一种基于光电-电化学协同检测展青霉素的比率传感器的制备方法与流程

1.2m hcl溶液、2.8ml 10mm aa溶液依次加入到50ml玻璃瓶中，混合均匀；再加入48μl au种子溶液，轻轻搅拌15s，溶液由深橙色变为无色。放入30℃孵育箱反应20h，溶液变为砖红色，合成au nrs。
10.(3)利用静电吸附制备cdte qds/au nrs纳米复合材料：
11.将cdte qds溶液与au nrs溶液等体积混合，震荡，溶液变浑浊得到cdte qds/au nrs纳米复合材料。
12.步骤(3)中，cdte qds溶液的浓度为2-10μm，au nrs溶液的浓度为0.2-1nm；震荡时间为5-10min。
13.(4)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇、水中超声15-30s后于氮气中干燥，得到处理后的玻碳电极；
14.步骤(4)中，玻碳电极的直径d＝3mm，玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末打磨。
15.(5)将步骤(3)制备的cdte qds/au nrs纳米复合材料修饰到步骤(4)预处理的玻碳电极表面，并在室温下干燥，此时，产品标记为cdte qds/au nrs/gce；
16.步骤(5)中，cdte qds/au nrs纳米复合材料的修饰量为5-10μl。
17.(6)在一定温度下，在cdte qds/au nrs/gce电极上修饰5-10μl 2-4μm二茂铁标记的pat适配体，孵育，得到基于光电-电化学协同检测展青霉素的比率传感器。
18.步骤(6)中，孵育温度为25℃，时间为10-16h。
19.步骤(6)中，所述pat适配体为碱基数为22、34、42或45，得到的比率传感器分别标记为a22，a34，a42或a45。
20.当碱基数为22时，pat适配体序列为：gtagtggcgtaaacggcgctca，
21.当碱基数为34时，pat适配体序列为：
22.gtagtggcgtaaacggcgctcaactgataagaat，
23.当碱基数为42时，pat适配体序列为：
24.gatcgtaccacacccttactttcttgatcggatggacacggt，
25.当碱基数为45时，pat适配体序列为：
26.agagtgacgcagcagcactccatcggtgaaacggctccttcgatt。
27.将本发明制备的基于光电-电化学协同检测展青霉素的比率传感器用于检测展青霉素的用途，步骤为：
28.(1)在上述所制得的a22，a34，a42或a45比率传感器表面修饰6μl不同浓度的pat：室温下孵育时间为20-60min，pat浓度依次为50fg
·
ml-1
、100fg
·
ml-1
、1pg
·
ml-1
、10pg
·
ml-1
、100pg
·
ml-1
、1ng
·
ml-1
、10ng
·
ml-1
、100ng
·
ml-1
、500ng
·
ml-1
，之后用超纯水对电极进行清洗。在三电极体系中，将冲洗后的电极作为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为mc-tcx300氙灯光源系统和autolab pgstat 302n电化学工作站分别测量记录电化学与光电化学信号。其中，电化学在0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行测试，光电化学测试在含0.1m aa的0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行，外加偏置电压为0v。测量比率信号i
pec
/i
ec
，建立展青霉素浓度对应比率信号i
pec
/i
ec
的标准线性曲线；其中，i
pec
为光电流、i
ec
为二茂铁氧化电流；
29.(2)将待测样品溶液滴加在a22，a34，a42或a45比率传感器上，室温下孵育一定时
间后，使用超纯水溶液进行冲洗；在三电极体系中，将冲洗后的电极作为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂丝为对电极，以磷酸盐缓冲溶液为电解液，扫描电化学交流伏安曲线，测量比率信号i
pec
/i
ec
，代入步骤(1)的标准线性曲线，实现对待测样品展青霉素的检测。
30.本发明的有益效果：
31.(1)选择fc标记的适配体，一方面作为氧化还原探针产生电化学信号，另一方面作为光敏剂得到增加的光电信号，实现光电-电化学协同作用。
32.(2)引入展青霉素适配体作为特异性识别元件，可提高展青霉素传感器的选择性，降低其他真菌毒素的干扰，实现果汁、果泥中展青霉素pat的特异性分析。
33.(3)在同一电极界面，使用光电化学、电化学两种方法对四条不同适配体与目标物结合的能力进行考察，分别筛选出对两种方法响应最优的适配体。
34.(4)本发明将增加的光电化学信号和降低的电信号做比值，通过记录比值信号反应定量检测展青霉素浓度。两信号在同一电极获取，两者互为参考，有效地降低溶液基质及环境因素对电极的干扰。
35.(5)本发明构建的光电化学-电化学比率传感器用于pat的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽，为50fg
·
