尿液补体C3蛋白及其多肽片段在妊娠糖尿病及新生儿评价中的应用

尿液补体c3蛋白及其多肽片段在妊娠糖尿病及新生儿评价中的应用
技术领域
1.本发明涉及尿液补体c3蛋白及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液补体c3蛋白及其多肽片段在妊娠糖尿病诊治及新生儿评价包括血糖和代谢状态监测、评估及机理研究等制剂的应用。


背景技术：

2.妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus, gdm）的发病机制主要为孕妇对葡萄糖需求增加、胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足等。血糖控制欠佳的gdm患者妊娠期流产、早产、剖宫产、高血压疾病等不良妊娠结局发生率明显高于正常孕妇，而且，gdm患者分娩的新生儿发生低血糖、免疫功能低下、巨大儿、新生儿高胆红素血症、新生儿呼吸窘迫综合征和窒息等不良并发症发生率也明显升高。鉴于gdm可对母婴产生诸多不良预后，希望运用尿液蛋白质组学的临床优势，结合空腹血糖、糖化血红蛋白等临床常用指标，寻找能够反映gdm患者体内糖代谢控制状态和胎儿糖代谢及生长发育情况的生物标记物，实现预防并降低新生儿低血糖造成的损伤、降低巨大儿发生率，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
3.糖尿病与补体途径激活增加有关。在正常人类怀孕期间，补体分裂蛋白水平增加。最近的研究证据表明，不受限制的补体激活可能在几种妊娠疾病的病理生理学中发挥作用，包括妊娠丢失、人类分娩、感染相关的早产和子痫前期。gdm相关研究指出，gdm患者补体c3水平比健康妊娠妇女低，可能导致免疫复合物的清除缺陷。免疫复合物可能沉积在附近组织中并引起炎症反应。这与妊娠期糖尿病与低度炎症相关。本研究显示，随着gdm患者fpg和hba1c水平的升高，尿液中补体c3水平随之升高。考虑，随着gdm患者fpg和hba1c水平的升高，内皮功能障碍等微血管并发症及炎症状态加重，补体系统过度激活，尿液中补体水平随之升高。尿液补体c3水平可用于评估gdm患者血糖代谢状态。
4.gdm与新生儿低血糖及巨大儿的相关研究已较多。母体高血糖症导致了胎儿的高血糖症, 由此引起胎儿胰岛素生成增加及胰腺过度刺激，导致胎儿高胰岛素血症。胎儿对胰岛素分泌进行调节，实现对葡萄糖的代谢。在这一过程中，胎儿的生长激素分泌也增加，是巨大儿出现的原因。当胎儿娩出后，来自母亲的葡萄糖供应突然中断，但胎儿高胰岛素血症仍然存在, 从而导致新生儿低血糖。与正常妊娠孕妇相比，gdm患者分娩新生儿低血糖的发生率高达27%，分娩巨大儿发生率高达25-40%。随着gdm患者fpg和hba1c水平的升高，尿液中c3水平升高，患者分娩的新生儿nfpg水平越低，新生儿nw越高，即gdm患者尿液中补体c3水平与新生儿nfpg倒数、nw的变化趋势吻合度良好。提示，gdm患者尿液中补体c3水平可以作为预测新生儿低血糖和巨大儿的间接指标。
5.与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多
肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻gdm患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助gdm患者及新生儿代谢状态的监测与评估。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种尿液补体c3蛋白及其多肽片段在制备用于妊娠糖尿病诊治及新生儿评价包括血糖和代谢状态监测、预后及机理研究等制剂的应用。优选地，所述尿液补体c3蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示(mgptsgpsllllllthlplalgspmysiitpnilrlesee tmvleahdaqgdvpvtvtvh dfpgkklvlssektvltpat nhmgnvtftipanrefksekgrnkfvtvqatfgtqvvekv vlvslqsgylfiqtdktiytpgstvlyriftvnhkllpvg rtvmvnienpegipvkqdslssqnqlgvlplswdipelvn mgqwkirayyenspqqvfstefevkeyvlpsfevivepte kfyyiynekglevtitarflygkkvegtafvifgiqdgeq rislpeslkripiedgsgevvlsrkvlldgvqnpraedlv gkslyvsatvilhsgsdmvqaersgipivtspyqihftkt pkyfkpgmpfdlmvfvtnpdgspayrvpvavqgedtvqsltqgdgvaklsinthpsqkplsitvrtkkqelseaeqatrtmqalpystvgnsnnylhlsvlrtelrpgetlnvnfllrmd raheakiryytylimnkgrllkagrqvrepgqdlvvlpls ittdfipsfrlvayytligasgqrevvadsvwvdvkdscv gslvvksgqsedrqpvpgqqmtlkiegdhg arvvlvavdk gvfvlnkknkltqskiwdvvekadigctpgsgkdyagvfs dagltftsssgqqtaqraelqcpqpaarrrrsvqltekrm