一种面向核酸合成的微反应器阵列芯片及其制备方法

1.本发明涉及合成生物学领域，尤其是一种面向核酸合成的微反应器阵列芯片及其制备方法。


背景技术：

2.合成生物学采用从头合成的方法人工合成基因组以及人工创建全新的生物系统，是本世纪急需重点突破的颠覆性创新技术。核酸合成技术是合成生物学发展的“卡脖子”技术，而寡核苷酸合成仪作为其核心装备，自上世纪九十年代起美英等国家在经典化学法基础上进行了寡核苷酸合成仪的研发。目前市场广泛使用的是基于亚磷酰胺化学合成法的柱式寡核苷酸合成仪。这种柱式合成仪通过利用合成柱内受控孔隙玻璃(cpg)颗粒的密集填充获取较大有效反应表面积，从而可实现每柱约微摩尔的产量。然而，自动化的柱式合成仪只能并行合成96-1536个寡核苷酸，使得高通量寡核苷酸合成成为一项成本高、耗时长的工作。相比于一代柱式寡核苷酸合成仪，基于喷墨打印技术与微流控技术的高通量芯片式寡核苷酸合成仪，作为发展中的新一代寡核苷酸合成仪，具有合成通量高、合成成本低等优势。然而，寡核苷酸合成芯片的单个寡核苷酸合成浓度较低，接近飞摩尔水平，无法满足寡核苷酸组装与人工基因合成的需求，仍需进一步开展诸如聚合酶链反应(pcr)等的扩增步骤，因此造成了芯片式寡核苷酸合成步骤较为冗余。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题在于提供一种面向核酸合成的微反应器阵列芯片。
4.本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法。
5.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
6.一种面向核酸合成的微反应器阵列芯片，自上而下包括微反应器阵列以及基底芯片，其中，所述微反应器阵列为具有良好生物兼容性的纳米粒子固相载体(核酸合成的固体支持物)，用于提供核酸合成所需的物理合成区域，所述基底芯片的材料为耐高温或耐高压材料，用于提供微反应器阵列形成的平面支撑。
7.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片，制备所述微反应器阵列的所述纳米粒子的材料为二氧化硅、硅、聚苯乙烯、四氧化三铁、纳米金、纳米银、纳米铜。
8.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片，制备所述微反应器阵列的纳米粒子溶液的粒子直径为150nm、200nm、300nm、500nm或900nm。
9.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片，制备所述微反应器阵列的纳米粒子的溶液浓度为0.003wt％、0.03wt％、0.3wt％或3wt％。
10.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片，所述基底芯片的材料为硅、铝硅铸铁、高铝铸铁、聚苯乙烯或碳基材料。
11.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片，所述基底芯片的尺寸长度为2mm
×
5mm、5mm
×
5mm、5mm
×
7mm、7mm
×
7mm、7mm
×
10mm或10mm
×
10mm。
12.一种面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，首先对基底芯片表面进行疏水处理，获取疏水基底表面，然后配置适用于液滴滴定的纳米粒子溶液并通过试剂添加技术对芯片基底进行滴定，最后通过调控三相接触线的移动实现纳米粒子的聚集，构建微反应器阵列；针对纳米粒子聚集之后的芯片，为保证在核酸合成过程中单液滴纳米粒子聚集结构的稳定性，采用加热、高温烧结或者高压的方式对纳米粒子微反应器进行固定，实现纳米粒子之间的稳定粘结；最后针对微反应器阵列进行功能化修饰，采用芯片式核酸合成技术，实现核酸的高通量与高载量合成。
13.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，包括但不限于基于喷墨打印技术对碱基单体试剂和催化剂进行喷射，实现微反应器表面碱基单体的偶联；基于光敏酸脱保护原理，采用数字微镜技术对不同反应器位点进行光照，实现不同反应器位点的脱保护，用于下一步骤碱基单体偶联反应；基于电化学生酸原理，在不同反应器位点进行电化学反应，生成一定浓度的氢离子，实现碱基单体的脱保护反应。
14.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，通过掩模工艺设计在基底芯片表面构建亲疏水修饰图案(通过合成芯片表面构建亲疏水图案，实现纳米粒子图案化聚集)，对疏水处理后的合成芯片整体进行图案化光刻，对光刻后的区域进行亲水处理，其他区域保持疏水，从而获得亲疏水图案基底，基于喷墨打印技术在基底芯片表面制造出微反应器阵列，将微反应器阵列固定于基底芯片后，对芯片表面做功能化处理并进行寡核苷酸合成。
15.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，对疏水处理后的合成芯片整体进行图案化光刻，对光刻后的区域进行亲水处理，所述亲水处理所用方法为氧气plasma处理或piranha溶液浸泡，其他区域保持疏水，从而获得亲疏水图案基底。
