一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶III的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素B1

一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶iii的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素b1
技术领域
1.本发明涉及一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶iii的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素b1，尤其涉及一种dna双链的制备方法。


背景技术：

2.黄曲霉毒素b1（afb1）是由真菌产生的毒性最强的真菌毒素之一，主要存在于受污染或发霉的作物和发酵产品中，如玉米、花生、谷物、酱油和黄酒。同时，afb1还具有致畸、致突变和致癌的作用，对人和动物的健康有严重的威胁。因此，建立一种快速、准确的检测和控制食品中afb1的方法对食品安全和人类健康都至关重要。
3.目前，afb1分析方法依赖于高效液相色谱-荧光法（hplc-fl）。尽管具有高灵敏度和准确性，但该技术需要专业操作员和昂贵的设备。免疫方法如酶联免疫吸附法（elisa）也已经开发出来，并已投入可用的商业测试试剂盒，主要用于常规分析。即使此方法操作简便，但稳定性较差。而且，抗体在制备、稳定性和成本方面也存在一些限制。
4.与抗体相比，核酸适体（aptamer）具有独特的特性，例如易于化学合成和官能团修饰，良好的稳定性以及价格便宜等。适体已用于生物传感器和多种靶标的多功能分析。近年来，基于表面增强拉曼散射（sers）、电化学和荧光等，开发了用于检测afb1的适体传感器。在这些传感器中，荧光传感器由于操作简单，灵敏度高等优点在化学领域得到了广泛的应用。
5.综上所述，基于核酸适体的荧光传感器方法具有相对显著的优势，特异性强、操作简单、稳定性好，具有相当好的应用前景。


技术实现要素：

6.一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶iii的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素b1一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶iii的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素b1，其特征在于，包括以下步骤：所述的dna双链的形成：吸取等体积的黄曲霉毒素b1的适体a1与互补链c1于100~200 μl离心管中，通过恒温振荡的方式以碱基互补配对的方式结合。
7.所述的荧光适体传感器首先是形成afb1的适体链a1与互补链c1的dna双链。当样本中含有afb1时，适体链a1与afb1结合，部分互补链被释放，使得互补链c1和标记有荧光染料的dna链d1结合。此时，加入核酸外切酶iii，并加入雪花状碳氮复合材料，由于互补链c1与dna链d1形成的dna双链（dsdna）中带负电荷的磷酸骨架内碱基的有效屏蔽，使得dsdna不能吸附在雪花状碳氮复合材料上，从而造成响应信号的变化。由此，得到了一种基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶iii检测黄曲霉毒素b1的荧光适体传感器。
8.所述的互补链c1的序列为c1-1：5
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tgtgggcctagcgactccacaata-3’或c1-2：5
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tgtgggcctaggactccacaata-3’或c1-3：5
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tgtgggcctagcactccacaata-3’。
9.所述的dna链d1的3’端荧光基团分别为cy3，cy5，fam，rox，alexa fluor 488，alexa fluor 594中的一种。
10.所述的dna链d1的序列为d1-1：5
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ctaggcccaca-3’或d1-2：5
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ggagtcgctag-3’或d1-3：5
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tattgtggagt
ꢀ‑3’
。
11.所述的雪花状碳氮复合材料为雪花状碳氮钯、雪花状碳氮铁、雪花状碳氮硫中的一种。
12.所述的afb1的适体a1的序列为5
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gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccaca-3’。
13.所述的恒温振荡温度为20~50℃，时间为1~2 h。
14.所述的afb1的适体a1及其互补链c1的总体积范围在10 μl～20 μl，浓度范围在1 μmol/l~5 μmol/l。
15.所述的缓冲液为tris-hcl，pbs，hepes中的一种或两种，体积范围在0.5 μl～10 μl，ph范围在6.0～8.0。
16.所述的afb1的孵育时间为0.5 h~1.5 h。
17.所述的核酸外切酶iii的用量为1~5 u，孵育时间为0.5 h~2.5 h。
18.所述的雪花状碳氮复合材料的浓度为1~5 mg/ml。
19.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
20.图1为基于雪花状碳氮复合材料及核酸外切酶iii的荧光适体传感器检测黄曲霉毒素b1传感器制备示意图。
具体实施方式
21.下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
22.实施例1具体步骤如下：（1）双链dna的形成：准确吸取1 μmol/l黄曲霉毒素b1的适体a1与互补链c1-1各10 μl于200 μl离心管中，涡旋充分混匀，置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h。
23.（2）加入10 μl不同浓度的黄曲霉毒素b1置于37℃恒温振荡仪中振荡0.5 h。待充分振荡后，加入5 u核酸外切酶iii，10 μl 2 mg/ml的雪花状碳氮钯复合材料和10 μl 1 μmol/l dna链d1-2：5
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ggagtcgctag-fam-3’，再置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h。孵育完成后，用ph=8.0的tris-hcl缓冲液补充溶液体积至200 μl。设置激发波长为490 nm，发射波长测量范围510~600 nm，在荧光分光光度计下记录520 nm发射波长时的荧光强度。
24.（3）为评价该传感器在食品基质中应用的可行性，经过前处理制备玉米粉的加标样品处理液，通过最优条件下制备的传感器检测处理液中afb1含量，计算加标回收率。取5.0 g玉米粉末并加入不同浓度的afb1，然后与25 ml的萃取溶剂(甲醇：水，7：3(v/v)) 混
合。然后，将样品充分震荡30 min，之后以5000 r/min的速度离心10 min，用0.45 μm的有机滤膜过滤上清液，使用tris-hcl缓冲液将滤液稀释至10倍。由此分别制备出0.5 ng/ml、2 ng/ml、20 ng/ml的加标样品。设置激发波长为490 nm，发射波长测量范围510~600 nm，在荧光分光光度计下记录520 nm发射波长时的荧光强度。
25.实施例2具体步骤如下：（1）双链dna的形成：准确吸取2 μmol/l黄曲霉毒素b1的适体a1与互补链c1-2各5 μl于100 μl离心管中，涡旋充分混匀，置于37℃恒温振荡仪中振荡0.5 h。
26.（2）加入20 μl不同浓度的黄曲霉毒素b1置于37℃恒温振荡仪中振荡1 h。待充分振荡后，加入3 u核酸外切酶iii，10 μl 5 mg/ml的雪花状碳氮硫复合材料和10 μl 2 μmol/l dna链d1-3：5
’‑
ggagtcgctag-cy3-3’，再置于37℃恒温振荡仪中振荡1.5 h。孵育完成后，用ph=7.4的pbs缓冲液补充溶液体积至200 μl。设置激发波长为530 nm，发射波长测量范围540~630 nm，在荧光分光光度计下记录565 nm发射波长时的荧光强度。
27.所制备的荧光适体传感器对黄曲霉毒素b1的检测具有准确度高，线性范围宽（0.01~50 ng/ml），检测下限低（0.006 ng/ml）的特点。同时，对实际样品（如玉米粉）的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。
28.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
29.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。