ml-1-500ng
·
ml-1
。
附图说明
36.图1基于不同核酸序列的ec和pec传感机制。
37.图2a22、a34、a42和a45结合1ng
·
ml-1
pat在0.1m pbs(ph 7.4)中的(a)ec和含有0.1m aa的0.1m pbs(ph＝7.4)的(b)pec的响应曲线；(c)a22、a34、a42和a45结合1ng
·
ml-1
pat的i
pec
/i
ec
值。
38.图3(a)a22传感器对不同浓度展青霉素的响应曲线(0ng ml-1
、0.01ng ml-1
、1ng ml-1
)；(b)检测展青霉素pat的线性回归曲线(i
pec
/i
ec
与展青霉素pat浓度的对数)。
39.图4为a22光电-电化学比率传感器(a)稳定性和(b)重现性测试。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例和说明书附图，进一步阐明本发明。
41.实施例1
42.按照图1所述的制备工艺：
43.(1)cdte qds纳米材料的制备：
44.使用微波合成方法制备cdte qds溶液。磁力搅拌下，在100ml烧杯中依次加入42ml超纯水、4ml 0.04mol
·
l-1
cdcl2·
2.5h2o溶液、0.1g柠檬酸三钠固体、4ml 0.01mol
·
l-1
na2teo3溶液、99μl mpa溶液、50mg nabh4固体，得到棕色溶液；用1mol
·
l-1
的naoh溶液缓慢调节溶液ph至8.5，持续搅拌12h后，溶液变为浅棕色(记为前驱体溶液)；取15ml前驱体溶液加入到30ml反应釜中，140℃加压加热2h，得到cdte qds溶液；将制备的cdte qds溶液与乙醇以1:1比例混合后，静置5min，离心、洗涤，烘干后再次分散在超纯水中备用。
45.(2)au nrs纳米材料的制备：
46.在25ml玻璃瓶中依次加入4.5ml超纯水、5ml ctab溶液、500μl 5mm haucl4溶液、剧烈搅拌下加入610μl 10mm冰nabh4溶液，得到棕色溶液；将混合溶液在30℃孵育箱中静置
2h，得到au种子溶液；将24ml ctab溶液、5ml 5mm haucl4溶液、50μl 100mm agno3溶液、32μl 1.2m hcl溶液、2.8ml 10mm aa溶液依次加入到50ml玻璃瓶中，混合均匀；再加入48μl au种子溶液，轻轻搅拌15s，溶液由深橙色变为无色。放入30℃孵育箱反应20h，溶液变为砖红色，合成au nrs。
47.(3)cdte qds/au nrs纳米复合材料的制备：
48.利用静电吸附制备cdte qds/au nrs复合材料：将4μm cdte qds与0.4nm au nrs等体积混合，震荡5min后得到cdte qds/au nrs复合材料。
49.(4)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇、水中超声30s后于氮气中干燥，得到处理后的玻碳电极；
50.(5)将步骤(3)制备的6μl cdte qds/au nrs纳米复合材料修饰到步骤(5)预处理的玻碳电极表面，并在室温下干燥，此时，产品标记为cdte qds/au nrs/gce；
51.(6)将6μl 4μmol
·
ml-1
碱基数为22的pat适配体修饰在电极表面，并在25℃下孵育12h，之后用0.01m tris-hcl对产品进行清洗，此时，产品标记为apt/cdte qds/au nrs/gce；即高灵敏检测展青霉素光电-电化学适配体比率传感器。
52.在上述所制得的传感器表面修饰6μl不同浓度的展青霉素，室温下绑定时间为50min，pat浓度依次为50fg ml-1
、100fg ml-1
、1pg ml-1
、10pg ml-1
、100pg ml-1
、1ng ml-1
、10ng ml-1
、100ng ml-1
、500ng ml-1
，之后用超纯水对电极进行清洗。在三电极体系中，将清洗后的电极作为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为mc-tcx300氙灯光源系统和autolab pgstat 302n电化学工作站分别记录与检测电化学与光电化学信号。电化学在0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行测试，光电化学测试在含0.1m aa的0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行，外加偏置电压为0v。
53.实施例2
54.(1)cdte qds纳米材料的制备：
55.使用微波合成方法制备cdte qds溶液。磁力搅拌下，在100ml烧杯中依次加入42ml超纯水、4ml 0.04mol
·
l-1
cdcl2·
2.5h2o溶液、0.1g柠檬酸三钠固体、4ml 0.01mol
·
l-1
na2teo3溶液、99μl mpa溶液、50mg nabh4固体，得到棕色溶液；用1mol
·
l-1
的naoh溶液缓慢调节溶液ph至8.5，持续搅拌12h后，溶液变为浅棕色(记为前驱体溶液)；取15ml前驱体溶液加入到30ml反应釜中，140℃加压加热2h，得到cdte qds溶液；将制备的cdte qds溶液与乙醇以1:1比例混合后，静置5min，离心、洗涤，烘干后再次分散在超纯水中备用。
