草铵膦及其代谢物的测定试剂盒及其制备方法和测定方法与流程

1.本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种测定牛奶中草铵膦及其代谢物残留量的试剂盒及其制备方法，以及使用该试剂盒检测牛奶中草铵膦及其代谢物残留量的方法。


背景技术：

2.草铵膦是一种广谱、触杀型灭生性有机磷类除草剂，具有高效、低毒等特点，是目前用量仅次于草甘膦的世界第二大类广泛使用的除草剂。其除草机理为特异性的抑制植物体内谷氨酰胺合成酶活性，导致植物体氮代谢紊乱，光合作用受抑制而死亡。此外，草铵膦同样可以抑制动物体内谷氨酰胺合成酶活性，造成氮代谢紊乱，从而导致动物神经中毒。草铵膦在环境和生物体内不断富集，通过食品进入人的体内，其母体及代谢物质对人体造成一定的危害。动物体内草铵膦主要代谢产物为3-(甲基膦基)丙酸和n-乙酰基草铵膦。牛奶作为仅次于母乳的营养成份最全、营养价值最高的液体食品，其食品安全受到消费者的广泛关注。中华人民共和国国家标准gb2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中明确规定：生乳中草铵膦及其代谢物3-(甲基膦基)丙酸和n-乙酰基草铵膦的总和不超过0.02mg/kg。目前，果蔬、茶叶、植物油等农产品有相关配套的检测标准及方法，而牛奶中草铵膦及其代谢物的测定并无配套的检测标准及方法。因此，急需一种适合检测牛奶中农药残留的简单、快速、准确的检测方法。
3.目前，食品中草铵膦的检测方法有酶联免疫法、毛细管电泳法、气相色谱质谱联用法、液相色谱质谱联用法等。其中液相色谱质谱联用法具有方法稳定、定量准确、可同时检测草铵膦及其代谢物的优点。目前检测草铵膦及其代谢物的前处理方法大多数为衍生法，操作步骤繁多、耗时较长，而非衍生法同时检测牛奶中草铵膦及其代谢物3-(甲基膦基)丙酸和n-乙酰基草铵膦的相关文献未见报道。
4.研究开发一种结果准确、操作简便、价格低廉、易于推广的lc-ms/ms定量牛奶中草铵膦及其代谢物的试剂盒，使其能广泛应用于我国牛奶农药残留检测中，通过准确定量牛奶中草铵膦及其代谢物浓度实现为优质奶源保驾护航。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于液相色谱串联质谱技术的试剂盒，能同时对牛奶中草铵膦及代谢物3-(甲基膦基)丙酸和n-乙酰基草铵膦进行定量检测，以满足牛奶中农药残留检测的需要。
6.根据本发明的一个方面，提供一种测定牛奶中草铵膦及其代谢物残留量的试剂盒，包括特定浓度的标准曲线牛奶样本、质控牛奶样本、内标液、前处理净化装置和流动相调节液。
7.优选地，所述代谢物包括3-(甲基膦基)丙酸和n-乙酰基草铵膦；所述内标液包括草铵膦-d3。
8.优选地，所述标准曲线牛奶样本和质控牛奶样本独立地包括空白牛奶样本净化液、草铵膦、3-(甲基膦基)丙酸、n-乙酰基草铵膦和草铵膦-d3。
9.优选地，所述前处理净化装置由离心管和其中容纳的多壁碳纳米管构成。
10.优选地，所述流动相调节液包括甲酸水溶液和甲酸-乙腈溶液。
11.根据本发明的另一个方面，提供一种上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
12.分别配制草铵膦储备液和草铵膦代谢物的储备液，并由所述草铵膦储备液及草铵膦代谢物储备液稀释得到草铵膦稀释液及草铵膦代谢物稀释液，再由所述草铵膦稀释液及草铵膦代谢物稀释液稀释得到草铵膦中间液及草铵膦代谢物中间液；
13.由草铵膦-d3配制草铵膦-d3内标储备液，并由所述草铵膦-d3内标储备液稀释得到草铵膦-d3稀释液，再由所述草铵膦-d3稀释液稀释得到草铵膦-d3内标液；
14.分别由不同浓度的所述草铵膦中间液及草铵膦代谢物中间液、草铵膦-d3内标液、空白牛奶样本净化液配制标准曲线牛奶样本和质控牛奶样本；
15.将多壁碳纳米管置于离心管中制备前处理净化装置；
16.净化空白牛奶样本，得到空白牛奶样本净化液；和
17.配制流动相调节液。
18.优选地，净化空白牛奶样本包括将空白牛奶样本置于所述前处理净化装置中；加入甲醇，进行提取，离心分离得到空白牛奶样本上清液；将所述空白牛奶样本上清液经过滤，得到空白牛奶样本净化液。
19.根据本发明的又一个方面，提供一种牛奶中草铵膦及其代谢物残留量的测定方法，使用上述试剂盒进行。
20.优选地，所述测定方法包括以下步骤：
21.将待测牛奶样本置于前处理净化装置中，加入内标液和甲醇，进行提取，离心分离得到待测牛奶样本上清液；
22.将所述待测牛奶样本上清液经过过滤，得到滤液；
23.将所述滤液用于液相色谱-质谱/质谱检测。