16.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，通过改变所述纳米粒子溶液的浓度，控制所述纳米粒子的聚集尺寸。
17.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，纳米粒子在芯片表面实现聚集后，通过高温烧结的手段实现纳米粒子之间的紧密固定，构建片上多孔反应器阵列结构。
18.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，在纳米粒子聚集的过程中，通过改变基底芯片温度以控制所述纳米粒子的聚集速率。
19.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，所述疏水处理所用试剂包括但不局限于全氟辛烷磺酸、三氯(1h，1h，2h，2h-全氟辛基)硅烷、1h,1h,2h,2h-全氟癸基三甲氧基硅烷、十八烷基三氯硅烷、正己烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷。
20.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，合成芯片疏水处理后的接触角为90-158度，包括但不限于95度、100度、105度、110度、120度或130度。
21.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，所述亲疏水修饰图案的特征图形包括圆形、三角形、四边形、五边形、六边形、十字型、五角星或六角星。
22.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，所述试剂添加技术为喷墨打印、微流控技术、点胶技术或喷涂的方法。
23.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，所述喷墨打印技术
为单通道喷墨打印、多通道喷墨打印或阵列化喷墨打印。
24.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，所述喷墨打印技术中喷墨打印喷嘴直径为30um、50um、80um、100um或150um。
25.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，固定微反应器阵列的方法为600℃烧结、700℃烧结、800℃烧结、900℃烧结、1000℃烧结或1050℃烧结。
26.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，在纳米反应器表面修饰氨基、羟基、醛基或寡核苷酸单体等有效作用基团或分子，从而提供寡核苷酸单体偶联的起始位点。
27.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，所述寡核苷酸合成的方法包括但不限于亚磷酰胺三酯合成法，通过一个由去保护、偶联、盖帽和氧化四步反应组成的化学循环反应来添加每一个特定的寡核苷酸；包括但不限于新型酶法合成技术，通过末端脱氧核苷酸转移酶tdt与apyrase两种酶的竞争延伸寡核苷酸链。在合成时tdt将核苷酸添加到寡核苷酸末端，apyrase通过降解核苷酸阻碍其添加，通过优化调节含有这两种酶的混合物的比例，以保证每一个循环中在所有核苷酸被降解前至少有一个核苷酸添加到寡核苷酸链上，实现寡核苷酸合成。
28.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，通过使用高温烧结炉，以1-5℃/min的升温速率烧结并在900℃下保持1小时，以获取稳定的纳米反应器结构。
29.优选的，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，具体步骤如下：
30.(1)按设计尺寸切割合成基底材料至符合设计需求；
31.(2)将合成基底在丙酮和无水乙醇中分别超声清洗15min，并在氮气流中干燥，获得干燥洁净的合成基底；
32.(3)将步骤(2)所得的合成基底进行气相沉积处理，获得具有疏水表面的合成基底；
33.(4)利用光刻法在合成基底表面进行图案化处理；
34.(5)对步骤(4)光刻后区域进行plasma处理，获得具有亲疏水表面的合成基底；
35.(6)利用喷墨打印技术在步骤(5)所得的亲疏水图案化合成基底表面上打印微反应器阵列；
36.(7)对步骤(6)所得的具有微反应器阵列的合成基底进行高温烧结，在1℃/min的气流下加热，在设定温度下保持1h，然后快速冷却至80℃。
37.(8)将步骤(7)烧结处理后的合成基底上的微反应器阵列进行功能化处理，即使用5％aptes溶液处理反应器阵列，从而在反应器阵列表面获取氨基基团，然后通过10h过夜处理在反应器阵列表面链接第一个碱基单体；
38.(9)在步骤(8)功能化处理后的微反应器阵列上进行寡核苷酸合成，寡核苷酸合成方法采用亚磷酰胺化学合成法，主要包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四个步骤，用来实现一个碱基单体链接；通过以上步骤的不断循环，从而实现不同长度寡核苷酸链的合成。
39.有益效果：
