗脱液；以及
12.(d)以第三洗脱剂洗脱，得到含有异类叶升麻苷的第三洗脱液；
13.其中，所述第二洗脱剂的极性小于或等于所述第一洗脱剂，所述第三洗脱剂的极性小于或等于所述第二洗脱剂。
14.所述方法在步骤(d)后可进一步包含：
15.(e)以一第四洗脱剂洗脱，得一第四洗脱液；
16.其中，所述第四洗脱剂的极性小于或等于所述第三洗脱剂。
17.所述方法在步骤(a)前可进一步包含：
18.(f)以一第五洗脱剂洗脱，得一第五洗脱液；
19.其中，所述第五洗脱剂的极性大于或等于所述第一洗脱剂。
20.所述粗萃液是以包含如下步骤的方法制得：
21.(i)以一第一极性溶剂萃取肉苁蓉的肉质茎，得到一初提液；
22.(ii)将所述初提液通过一纯化管柱，使所述初提液中的苯乙醇苷类化合物吸附于所述纯化管柱；
23.(iii)以第二极性溶剂洗脱，去除游离的杂质；以及
24.(vi)以第三极性溶剂洗脱，得到含有苯乙醇苷类化合物的所述粗萃液；
25.其中，所述第三极性溶剂的极性小于所述第二极性溶剂。
26.本发明的另一目的，在于提供一种包含高浓度、高纯度的个别苯乙醇苷类化合物的制剂：将所述第一洗脱液干燥制得的一第一制剂包含55wt％～90wt％的松果菊苷；将所述第二洗脱液干燥制得的一第二制剂包含30wt％～75wt％的类叶升麻苷：将所述第三洗脱液干燥制得的一第三制剂包含20wt％～65wt％的异类叶升麻苷。
27.本发明的又一目的，在于提供一种包含高浓度混合苯乙醇苷类化合物的肉苁容萃取物制剂：将所述第一洗脱液、所述第二洗脱液、所述第三洗脱液合并后干燥制得的一第四制剂包含20wt％～75wt％的松果菊苷、3wt％～55wt％的类叶升麻苷以及4wt％～25wt％的异类叶升麻苷。
附图说明
28.图1是实施例(1-2)中管花肉苁蓉粗萃液干燥产物的uplc色谱图；
29.图2a、2b、2c是实施例2中第一制剂、第二制剂、第三制剂的uplc色谱图。
具体实施方式
30.下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方
法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售产品。
31.本说明书中所使用的数值范围(例如5至100)应理解为也包括在该范围中的所有有理数以及在该范围中的任何有理数所组成的范围，因此，本说明书中所使用的数值范围包括介于所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合。另外，本技术所使用的“约”、“大约”或“近乎”等词，实质上代表与所述数值相差在20％以内的，较佳在10％以内的，且更佳在5％以内的数值。
32.本发明提供一种由肉苁蓉萃取物中富集及分离苯乙醇苷类化合物的方法。所述方法包含如下步骤：
33.(a)取由肉苁蓉制得的一粗萃液，通过一富集管柱，使所述粗萃液中的苯乙醇苷类化合物吸附于所述富集管柱内填装的疏水性大孔吸附树脂；
34.(b)以第一洗脱剂洗脱，得到含有松果菊苷的第一洗脱液；
35.(c)以第二洗脱剂洗脱，得到含有类叶升麻苷的第二洗脱液；以及
36.(d)以第三洗脱剂洗脱，得到含有异类叶升麻苷的第三洗脱液。
37.其中，所述第二洗脱剂的极性小于或等于所述第一洗脱剂，所述第三洗脱剂的极性小于或等于所述第二洗脱剂。