24.优选地，液相色谱采用沃特世阴离子极性农残色谱柱(waters anionic polar pesticide)作为固定相色谱柱，用甲酸水溶液和甲酸-乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱；质谱采用电喷雾离子源，和负离子模式。
25.优选地，质谱的离子选择通道分别为m/z：草铵膦180.09》94.94，180.09》84.98；草铵膦-d
3 182.94》97.92，182.94》85.00；3-(甲基膦基)丙酸151.05》132.97，151.05》107.02；和n-乙酰基草铵膦222.0》136.06，222.0》59.07。
26.优选地，所述测定方法还包括：
27.利用标准曲线牛奶样本、内标液的峰面积和浓度绘制标准曲线；
28.确定标准曲线方程；
29.将质控牛奶样本测定的草铵膦或草铵膦代谢物的峰面积代入所述标准曲线方程，计算质控牛奶样本中草铵膦或草铵膦代谢物的回收率；
30.将待测牛奶样本测定的草铵膦或草铵膦代谢物的峰面积代入所述标准曲线方程，计算待测牛奶样本中草铵膦或草铵膦代谢物的残留量。
31.本发明的试剂盒，草铵膦测试灵敏度可达3μg/kg，草铵膦代谢物灵敏度可达5μg/
kg。各项方法学指标均可满足牛奶中草铵膦及其代谢物浓度快速定量检测的需要。使用根据本发明的试剂盒的测定方法能够采用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)技术对牛奶中草铵膦及其代谢物进行准确定量检测，检测结果为草铵膦、3-(甲基膦基)丙酸和n-乙酰基草铵膦浓度，更准确地说明牛奶中草铵膦及其母体代谢后的物质之间的关系，通过准确定量牛奶中草铵膦及其代谢物的浓度为优质奶源的保驾护航。
附图说明
32.参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：
33.图1示出了根据本发明的草铵膦及其代谢物牛奶样本前处理和质谱检测流程图；
34.图2示出了lc-ms/ms测定空白牛奶样本净化液配制标准曲线牛奶样本的10ng/ml浓度点草铵膦及其代谢物的多反应监测(mrm)色谱图，如图2a、图2b、图2c、图2d，各自包括上下两个色谱峰，分别是定量离子对色谱图和定性离子对色谱图；
35.图3示出了对比图，其中a为不含草铵膦的对照牛奶样本和含草铵膦的质控牛奶样本，b为不含3-(甲基膦基)丙酸的对照牛奶样本和含3-(甲基膦基)丙酸的质控牛奶样本，c为不含n-乙酰基草铵膦的对照牛奶样本和含n-乙酰基草铵膦的质控牛奶样本；
36.图4示出了标准曲线图，其中a为草铵膦的典型标准曲线图；b为3-(甲基膦基)丙酸的典型标准曲线图；c为n-乙酰基草铵膦的典型标准曲线图。
具体实施方式
37.为了更加清楚地理解本发明的技术特征、目的和有益效果，现对本发明的技术方案进行进一步的详细说明。应理解，以下具体实施方式仅是示例性的，本发明的技术方案不限于以下所列举的具体实施方式。
38.本发明提供的测定牛奶中草铵膦及其代谢物残留量的试剂盒，包括特定浓度的标准曲线牛奶样本、质控牛奶样本、内标液、前处理净化装置和流动相调节液。
39.本发明中草铵膦的代谢物包括3-(甲基膦基)丙酸和n-乙酰基草铵膦；内标液包括草铵膦-d3。
40.标准曲线牛奶样本和质控牛奶样本独立地包括空白牛奶样本净化液、草铵膦、3-(甲基膦基)丙酸、n-乙酰基草铵膦和草铵膦-d3。
41.本发明的试剂盒是一种采用lc-ms/ms测定牛奶中草铵膦及其代谢物浓度的新型试剂盒。试剂盒以草铵膦-d3为草铵膦的内标，用甲醇对待测牛奶样本进行提取、沉淀蛋白前处理，将全部液体转入前处理净化瓶中，震荡涡旋，高速离心，取上清液过膜进行lc-ms/ms检测。记录草铵膦和内标的峰面积，采用内标法，根据待测样本中的草铵膦/内标峰面积比值即可计算出草铵膦浓度。记录3-(甲基膦基)丙酸和n-乙酰基草铵膦的峰面积，采用外标法，根据待测样本中的3-(甲基膦基)丙酸或n-乙酰基草铵膦峰面积即可计算出3-(甲基膦基)丙酸或n-乙酰基草铵膦浓度。
42.根据本发明的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
43.分别配制草铵膦及其代谢物的储备液，并由草铵膦及其代谢物的储备液稀释得到草铵膦及其代谢物的稀释液，再由草铵膦及其代谢物的稀释液稀释得到草铵膦及其代谢物
的中间液；
44.由草铵膦-d3配制草铵膦-d3内标储备液，并由草铵膦-d3内标储备液稀释得到草铵膦-d3稀释液，再由草铵膦-d3稀释液稀释得到草铵膦-d3内标液；
45.分别由不同浓度的草铵膦及其代谢物的中间液、草铵膦-d3内标液、空白牛奶样本净化液配制标准曲线牛奶样本和质控牛奶样本；
46.将多壁碳纳米管置于离心管中制备前处理净化装置；
47.将待测牛奶样本置于前处理净化装置中，加入甲醇，进行提取，离心分离得到上清液，将该上清液经过滤，得到空白牛奶样本净化液；和