40.较比于现有的利用深硅刻蚀技术在芯片表面打孔进而在孔内合成核酸的方法，本技术所述微反应器阵列芯片在芯片表面构建固相载体直接进行核酸合成。所述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，通过在基底芯片表面构建微反应器阵列，以提供高载
量寡核苷酸从头合成的物理支持。微反应器阵列芯片通过表面预处理以获得较高的后退接触角疏水界面，从而提供三相接触线(tcl)移动时纳米粒子聚集的内驱动力。通过喷墨打印等试剂添加技术，纳米颗粒液滴阵列被打印在疏水表面上。在溶剂蒸发过程中，纳米粒子在三相接触线(tcl)受控滑动的驱动下，紧密聚集形成密集堆积的高表面积排列微反应器阵列。通过外部高温或高压等调控手段，纳米粒子可以实现稳定的物理结合，从而在数百次溶剂处理循环后固有地保持高表面积多孔阵列结构，以提供寡核苷酸偶联的多个反应位点，提升合成芯片整体的合成产量，在高载量与高通量核酸合成领域具有良好的应用前景。
附图说明
41.图1是本发明提出的一种面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备流程图；
42.图中：1：合成基底芯片；2：进液模块；3：纳米粒子液滴阵列；4：纳米粒子聚集后的微反应器阵列；5：高温烧结后的微反应器阵列；6：功能化修饰的微反应器阵列；7：合成后的寡核苷酸阵列芯片。
43.图2是本发明提出的调控三相接触线移动实现纳米粒子聚集的示意图。
44.图中：8：纳米粒子溶液单液滴；9：三相接触线收缩后的液滴；10：纳米粒子聚集体。
45.图3是本发明提出的高温烧结实现纳米粒子稳固连接的示意图。
46.图中：11：纳米粒子；12：纳米粒子表面羟基基团；10：稳固粘结的纳米粒子聚集体。
47.图4是高载量合成芯片表面功能化修饰流程示意图。
48.图中：13:aptes溶液；14：碱基单体的乙腈溶液。
具体实施方式
49.下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
50.实施例1
51.如图1所示，所述面向核酸合成的微反应器阵列芯片，自上而下依次为纳米粒子聚集后的微反应器阵列4以及合成基底芯片1，其中，所述微反应器阵列为具有良好生物兼容性的固相载体(核酸合成的固体支持物)，用于提供核酸合成所需的物理合成区域，所述基底芯片的材料为耐高温或耐高压材料，用于提供微反应器阵列形成的平面支撑载体以及亲疏水界面；
52.所述微反应器阵列芯片制备所需的纳米粒子固相载体为单分散二氧化硅微球(也可以是单分散聚苯乙烯微球、硅纳米粒子、四氧化三铁纳米粒子、纳米金、纳米银、纳米铜)；
53.所述微反应器阵列芯片制备所需的纳米粒子固相载体的粒子直径为150nm(也可以是20nm、50nm、100nm、150nm、200nm、300nm、500nm、900nm)；
54.所述微反应器阵列制备所需的固相载体的纳米粒子溶液浓度为0.3wt％(也可以是0.003wt％、0.03wt％、3wt％)；
55.所述微反应器阵列制备所需的固相载体的纳米粒子溶液溶剂为水(也可以是乙腈、乙二醇、二氯甲烷、甲苯、二氯甲烷)；
56.所述微反应器阵列制备所需基底芯片的材料为硅(也可以是铝硅铸铁、高铝铸铁、聚苯乙烯、碳基材料)；
57.所述微反应器阵列制备所需的基底芯片的尺寸长度为2mm
×
5mm(也可以是5mm
×
5mm、5mm
×
7mm、7mm
×
7mm、7mm
×
10mm、10mm
×
10mm)；
58.所述微反应器阵列制备所需基底芯片的疏水处理试剂为三氯(1h，1h，2h，2h-全氟辛基)硅烷(也可以是全氟辛烷磺酸、1h,1h,2h,2h-全氟癸基三甲氧基硅烷、十八烷基三氯硅烷、正己烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷)；
59.所述微反应器阵列制备所需的基底芯片疏水处理后的接触角为130度(也可以是95度、100度、105度、110度、120度)；
60.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理，使用的掩膜板图案特征图形为圆形，也可以是正三角形、正四边形、正五边形、正六边形、十字型、正五角星、正六角星等构成的阵列；
61.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理的掩膜板圆形阵列时直径至少为0.01mm，也可以是0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm或更长；
62.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理的掩膜板图案的正三角形时外接圆直径至少为0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm或更长；
63.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理的掩膜板图案的正四边形角形外接圆直径至少为0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm或更长；
