乳酸乳球菌MD-622及其应用的制作方法

乳酸乳球菌md-622及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种乳酸乳球菌md-622及其应用。


背景技术：

2.乳酸乳球菌(lactococcus lactis，l.lactis)是原核微生物，归属于厚壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，乳球菌属，同时是乳酸菌属中的一种重要模式菌。
3.l.lactis广泛存在于乳制品和植物产品中，在食品工业中应用广泛，对人和动物无致病性，是被公认安全的食品级微生物(generally regards as safe， gras)。然而，乳酸乳球菌的实际种类比较多，很多乳酸乳球菌及其作用还没有被认识并加以利用。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种乳酸乳球菌md-622及其应用，该乳酸乳球菌 md-622能够促进体内产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，改善肠道不适症状，还能在一定程度上促进胚胎干细胞生长发育。
5.本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供一种一种乳酸乳球菌md-622，已于2021年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.23902，保藏单位地址：中国北京。
7.所述乳酸乳球菌的16s rrna序列如seq id no.1所示。
8.在其中一些实施例中，所述乳酸乳球菌的培养条件为：mrs培养基， ph6.2～6.6。
9.在其中一些实施例中，所述乳酸乳球菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶。
10.本发明还提供一种含上述乳酸乳球菌md-622及其分泌产物或者代谢产物的组合物。
11.本发明还提供上述乳酸乳球菌md-622在制备益生菌剂产品中的应用。所述益生菌剂产品为肠道疾病改善用的药品、功能食品或者保健品，或者所述益生菌剂产品为促进胚胎干细胞生长发育的药品、功能食品或者保健品。
12.本发明还提供一种益生菌剂，包含上述乳酸乳球菌md-622以及辅料。
13.本发明还提供一种益生菌剂，包含上述乳酸乳球菌md-622的分泌产物。
14.本发明的有益效果是：
15.与现有技术相比，本发明通过大量探究试验筛选获得了一种乳酸乳球菌 md-622，该菌株能够促进体内产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，改善肠道健康，还能在一定程度上促进胚胎干细胞的生长发育。
附图说明
16.图1是乳酸乳球菌md-622的菌落照片。
17.图2为乳酸乳球菌md-622的产酶测试图。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
19.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
20.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
21.关键试剂组成：
22.mrs培养基：蛋白胨10g/l、牛肉浸粉5g/l、酵母浸粉4g/l、葡萄糖 20g/l、磷酸氢二钾2g/l、柠檬酸三铵2g/l、醋酸钠5g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.05g/l、琼脂15g/l、吐温80 1.0g/l，ph值6.2
±
0.2。
23.实施例1筛选乳酸菌
24.取25岁左右健康成人粪便，蒸馏水稀释处理，涂布于mrs培养基(乳酸细菌培养基)中，37℃倒置培养，挑选培养基上具有不同形态的单菌落进行划线，继续纯化培养，分离得到编号为5b4m2、cb18m1、ps128、xs10m8、 xs14m1、xs14m5的菌株。
25.实施例2产酶活性试验
26.分别对菌种5b4m2、cb18m1、ps128、xs10m8、xs14m1、xs14m5进行产酶活性试验：
27.(1)将上述菌种分别接种含10g/l脱脂奶粉、10g/l蛋白胨、15g/l琼脂粉的蛋白酶筛选培养基中，于37℃培养。进一步采用蛋白酶水解圈法检测培养液中的蛋白酶产生情况。
28.统计结果见下表：
29.不同菌产蛋白酶的情况统计表(n＝3)
[0030][0031][0032]
(2)将上述菌种分别接种含13mm tris-hcl、75mm nacl、1.3mmcacl2(ph8.0)、琼脂15g/l、10mg/l罗丹明b、聚乙烯橄榄油乳化液31.25ml，的脂肪酶筛选培养基中，于37℃培养。进一步采用脂肪酶透明圈法检测培养液中的脂肪酶产生情况。
[0033]
统计结果见下表：
[0034]
不同菌产脂肪酶的情况统计表(n＝3)
[0035][0036]
备注：“—”代表无透明圈。
[0037]
(3)将上述菌种分别接种含5g/l酵母浸膏、15g/l可溶性淀粉、15g/l 琼脂粉的淀粉酶筛选培养基中，于37℃培养。进一步采用淀粉酶水解圈法检测培养液中的淀粉酶产生情况。
[0038]
统计结果见下表：
[0039]
不同菌产淀粉酶的情况统计表(n＝3)
[0040][0041][0042]
备注：“—”代表无，“ ”代表有。
[0043]
(4)将上述菌种分别接种含酵母膏5g/l、羧甲基纤维素5g/l、琼脂粉 15g/l的纤维素酶筛选培养基中，于37℃培养。进一步采用纤维素酶水解圈法检测培养液中的纤维素酶产生情况。
[0044]
统计结果见下表：
[0045]
不同菌产纤维素酶的情况统计表(n＝3)
[0046][0047]
备注：“—”代表无，“ ”代表有。
[0048]
经过上述检测发现，仅cb18m1菌种均可以同时产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶。详见图2所示。
[0049]
将cb18m1菌株进行送检鉴定，测试cb18m1菌种的16s序列为 5_tss20211101-027-00230：
[0050]
ggggcgtgtgctatgatgcagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggt gagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaacttta aacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaa aggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaa actcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtga agaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggta actacccagaaagggacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggattta ttgggcgtaaagcgagcgcaggtggtttattaagtctggtgtaaaaggcagtggctcaaccattgtatgcattggaaa ctggtagacttgagtgcaggagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaaca ccggtggcgaaagcggctctctggcctgtaactgacactgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagat accctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctagatgtagggagctataagttctctgtatcgcagctaacgcaat aagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtg gagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactcgtgctattcctagagatagga agttccttcgggacacgggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc aacgagcgcaacccctattgttagttgccatcattaagttgggcactctaacgagactgccggtgataaaccggagg aaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgag tcgcgagacagtgatgtttagctaatctcttaaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagt cggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac cacgggagttgggagtacccgaagtaggttgcctaaccgcaaggagggcgctcctaagtagaccgattg(seqin no.1)。
[0051]
结合菌落形态及16s序列将该cb18m1菌种命名为乳酸乳球菌 (lactococcus lactis)md-622。
[0052]
将乳酸乳球菌(lactococcus lactis)md-622于2021年11月15日送中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，菌种培养物的培养条件、检测存活条件为：均于乳酸细菌培养基(mrs)中，ph 6.2-6.6，在 37℃恒温培养箱静置过夜培养。建议超低温冻结长期保藏。
[0053]
实施例3毒力实验及安全性检测
[0054]
将cb18m1菌株送检，进行毒理试验及安全性检测试验，结果表明：cb18m1菌株培养物不会危及人类健康或动、植物病原或污染环境。
[0055]
实施例4
[0056]
培养骨细胞(c3h10t1/2):将c3h1ot1/2细胞株在37℃、5％co2的环境下，用含10％胎牛血清与100u/ml青霉素和100μg/ml的链霉素的dmem 高糖培养基进行培养。
[0057]
将待测灭活菌株乳酸乳球菌菌株用mrs液体培养基连续活化3代，用无菌pbs缓冲液洗涤细菌，调整密度为3
×
108ml。按2％体积量向mrs液体培养基接种，摇匀、密闭封口，37℃气浴恒温振荡器中发酵；1周后，取发酵液以4 000r/min离心30min，对上清用0.2μm的微孔滤膜过滤器过滤除。
[0058]
实验组：使用待灭活乳酸乳球菌(lactococcus lactis)md-622上清液刺激骨细胞c3h10t1/2。
[0059]
空白组是采用与实验组相同体积的2.0％甲醛进行刺激。
[0060]
用mtt法检测细胞生长情况，方法步骤为：测定取对数生长期 c3h1ot1/2细胞随机分为试验组和对照组，均按5
×
105/ml的密度接种于96 孔板中，每孔均加入rpmi-4640细胞培养液(含10％胎牛血清)100μl，于 37℃、5％co2条件下培养24h，去除上清。
[0061]
实验组组加入发酵液200μl，发酵液与细胞培养液按1:4体积比。
[0062]
对照组加入pbs缓冲液200μl(与细胞培养液体积比同上)，继续培养 72h后，每孔加入四氮唑蓝mtt溶液10μl，4h后洗弃上清、加二甲基亚砜150μl，每组至少6个平行孔，用酶标仅测定570nm波长处各组的光密度(od)值。
[0063]
换算，结果统计见下表：
[0064]
骨细胞c3h10t1/2生长率统计表
[0065]
编号名称骨细胞c3h10t1/2生长率(％)ck细胞100.00％空白ctrl111.43％cb18m1乳酸乳杆菌81.72％
[0066]
由上表可以看出，cb18m1乳酸乳杆菌对骨细胞c3h10t1/2生长有抑制作用。
[0067]
实施例5
[0068]
培养小鼠胚胎干细胞ce3：采用90％dmem(高糖)、10％胎牛血清(fbs)、1％青霉素、1％链霉素的培养液培养胚胎干细胞。
[0069]
将待测灭活菌株乳酸乳球菌菌株用mrs液体培养基连续活化3代,用无菌pbs缓冲液洗涤细菌，调整密度为3
×
108ml。按2％体积量向mrs液体培养基接种，摇匀、密闭封口，37℃气浴恒温振荡器中发酵；1周后，取发酵液以4 000r/min离心30min，对上清用0.2μm的微孔滤膜过滤器过滤除。
[0070]
使用待测灭活菌株乳酸乳球菌(lactococcus lactis)md-622上清液刺激，用mtt法检测胚胎细胞生长的方法步骤为：
[0071]
测定取对数生长期ce3细胞随机分为试验组和对照组，均按5
×
105/ml 的密度接种于96孔板中，每孔均加入rpmi-4640细胞培养液(含10％胎牛血清)100μl，于37℃、5％co2条件下培养24h，去除上清。
[0072]
实验组组加入发酵液200μl，发酵液与细胞培养液按1:4体积比。
[0073]
对照组加入pbs缓冲液200μl(与细胞培养液体积比同上)，继续培养 72h后，每孔加入四氮唑蓝mtt溶液10μl，4h后洗弃上清、加二甲基亚砜150μl，每组至少6个平行孔，用酶标仅测定570nm波长处各组的光密度(od)值。
[0074]
换算，结果统计见下表：
[0075]
胚胎干细胞ce3生长率统计表
[0076]
编号名称胚胎干细胞ce3生长率(％)ck细胞100.00％空白ctrl95.73％cb18m1乳酸乳杆菌126.54％
[0077]
由上表可以看出，cb18m1乳酸乳杆菌对胚胎干细胞ce3生长发育有促进作用。
[0078]
实施例6
[0079]
本实施例提供一种含乳酸乳球菌(lactococcus lactis)md-622的益生菌剂，包含乳酸乳球菌md-622及制剂辅料。
[0080]
综上所述，本发明通过大量探究试验筛选获得了一种乳酸乳球菌 md-622，该菌株能够促进体内产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，改善肠道健康，还能在一定程度上促进胚胎干细胞的生长发育。
[0081]
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。