48.配制流动相调节液。
49.前处理净化装置中的多壁碳纳米管吸附能力强，具有更好的净化作用。
50.根据一个具体实施方式，本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤：
51.草铵膦及其代谢物储备液、草铵膦及其代谢物中间液、草铵膦-d3内标液的配制：分别准确称取草铵膦、3-(甲基膦基)丙酸、n-乙酰基草铵膦标准品10.00mg于100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，配制成浓度为100μg/ml的草铵膦、3-(甲基膦基)丙酸、n-乙酰基草铵膦标准储备液。分别精密量取草铵膦、3-(甲基膦基)丙酸、n-乙酰基草铵膦标准储备液1ml到100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，配制成浓度为1μg/ml的稀释液。精密量取稀释液10ml到100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，配制成浓度为100ng/ml草铵膦及其代谢物中间液。准确称取草铵膦-d3内标标准品10.00mg于100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，配制成浓度为100μg/ml的草铵膦-d3内标标准储备液。精密量取草铵膦-d3内标标准储备液1ml到100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，配制成浓度为1μg/ml的稀释液。精密量取稀释液10ml到100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，配制成浓度为100ng/ml草铵膦-d3内标液。
52.标准曲线牛奶样本、质控牛奶样本的配制：分别精密量取草铵膦及其代谢物中间液0ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2.5ml，分别置于10ml容量瓶中，分别加入1ml草铵膦-d3内标液(100ng/ml)，加空白牛奶样本净化液稀释至刻度，所配制草铵膦及其代谢物标准曲线牛奶样本浓度分别为0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml系列标准溶液，且工作液各浓度点中，内标浓度为10ng/ml，分装，贴标签记，完成操作。称取5g牛奶空白样本于15ml离心管中，分别精密量取草铵膦及其代谢物中间液0.25ml、0.5ml、1ml、2ml转移到离心管中，分别加入0.15ml草铵膦-d3内标液，所配制草铵膦及其代谢物质控牛奶样本浓度分别为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg，分装，贴标签记，完成操作。
53.前处理净化装置的制备：精确称量10mg多壁碳纳米管(mwcnts)放置于50ml离心管中，加盖后贴标签记，完成操作。
54.流动相调节液的配制：量取9.0ml酸，转移到1000ml容量瓶，用水定容至刻度，混合均匀，超声，配制成0.9％甲酸水溶液。量取9.0ml甲酸，转移到1000ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混和均匀，超声，配制成0.9％甲酸-乙腈溶液。贴标签记，完成操作。
55.根据本发明的又一个具体实施方式，提供一种使用上述试剂盒检测牛奶中草铵膦及其代谢物残留量的方法。
56.具体地，该方法包括以下步骤：
57.将待测牛奶样本置于前处理净化装置中，加入内标液和甲醇，进行提取，离心分离得到上清液；
58.将上清液经过过滤，得到滤液；
59.将滤液用于液相色谱-质谱/质谱检测。
60.其中，上述上清液优选通过0.22μm有机系滤膜过滤。
61.在本发明中，液相色谱采用waters anionic polar pesticide作为固定相色谱柱，用甲酸水溶液和甲酸-乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱；质谱采用电喷雾离子源，和负离子模式。
62.综上所述，本发明的草铵膦及其代谢物残留量的测定方法简单易行，可用于牛奶中草铵膦及其代谢物残留量的检测，并且本测定方法快速、准确，具有一定的推广价值。
63.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
64.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
65.实施例
66.实施例1
67.(1)使用的仪器
