尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段在妊娠糖尿病中的应用

1.本发明涉及尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段在妊娠糖尿病患者诊治和血糖及代谢状态监测、评估和机理研究等制剂的应用。


背景技术：

2.妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus, gdm）的发病机制主要为孕妇对葡萄糖需求增加、胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足等。血糖控制欠佳的gdm患者妊娠期流产、早产、剖宫产、高血压疾病等不良妊娠结局发生率明显高于正常孕妇，而且，gdm患者分娩的新生儿发生低血糖、免疫功能低下、巨大儿、新生儿高胆红素血症、新生儿呼吸窘迫综合征和窒息等不良并发症发生率也明显升高。鉴于gdm可对母婴产生诸多不良预后，希望运用尿液蛋白质组学的临床优势，结合空腹血糖、糖化血红蛋白等临床常用指标，寻找能够反映gdm患者体内糖代谢控制状态和胎儿糖代谢及生长发育情况的生物标记物，实现预防并降低新生儿低血糖造成的损伤、降低巨大儿发生率，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
3.非分泌核糖核酸酶（non-secretory ribonuclease，rnase2）是一种嘧啶特异性核酸酶，具有多种生物活性。rnase2相关报道较少，主要集中在人rnase2的分离纯化及结构研究方面。本研究发现，随着gdm患者hba1c水平的升高，尿液rnase2表达量增加，相关机制有待进一步研究。
4.与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻gdm患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助gdm患者及胎儿代谢状态的监测与评估。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段在制备用于妊娠糖尿病患者诊治和血糖及代谢状态监测、预后及机理研究等制剂的应用。优选地，所述尿液非分泌核糖核酸酶蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示（mvpklftsqiclllllgllavegslhvkppqftwaqwfetqhinmtsqqctnamqvinnyqrrcknqntfllttfanvvn vcgnpnmtcpsnktrknchhsgsqvplihcnlttpspqnisncryaqtpanmfyivacdnrdqrrdppqypvvpvhldrii）；或由seq id no.1所示的氨基酸序列衍生的，且与seq id no.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
6.优选地，所述制剂为妊娠糖尿病患者尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段检测试剂盒。
7.优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
8.优选地，所述试剂盒包括直接检测非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
9.优选地，所述试剂盒包括直接检测非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
10.优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
11.优选地，所述标准品包括非分泌核糖核酸酶蛋白标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：非分泌核糖核酸酶蛋白质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
12.优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
13.发明人首先收集了妊娠糖尿病患者孕早期的尿液标本，离心后取上清，根据fpg水平分为gm1、gm2组；hba1c水平分为bm1、bm2组。利用弱阳离子交换磁珠纯化和分离尿液标本。将 1μl标本与10μl基质混匀后，取1μl点在 anchorchip靶板上，标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱多肽图。应用bioexplorer分析软件对妊娠糖尿病不同组别的所有质谱图进行分析，筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定，在数据库检索得到差异表达的非分泌核糖核酸酶蛋白。
14.本发明通过研究证实，非分泌核糖核酸酶蛋白随着hba1c水平的升高而升高，差异具有统计学意义。从而提出检测尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段可用于妊娠糖尿病患者诊治和血糖及代谢状态的监测和评估。
15.本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段。
16.为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
17.附图说明
18.图1是bm1和bm2组妊娠糖尿病患者尿液非分泌核糖核酸酶蛋白表达的散点图。
具体实施方式
19.实施例1 尿液标本的收集与处理收集首都医科大学附属北京世纪坛医院产科门诊及住院的74例妊娠糖尿病（gdm）
c12。通过毛细管高效液相色谱分离样品，q-exactive质谱仪（thermo）进行分析。离子源电压3.5kv，分析时间120min，母离子扫描范围为300-2000m/z。按照以下方法收集多肽和多肽片段的质荷比:每次完整扫描后收集20个片段（ms2scan，hcd）。在m/z 200下，ms1分辨率为70,000，ms2的分辨率17,500。使用数据分析软件pd（proteome discoverer 1.4，thermo）进行检索。检索数据库为mascot。母离子误差设定为20ppm，碎片离子误差设为1da，酶切方式为非酶切,可变修饰为oxidation（m）蛋氨酸的氧化。数据卡值，percolator算法，fdr≤1%。差异表达的质荷比（m/z）1744.4的多肽峰在数据库中检索鉴定为非分泌核糖核酸酶蛋白。
24.非分泌核糖核酸酶蛋白表达均随着hba1c水平的升高而升高；如图1所示，bm1和bm2组间，该蛋白表达差异具有统计学差异(p《0.05)。
25.虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。


技术特征：
1.尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段在制备用于妊娠糖尿病患者诊治和血糖及代谢状态监测、评估和机理研究等制剂的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液非分泌核糖核酸酶蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；或由seq id no.1所示的氨基酸序列衍生的，且与seq id no.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为妊娠糖尿病患者尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括直接检测非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括直接检测非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段或其相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品包括非分泌核糖核酸酶蛋白标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：非分泌核糖核酸酶质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

技术总结
本发明提供一种尿液非分泌核糖核酸酶（Non-secretory ribonuclease,RNASE2）蛋白及其多肽片段的应用，具体为尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段在制备用于妊娠糖尿病患者诊治和血糖及代谢状态监测、评估和机理研究等制剂的应用。本发明通过研究证实，尿液非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段在妊娠糖尿病患者中随着HbA1c水平的升高而升高，在HbA1c≤5.1%的BM1组和HbA1c＞5.1%的BM2组中差异具有统计学意义，可用于妊娠糖尿病患者诊治和血糖及代谢状态监测、评估和机理研究等各种目的应用检测。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段。测非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段。测非分泌核糖核酸酶蛋白及其多肽片段。


技术研发人员：张曼 胡智颖
受保护的技术使用者：首都医科大学附属北京世纪坛医院
技术研发日：2020.11.12
技术公布日：2022/5/16