56.(2)au nrs纳米材料的制备：
57.在25ml玻璃瓶中依次加入4.5ml超纯水、5ml ctab溶液、500μl 5mm haucl4溶液、剧烈搅拌下加入610μl 10mm冰nabh4溶液，得到棕色溶液；将混合溶液在30℃孵育箱中静置2h，得到au种子溶液；将24ml ctab溶液、5ml 5mm haucl4溶液、50μl 100mm agno3溶液、32μl 1.2m hcl溶液、2.8ml 10mm aa溶液依次加入到50ml玻璃瓶中，混合均匀；再加入48μl au种子溶液，轻轻搅拌15s，溶液由深橙色变为无色。放入30℃孵育箱反应20h，溶液变为砖红色，合成au nrs。
58.(3)cdte qds/au nrs纳米复合材料的制备：
59.利用静电吸附制备cdte qds/au nrs复合材料：将4μm cdte qds与0.4nm au nrs等体积混合，震荡5min后得到cdte qds/au nrs复合材料。
60.(4)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇、水中超声30s后于氮气中干燥，得到处理后的玻碳电极；
61.(5)将步骤(3)制备的6μl cdte qds/au nrs纳米复合材料修饰到步骤(5)预处理的玻碳电极表面，并在室温下干燥，此时，产品标记为cdte qds/au nrs/gce；
62.(6)将6μl 4μmol
·
ml-1
碱基数为34的pat适配体修饰在电极表面，并在25℃下孵育12h，之后用0.001m ttis-hcl对产品进行清洗，此时，产品标记为apt/cdte qds/au nrs/gce；即获得高灵敏检测展青霉素光电-电化学适配体比率传感器。
63.在上述所制得的传感器表面修饰6μl浓度为1ng ml-1
的展青霉素，室温下绑定时间为50min，之后用超纯水对电极进行清洗。本发明制得的传感器作为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为mc-tcx300氙灯光源系统和autolab pgstat 302n电化学工作站分别记录与检测电化学与光电化学信号。电化学在0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行测试，光电化学测试在含0.1m aa的0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行，外加偏置电压为0v。
64.实施例3
65.(1)cdte qds纳米材料的制备：
66.使用微波合成方法制备cdte qds溶液。磁力搅拌下，在100ml烧杯中依次加入42ml超纯水、4ml 0.04mol
·
l-1
cdcl2·
2.5h2o溶液、0.1g柠檬酸三钠固体、4ml 0.01mol
·
l-1
na2teo3溶液、99μl mpa溶液、50mg nabh4固体，得到棕色溶液；用1mol
·
l-1
的naoh溶液缓慢调节溶液ph至8.5，持续搅拌12h后，溶液变为浅棕色(记为前驱体溶液)；取15ml前驱体溶液加入到30ml反应釜中，140℃加压加热2h，得到cdte qds溶液；将制备的cdte qds溶液与乙醇以1:1比例混合后，静置5min，离心、洗涤，烘干后再次分散在超纯水中备用。
67.(2)au nrs纳米材料的制备：
68.在25ml玻璃瓶中依次加入4.5ml超纯水、5ml ctab溶液、500μl 5mm haucl4溶液、剧烈搅拌下加入610μl 10mm冰nabh4溶液，得到棕色溶液；将混合溶液在30℃孵育箱中静置2h，得到au种子溶液；将24ml ctab溶液、5ml 5mm haucl4溶液、50μl 100mm agno3溶液、32μl 1.2m hcl溶液、2.8ml 10mm aa溶液依次加入到50ml玻璃瓶中，混合均匀；再加入48μl au种子溶液，轻轻搅拌15s，溶液由深橙色变为无色。放入30℃孵育箱反应20h，溶液变为砖红色，合成au nrs。
69.(3)cdte qds/au nrs纳米复合材料的制备：
70.利用静电吸附制备cdte qds/au nrs复合材料：将4μm cdte qds与0.4nm au nrs等体积混合，震荡5min后得到cdte qds/au nrs复合材料。
71.(4)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇、水中超声30s后于氮气中干燥，得到处理后的玻碳电极；
72.(5)将步骤(3)制备的6μl cdte qds/au nrs纳米复合材料修饰到步骤(5)预处理的玻碳电极表面，并在室温下干燥，此时，产品标记为cdte qds/au nrs/gce；
73.(6)将6μl 4μmol
·
ml-1
碱基数为42的pat适配体修饰在电极表面，并在25℃下孵育12h，之后用0.01m tris-hcl对产品进行清洗，此时，产品标记为apt/cdte qds/au nrs/gce；即获得高灵敏检测展青霉素光电-电化学适配体比率传感器。
74.在上述所制得的传感器表面修饰6μl浓度为1ng ml-1
的展青霉素，室温下绑定时间