38.所述第一洗脱剂、第二洗脱剂、第三洗脱剂皆为极性溶剂，所述极性溶剂包括但不限于水、c1-c4醇类及前述的组合中的任一种；较佳地，所述第一洗脱剂为30％～35％的乙醇，所述第二洗脱剂为40％～45％的乙醇，所述第三洗脱剂为40％～45％的乙醇；更佳地，所述第一洗脱剂为30％的乙醇，所述第二洗脱剂为40％的乙醇，所述第三洗脱剂为40％的乙醇。
39.所述肉苁蓉并不限于列当科(orobanchaceae)肉苁蓉属植物中的特定种，较佳地，所述肉苁蓉为管花肉苁蓉。
40.所述疏水性大孔吸附树脂并不限于特定种类，较佳地，所述疏水性大孔吸附树脂为ab-8或d101。
41.步骤(a)中，应使所述粗萃液中的苯乙醇苷类化合物充分吸附于所述疏水性大孔吸附树脂；较佳地，将所述粗萃液通过所述富集管柱的流速为1.5～3l/h。
42.步骤(d)后，为移除所述疏水性大孔吸附树脂上残余的物质，以便再次使用所述富集管柱，所述方法在步骤(d)后进一步包含：
43.(e)以第四洗脱剂洗脱，得第四洗脱液；
44.其中，所述第四洗脱剂的极性小于或等于所述第三洗脱剂。
45.所述第四洗脱剂为极性溶剂，所述极性溶剂包括但不限于水、c1-c4醇类及前述的组合中的任一种；较佳地，所述第四洗脱剂为80％～95％的乙醇；更佳地，所述第四洗脱剂为80％的乙醇。
46.步骤(a)前，为移除所述疏水性大孔吸附树脂上的多醣类等物质，以提升第一洗脱液、第二洗脱液及第三洗脱液中苯乙醇苷类化合物的浓度及纯度，所述方法在步骤(a)前进一步包含：
47.(f)以第五洗脱剂洗脱，得第五洗脱液；
48.其中，所述第五洗脱剂的极性大于或等于所述第一洗脱剂。
49.所述第五洗脱剂为极性溶剂，所述极性溶剂包括但不限于水、c1-c4醇类及前述的组合中的任一种；较佳地，所述第五洗脱剂为30％～35％的乙醇，更佳地，所述第五洗脱剂为30％的乙醇。
50.本发明提供的方法可应用于任一种肉苁蓉的粗萃液，以富集及分离粗萃液中的苯乙醇苷类化合物；较佳地，所述粗萃液是肉苁蓉的极性溶剂萃取物，所述极性溶剂选自水、c1-c4醇类及前述的组合中的任一种。
51.前述肉苁蓉的粗萃液，例如以包含如下步骤的方法制得者：
52.(i)以一第一极性溶剂萃取肉苁蓉的肉质茎，得到一初提液；
53.(ii)将所述初提液通过一纯化管柱，使所述初提液中的苯乙醇苷类化合物吸附于所述纯化管柱；
54.(iii)以一第二极性溶剂洗脱，去除游离的杂质；以及
55.(vi)以一第二极性溶剂洗脱，得到含有苯乙醇苷类化合物的所述粗萃液；
56.其中，所述第三极性溶剂的极性小于所述第二极性溶剂。
57.所述第一极性溶剂、第二极性溶剂、第三极性溶剂包括但不限于水、c1-c4醇类及前述的组合中的任一种。较佳地；所述第一极性溶剂为水或水与乙醇的混合溶剂，所述第二极性溶剂为水，所述第三极性溶剂为水与乙醇的混合溶剂。
58.由步骤(vi)得到的粗萃液可进一步经过浓缩或干燥后复溶，再投入步骤(a)中使用。
59.利用本发明所提供的方法，可得到含有高浓度、高纯度的个别苯乙醇苷类化合物的制剂：将步骤(b)得到的所述第一洗脱液干燥，可制得包含55wt％～90wt％松果菊苷的第一制剂；将步骤(c)得到的所述第二洗脱液干燥，可制得包含30wt％～75wt％类叶升麻苷的第二制剂；将步骤(d)得到的所述第三洗脱液干燥，可制得包含20wt％～65wt％异类叶升麻苷的第三制剂。