68.液相色谱串联质谱仪(lc-ms/ms)
69.(2)样本要求
70.采集母牛牛奶样本，置于采样瓶中，立即放置2-8℃冰箱存封备用。
71.(3)检验方法
72.(3-1)牛奶样本前处理：
73.称取均质牛奶样本5g置于前处理净化瓶中，加入0.15ml草铵膦-d3内标液，加入10ml甲醇，涡旋震荡10min，15 000r/min 4℃离心10min。准确吸取1.0ml上清液于1.5ml离心管中，20000r/min离心10min。上清液过0.22μm有机系滤膜，滤液供液相色谱-质谱/质谱检测。
74.(3-2)质谱条件：
75.电离模式：电喷雾负离子模式(esi-)；毛细管电压：2.8kv；源温：150℃；脱溶剂温度：600℃；脱溶剂气流量：1000l/hr；碰撞室气流量：0.15ml/min。其它质谱参数见表1。表1草铵膦-d3、草铵膦及其代谢物的质谱参数
76.(3-2)色谱条件：
77.色谱柱：waters农残专用柱：anionic polar pesticide 2.1*150mm column,5μm；柱温：50℃；进样量：10μl。流动相梯度及流速见表2。表2液相色谱梯度洗脱条件
78.(3-3)测定方法：
79.如图1所示，取质控牛奶样本和待测牛奶样本进行样本前处理后，取滤液和标准曲线牛奶样本进样10μl进行lc-ms/ms定量分析。
80.(3-4)质控要求：
81.每分析一批样本随行1条标准曲线牛奶样本、1个空白牛奶样本，1个过程空白，6个质控牛奶样本(高中低浓度各2个)，其中图2为空白牛奶样本净化液配制标准曲线牛奶样本的10ng/ml浓度点草铵膦及其代谢物的多反应监测(mrm)色谱图，每个多反应监测(mrm)色谱图包括上下两个色谱峰，分别是定量离子对色谱图和定性离子对色谱图，具体见图2a、图2b、图2c、图2d；其中图3示出了对比图，其中图3a为空白牛奶样本和草铵膦的质控牛奶样本对比图(180.09》94.94，180.09》84.98)；图3b为空白牛奶样本和3-(甲基膦基)丙酸的质控牛奶样本对比图(151.05》132.97，151.05》107.02)，图3c为不含n-乙酰基草铵膦的空白牛奶样本和n-乙酰基草铵膦的质控牛奶样本对比图(222》136.06，222》59.07)。
82.根据国标gb/t 27404-2008实验室质量控制规范中的要求，质控样本测定结果偏差应小于10％。
83.计算结果：
84.标准曲线绘制：以7个标准曲线样本的标示浓度(0ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)为横坐标(x)，以7个草铵膦标准曲线样本的实测峰面积与其内
标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线；以7个标准曲线样本的标示浓度(0ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)为横坐标(x)，以7个3-(甲基膦基)丙酸和(n-乙酰基草铵膦)标准曲线样本的实测峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。
85.标准曲线方程的拟合：以7个草铵膦标准曲线样本的实测峰面积与其内标峰面积的比值为纵坐标(以7个3-(甲基膦基)丙酸、(n-乙酰基草铵膦)标准曲线样本的实测峰面积为纵坐标)(y)对标示浓度(x)加权最小二乘法进行线性回归。拟合线性回归方程：y＝ax b，其中a为斜率，b为截距，并计算相关系数(r2)，r2应不低于0.9900。草铵膦标准曲线见图4a，r2＝0.997，3-(甲基膦基)丙酸标准曲线见图4b，r2＝0.997，和n-乙酰基草铵膦标准曲线见图4c，r2＝0.998，均满足r2》0.99，关于标准曲线线性相关规定。
86.回收率的计算：将质控样本测定的草铵膦及其代谢物(3-(甲基膦基)丙酸、n-乙酰基草铵膦)的值带入上述标准曲线方程，计算质控样本的草铵膦及其代谢物测定浓度。质控样本回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度*100，回收率(％)范围在82％-102％之间，见表3，满足60％-120％范围，质控样本测定结果偏差在1.29％-5.93％之间，小于10％。
87.样本计算结果：将样本的草铵膦及其代谢物的值带入标准曲线方程，计算样本的草铵膦及其代谢物浓度。
88.以上所述仅仅是本发明的优选实施方式。应当指出的是，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域技术人员可对本发明的细节和特征进行各种修改、组合、变更或替换。这些修改、组合、变更或替换也应理解为包括在本发明要求保护的范围之内。