为50min，之后用超纯水对电极进行清洗。本发明制得的传感器作为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为mc-tcx300氙灯光源系统和autolab pgstat 302n电化学工作站分别记录与检测电化学与光电化学信号。电化学在0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行测试，光电化学测试在含0.1m aa的0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行，外加偏置电压为0v。
75.实施例4
76.(1)cdte qds纳米材料的制备：
77.使用微波合成方法制备cdte qds溶液。磁力搅拌下，在100ml烧杯中依次加入42ml超纯水、4ml 0.04mol
·
l-1
cdcl2·
2.5h2o溶液、0.1g柠檬酸三钠固体、4ml 0.01mol
·
l-1
na2teo3溶液、99μl mpa溶液、50mg nabh4固体，得到棕色溶液；用1mol
·
l-1
的naoh溶液缓慢调节溶液ph至8.5，持续搅拌12h后，溶液变为浅棕色(记为前驱体溶液)；取15ml前驱体溶液加入到30ml反应釜中，140℃加压加热2h，得到cdte qds溶液；将制备的cdte qds溶液与乙醇以1:1比例混合后，静置5min，离心、洗涤，烘干后再次分散在超纯水中备用。
78.(2)au nrs纳米材料的制备：
79.在25ml玻璃瓶中依次加入4.5ml超纯水、5ml ctab溶液、500μl 5mm haucl4溶液、剧烈搅拌下加入610μl 10mm冰nabh4溶液，得到棕色溶液；将混合溶液在30℃孵育箱中静置2h，得到au种子溶液；将24ml ctab溶液、5ml 5mm haucl4溶液、50μl 100mm agno3溶液、32μl 1.2m hcl溶液、2.8ml 10mm aa溶液依次加入到50ml玻璃瓶中，混合均匀；再加入48μl au种子溶液，轻轻搅拌15s，溶液由深橙色变为无色。放入30℃孵育箱反应20h，溶液变为砖红色，合成au nrs。
80.(3)cdte qds/au nrs纳米复合材料的制备：
81.利用静电吸附制备cdte qds/au nrs复合材料：将4μm cdte qds与0.4nm au nrs等体积混合，震荡5min后得到cdte qds/au nrs复合材料。
82.(4)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇、水中超声30s后于氮气中干燥，得到处理后的玻碳电极；
83.(5)将步骤(3)制备的6μl cdte qds/au nrs纳米复合材料修饰到步骤(5)预处理的玻碳电极表面，并在室温下干燥，此时，产品标记为cdte qds/au nrs/gce；
84.(6)将6μl 4μmol
·
ml-1
碱基数为45的pat适配体修饰在电极表面，并在25℃下孵育12h，之后用0.01m tris-hcl对产品进行清洗，此时，产品标记为apt/cdte qds/au nrs/gce；即获得高灵敏检测展青霉素光电-电化学适配体比率传感器。
85.在上述所制得的传感器表面修饰6μl浓度为1ng ml-1
的展青霉素，室温下绑定时间为50min，之后用超纯水对电极进行清洗。本发明制得的传感器作为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为mc-tcx300氙灯光源系统和autolab pgstat 302n电化学工作站记录与检测光电化学信号。电化学在0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行测试，光电化学测试在含0.1m aa的0.1m pbs(ph＝7.4)缓冲溶液中进行，外加偏置电压为0v。
86.图2(a)为a22、a34、a42和a45结合1ng
·
ml-1
pat在0.1m pbs(ph 7.4)中的ec响应曲线；看到电化学信号响应最大的为42碱基适配体链；
87.图2(b)为a22、a34、a42和a45结合1ng
·
ml-1
pat在含有0.1m aa的0.1m pbs(ph＝
7.4)中的pec的响应曲线；光电化学信号响应最大的是22碱基适配体链，
88.图2(c)a22、a34、a42和a45结合1ng
·
ml-1
pat的i
pec
/i
ec
值，可以看出，将两信号进行数据处理，综合得到22碱基适配体为最优适配体。
89.从图3(a)所示，a22适配体传感器随着pat浓度的增大，加入目标物后的光电流(i
pec
)逐渐增大；电化学响应(i
ec
)逐渐减小。利用比率原则，使用它们的比值i
pec
/i
ec
量化pat浓度。图3(b)为i
pec
/i
ec
值与pat浓度对数的线性回归曲线。结果显示，a22传感器对pat检测的线性范围为50fg
·
ml-1-500ng
·
ml-1
，检出限为30fg
·
ml-1
。线性回归方程为i
pec
/i
ec
＝0.40lg c 1.82，相关系数(r2)为0.998。
90.从图4(a)中可以看出，a22传感器的重现性是通过测试七根独立的电极，相对标准偏差(rsd)分别为2.8％，表明其重现性好。图4(b)相同批次电极测量七天后，比率信号为第一天的96％，表明其具有良好的长期稳定性。