60.利用本发明所提供的方法，可得到含有高浓度混合苯乙醇苷类化合物的肉苁容萃取物制剂：将所述第一洗脱液、所述第二洗脱液、所述第三洗脱液合并后干燥，可制得包含40wt％～75wt％松果菊苷、10wt％～55wt％类叶升麻苷以及5wt％～25wt％异类叶升麻苷的第四制剂。
61.前述第四制剂可进一步包含2'-乙酰基类叶升麻苷(2'-acetylacteoside)、紫葳新苷(campneoside)i、紫葳新苷ii、管花肉苁蓉苷(cistantubuloside)a、管花肉苁蓉苷b1、管花肉苁蓉苷b2、管花肉苁蓉苷c1、管花肉苁蓉苷c2、黄药苷(crenatoside)、去咖啡酰基类叶升麻苷(decaffeoylacteoside)、红景天苷(rhodioloside)、丁香苷a 3'-α-l-吡喃鼠李糖苷(syringalide a3'-α-l-rhamnopyranoside)、或管花苷a(tubuloside a)中的至少一种。较佳地，所述第四制剂包含不少于70wt％的苯乙醇苷类化合物。
62.所述第一洗脱液、第二洗脱液、第三洗脱液可直接合并，或依制剂需求调整比例后合并。
63.许多研究证明，肉苁蓉中的含苯乙醇苷类化合物各有其效用较佳的生理/药理作用，例如，松果菊苷对于神经保护有帮助，也具有免疫调节、血糖调节等作用；异类叶升麻苷可有效抑制类淀粉蛋白(amyloid)聚积，对于肌肉保护、抗疲劳也有明显效果。此外，申请人研究团队的先前专利文献(cn201210548516.0)中已提及，使用异类叶升麻苷和类叶升麻苷
组合物在抑制淀粉样β肽(amyloidβ)的生成、累积或聚集上，存在效用最佳的比例范围。
64.因此，本发明由肉苁蓉萃取物中富集及分离苯乙醇苷类化合物的技术，并非单单能提高产物制剂内苯乙醇苷类化合物的含量，也能够透过合并洗脱液时调整用量比例的方式，针对制剂中的有效成分含量及相对比例进行质量控制，例如增加第一洗脱液的用量，可提升第四制剂内松果菊苷的含量，进而提供一种具有较佳血糖调节功效的组合物；或者调整第一、第二、第三洗脱液的用量，以改变第四制剂内松果菊苷、异类叶升麻苷及类叶升麻苷三者的比例，得到对于抑制淀粉样β肽特别有效的组合物，而可用于预防及延缓阿尔茨海默病(alzheimer’s disease)的作用。
65.实施例1：管花肉苁蓉粗萃液的制备与粗萃液干燥产物分析(一)
66.(1-1)制备管花肉苁蓉粗萃液
67.取管花肉苁蓉的肉质茎部分10公斤，切制成0.4公分厚的片状，加入8倍量的水浸泡1小时后，加热煎煮2小时，过滤并收集滤液备用。药渣加入6倍量的水，加热煎煮提取1小时，过滤并收集滤液备用。药渣再以前述方式重复提取1次。合并3次滤液，于50℃下减压浓缩至比重1.10，添加乙醇至浓度为60％，放置冷藏12小时。之后将上清液倾出，以50℃减压浓缩回收至无乙醇，即为管花肉苁蓉的初提液。
68.将前述初提液上样于预处理好的ab-8型大孔吸附树脂(纯化管柱)，使初提液中的苯乙醇苷类化合物吸附至树脂上。先以8倍柱保留体积的水洗脱，洗脱液收集备用；再以8倍柱保留体积的60％乙醇洗脱，洗脱液收集备用。将水洗脱液再次注入纯化管柱进行吸附，以6倍柱保留体积的水洗脱，洗脱液弃去；再以7倍柱保留体积的60％乙醇洗脱，洗脱液收集备用。合并2次的60％乙醇洗脱液，于50℃下减压浓缩回收至无乙醇，即为管花肉苁蓉的粗萃液。
69.将前述粗萃液喷雾干燥，获得产物1.2公斤。
70.(1-2)分析粗萃液干燥产物