64.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理的掩膜板图案的正五边形时角形外接圆直径至少为0.01mm，也可以是0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm或更长；
65.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理的掩膜板图案的正六边形时角形外接圆直径至少为0.01mm，也可以是0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm或更长；
66.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理的掩膜板图案的十字形时外接圆直径至少为0.01mm，也可以是0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm或更长；
67.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理的掩膜板图案的正五角星时外接圆直径至少为0.01mm，也可以是0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm或更长；
68.所述基底芯片表面亲疏水图形化处理的掩膜板图案的正六角星时外接圆直径至少为0.01mm，也可以是0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm或更长；
69.所述面向核酸合成的微反应器阵列芯片制备方法，通过进液模块2将微反应器阵列的纳米粒子溶液打印在亲疏水图案化合成基底芯片1表面形成纳米粒子液滴阵列3，随着溶剂挥发三相接触线收缩使得纳米粒子聚集，通过高温烧结得到与芯片基底稳固连接的高温烧结后的微反应器阵列5，在高温烧结后的微反应器阵列5表面进行功能化氨基修饰得到功能化修饰的微反应器阵列6，在功能化的微反应器阵列表面合成寡核苷酸得到最终的高载量的合成后的寡核苷酸阵列芯片7；
70.所述进液模块采用的试剂添加技术为喷墨打印(也可以是微流控技术、点胶技术、喷涂)；
71.所述喷墨打印技术为单通道喷墨打印(也可以是多通道喷墨打印、阵列化喷墨打印)；
72.所述喷墨打印的喷嘴直径为80um(也可以是30um、50um、100um、150um)；所述高温烧结的设定温度为900℃(也可以是600℃、700℃、800℃、1000℃、1050℃)；
73.所述寡核苷酸的合成方法为亚磷酰胺三酯合成法(也可以是基于tdt与apyrase的新型酶促合成法)，通过一个由去保护、偶联、盖帽和氧化四步反应组成的化学循环反应来
添加每一个特定的寡核苷酸。
74.如图2所示，上述一种面向核酸合成的微反应器阵列芯片制备方法，利用单通道喷墨打印打出纳米粒子溶液单液滴8，随着溶剂的挥发，三相接触线收缩后的液滴9为溶剂挥发过程中的产物，三相接触线发生移动作为溶液内纳米粒子的内驱力，推动纳米粒子向内部聚集，最终形成纳米粒子堆积的高密度多孔微反应器结构，待溶剂完全挥发后得到纳米粒子聚集体10即为微反应器阵列；
75.所述微反应器阵列芯片制备的纳米粒子聚集过程，可通过不同温度加热芯片等方式，加速三相接触线的移动，从而加快纳米粒子的聚集速率；
76.所述微反应器阵列芯片制备的纳米粒子聚集过程，可通过外部气体吹扫等方式，加速三相接触线的移动，从而加快纳米粒子的聚集速率。
77.如图3所示，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，溶剂完全挥发后得到纳米粒子聚集体微反应器阵列，图中11为微反应器阵列中的单个纳米粒子，12为纳米粒子表面羟基基团，经高温烧结，在高温条件下纳米粒子之间的羟基基团发生表面脱水反应，烧结完成后得到稳固粘结的纳米粒子聚集体10。
78.如图4所示，上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片的制备方法，经由高温烧结将纳米粒子聚集体稳固粘结与基底芯片后，将芯片浸泡于5％的aptes溶液13中进行氨基功能化修饰，在300r/min的转速下处理1h后取出芯片并将其浸泡于碱基单体的乙腈溶液14中过夜处理，在微反应器阵列表面链接第一个碱基单体，便于接续合成单链寡核苷酸；
79.上述面向核酸合成的微反应器阵列芯片：
80.1、本文针对目前芯片式核酸合成的合成量低的问题，采用在芯片表面构建纳米粒子液滴阵列，通过调控三相接触线的移动，实现纳米粒子聚集从而构建多孔高表面积微反应器阵列结构。
81.2、针对核酸合成过程中涉及的多种试剂流体的浸润、冲洗与混合等化学反应，为保证纳米粒子聚集后形成的反应器结构的稳定性，采用外部加热、加压或化学反应等方式，实现纳米粒子之间的稳定粘结，在合成反应过程中提供稳定的高表面寡核苷酸合成固体支持反应位点。
82.3、本发明所构建的面向核酸合成的微反应器阵列芯片制备方法，可与喷墨打印技术、数字微镜技术(dmd)、电化学控制技术以及热控脱保护等技术进行兼容，在保证核酸合成芯片高通量合成的同时，进一步提升核酸的合成产量，极大地拓展了芯片式核酸合成在基因组装与人工基因合成的应用领域，在未来具有巨大的应用前景。
83.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。