71.以超高效液相色谱法(uplc)测定粗萃液干燥产物内松果菊苷、类叶升麻苷及异类叶升麻苷的含量，
72.uplc条件：使用waters acquity beh c18色谱柱(1.7μm,2.1
×
100mm)，柱温：35℃，移动相：乙腈/0.1％甲酸水溶液(14/86)，流速：0.35ml/分钟，进样量：1μl，检测波长：333nm。
73.精确称取usp松果菊苷、类叶升麻苷及异类叶升麻苷对照品，以50％甲醇配制成每1ml含0.1mg对照品的溶液，作为对照品溶液。
74.供试品溶液的制备是取(1-1)制得的管花肉苁蓉萃取物100mg，置于50ml量瓶中，加入适量50％甲醇，以超音波处理使萃取物溶解，再加入50％甲醇稀释至50ml，摇匀后精密量取1ml，置于10ml量瓶中，加入50％甲醇稀释至10ml，以0.45μm滤膜过滤，得到供试品溶液。
75.如图1所示，以对照品溶液中各指标成分的峰面积进行计算，测得该萃取物内松果菊苷含量为35.7wt％、类叶升麻苷含量为8.3wt％、异类叶升麻苷含量为3.2wt％。
76.实施例2：由粗萃液中富集及分离苯乙醇苷类化合物并分析干燥产物(一)
77.取(1-1)制得的管花肉苁蓉粗萃液干燥产物，以适量的水复溶为粗萃液并上样于预处理好的ab-8型大孔吸附树脂(富集管柱)，控制树脂柱流速为1.5l/h，直至粗萃液中的
苯乙醇苷类化合物充分吸附於树脂上。
78.依序以30％乙醇、40％乙醇及80％乙醇对富集管柱进行梯度洗脱，并以聚稀胺薄板监测梯度洗脱液的成分(移动相40％乙醇，检测波长333nm，比对标准品为松果菊苷、类叶升麻苷及异类叶升麻苷对照品)。除80％乙醇洗脱液弃去外，将梯度洗脱液依检测结果进行合并为第一洗脱液(以30％乙醇洗脱)、第二洗脱液(以40％乙醇洗脱)及第三洗脱液(以40％乙醇洗脱)。
79.将第一洗脱液、第二洗脱液及第三洗脱液分别干燥，即获得含有苯乙醇苷类化合物的第一制剂460.8克、第二制剂44.9克及第三制剂29.6克。
80.以超高效液相色谱法(uplc)分析上述所得的第一制剂、第二制剂及第三制剂中所含成分及其含量。如图2a、2b、2c的结果显示，第一制剂含有78.0wt％的松果菊苷；第二制剂含有57.4wt％的类叶升麻苷；第三制剂含有28.5wt％的异类叶升麻苷。
81.将第一制剂、第二制剂、第三制剂合并计算，则共535.3克的干燥产物中，松果菊苷的占比为67.1wt％、类叶升麻苷的占比为4.8wt％、异类叶升麻苷的占比为1.6wt％。相较于粗萃液干燥产物，松果菊苷的浓度、纯度提升至近两倍，而类叶升麻苷及异类叶升麻苷浓度较低，应用于神经保护、免疫调节及血糖调节等用途可能达成优于粗萃液干燥产物的效果。
82.实施例3：管花肉苁蓉粗萃液的制备与粗萃液干燥产物分析(二)
83.取管花肉苁蓉的肉质茎部分10公斤，切制成0.4公分厚的片状，加入8倍量的水浸泡1小时后，加热煎煮2小时，过滤并收集滤液备用。药渣加入6倍量的水，加热煎煮提取1小时，过滤并收集滤液备用。药渣再以前述方式重复提取1次。合并3次滤液，于50℃下减压浓缩至比重1.10，添加乙醇至浓度为60％，放置冷藏12小时。之后将上清液倾出，以50℃减压浓缩回收至无乙醇，即为管花肉苁蓉的初提液。
84.将前述初提液上样于预处理好的ab-8型大孔吸附树脂(纯化管柱)，使初提液中的苯乙醇苷类化合物吸附至树脂上。先以8倍柱保留体积的水洗脱，洗脱液收集备用；再以8倍柱保留体积的60％乙醇洗脱，洗脱液收集备用。将水洗脱液再次注入纯化管柱进行吸附，以6倍柱保留体积的水洗脱，洗脱液弃去；再以7倍柱保留体积的60％乙醇洗脱，洗脱液收集备用。合并2次的60％乙醇洗脱液，于50℃下减压浓缩回收至无乙醇，即为管花肉苁蓉的粗萃液。
85.将前述粗萃液喷雾干燥，获得粗萃液干燥产物。
86.以超高效液相色谱法(uplc)测定粗萃液干燥产物内松果菊苷、类叶升麻苷及异类叶升麻苷的含量，测得该萃取物内松果菊苷含量为28.4wt％、类叶升麻苷含量为11.3wt％、异类叶升麻苷含量为9.2wt％。
87.实施例4：由粗萃液中富集及分离苯乙醇苷类化合物并分析干燥产物(二)
88.取实施例3制得的管花肉苁蓉粗萃液干燥产物50克，以适量的水复溶为粗萃液并上样于预处理好的ab-8型大孔吸附树脂(富集管柱)，直至粗萃液中的苯乙醇苷类化合物充分吸附於树脂上。
89.控制树脂柱流速为35ml/h，依序以30％乙醇、40％乙醇及95％乙醇对富集管柱进行梯度洗脱，并以超高效液相色谱法(uplc)监测梯度洗脱液的成分。除95％乙醇洗脱液弃去外，将梯度洗脱液依检测结果进行合并为第一洗脱液(以30％乙醇洗脱)、第二洗脱液(以40％乙醇洗脱)及第三洗脱液(以40％乙醇洗脱)。
90.将第一洗脱液、第二洗脱液及第三洗脱液分别浓缩并测定成分干燥，即获得含有苯乙醇苷类化合物的第一制剂20.34克、第二制剂17.11克及第三制剂6.86克。
91.以超高效液相色谱法(uplc)分析上述所得的第一制剂、第二制剂及第三制剂中所含成分及其含量；结果显示，第一制剂含有78.0wt％的松果菊苷；第二制剂含有57.4wt％的类叶升麻苷；第三制剂含有28.5wt％的异类叶升麻苷。
92.若将苯乙醇苷类化合物含量较低的洗脱液分割(fraction)舍去计算，则可得含有64.06wt％松果菊苷的第一a制剂17.81克、含有36.13wt％类叶升麻苷的第二a制剂14.47克、含有28.5wt％异类叶升麻苷的第三制剂6.86克。实施例5：由粗萃液中富集及分离苯乙醇苷类化合物并分析干燥产物(三)
93.取实施例3制得的管花肉苁蓉粗萃液干燥产物50克，以适量的水复溶为粗萃液并上样于预处理好的ab-8型大孔吸附树脂(富集管柱)，直至粗萃液中的苯乙醇苷类化合物充分吸附於树脂上。
94.控制树脂柱流速为35ml/h，依序以35％乙醇、45％乙醇及95％乙醇对富集管柱进行梯度洗脱，并以超高效液相色谱法(uplc)监测梯度洗脱液的成分。除95％乙醇洗脱液弃去外，将梯度洗脱液依检测结果进行合并为第一洗脱液(以35％乙醇洗脱)、第二洗脱液(以45％乙醇洗脱)及第三洗脱液(以95％乙醇洗脱)。
95.将第一洗脱液、第二洗脱液及第三洗脱液分别干燥，即获得含有苯乙醇苷类化合物的第一制剂26.88克、第二制剂5.5克及第三制剂8.07克。
96.以超高效液相色谱法(uplc)分析上述所得的第一制剂、第二制剂及第三制剂中所含成分及其含量；结果显示，第一制剂含有47.95wt％的松果菊苷；第二制剂含有72.91wt％的类叶升麻苷；第三制剂含有45.47wt％的异类叶升麻苷。
97.通过以上实施例说明可知，经过本发明方法将苯乙醇苷类化合物富集及分离后的洗脱液及其干燥制剂具有更高浓度、高纯度、高自由度的松果菊苷、类叶升麻苷及异类叶升麻苷等苯乙醇苷类化合物，在后续添加制造为食品、药品、化妆品等产品时，将具有更好的应用价值。