dkvgkypkelrkccedgmrenpmrfscqrrtrfislgeac kkvfldccnyitelrrqharashlglarsnldediiaeen ivsrsefpeswlwnvedlkeppkngistklmniflkdsittweilavsmsdkkgicvadpfevtvmqdffidlrlpysvv rneqveiravlynyrqnqelkvrvellhnpafcslattkr rhqqtvtippksslsvpyvivplktglqevevkaavyhhf isdgvrkslkvvpegirmnktvavrtldperlgregvqke dippadlsdqvpdtesetrillqgtpvaqmtedavdaerlkhlivtpsgcgeqnmigmtptviavhyldeteqwekfgle krqgalelikkgytqqlafrqpssafaafvkrapstwlta yvvkvfslavnliaidsqvlcgavkwlilekqkpdgvfqe dapvihqemigglrnnnekdmaltafvlislqeakdicee qvnslpgsitkagdfleanymnlqrsytvaiagyalaqmg rlkgpllnkflttakdknrwedpgkqlynveatsyallal lqlkdfdfvppvvrwlneqryygggygstqatfmvfqala qyqkdapdhqelnldvslqlpsrsskithrihwesasllr seetkenegftvtaegkgqgtlsvvtmyhakakdqltcnk fdlkvtikpapetekrpqdakntmileictryrgdqdatmsildismmtgfapdtddlkqlangvdryiskyeldkafsd rntliiyldkvshseddclafkvhqyfnveliqpgavkvy ayynleesctrfyhpekedgklnklcrdelcrcaeencfi qksddkvtleerldkacepgvdyvyktrlvkvqlsndfde yimaieqtiksgsdevqvgqqrtfispikcrealkleekk hylmwglssdfwgekpnlsyiigkdtwvehwpeedecqde enqkqcqdlgaftesmvvfgcpn）；或由seq id no.1所示的氨基酸序列衍生的，且与seq id no.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
7.优选地，所述制剂为妊娠糖尿病患者尿液补体c3蛋白及其多肽片段检测试剂盒。
8.优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合补体c3蛋白及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
9.优选地，所述试剂盒包括直接检测补体c3蛋白及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
10.优选地，所述试剂盒包括直接检测补体c3蛋白及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
11.优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
12.优选地，所述标准品包括补体c3蛋白标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：补体c3蛋白质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
13.优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
14.发明人首先收集了妊娠糖尿病患者孕早期的尿液标本，离心后取上清，根据fpg水平分为gm1、gm2组；hba1c水平分为bm1、bm2组。利用弱阳离子交换磁珠纯化和分离尿液标本。将 1μl标本与10μl基质混匀后，取1μl点在 anchorchip靶板上，标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱多肽图。应用bioexplorer分析软件对妊娠糖尿病不同组别的所有质谱图进行分析，筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定，在数据库检索得到差异表达的补体c3蛋白。
15.本发明通过研究证实，补体c3蛋白随着fpg和hba1c水平的升高而升高，差异均具有统计学意义。尿液补体c3蛋白及其多肽片段均与新生儿空腹血糖（nfpg）倒数、新生儿身高（nh）和新生儿体重（nw）变化趋势相同。从而提出检测尿液补体c3蛋白及其多肽片段可用于妊娠糖尿病患者诊治及新生儿评价包括血糖及代谢状态的监测和评估。
16.本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测补体c3蛋白及其多肽片段。
17.为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
18.图1是尿液补体c3蛋白分别在bm和gm分组中与新生儿空腹血糖倒数、身高、体重趋势图；图2是bm1和bm2组妊娠糖尿病患者尿液补体c3蛋白表达的散点图；图3是gm1和gm2组妊娠糖尿病患者尿液补体c3蛋白表达的散点图。
具体实施方式
19.实施例1 尿液标本的收集与处理收集首都医科大学附属北京世纪坛医院产科门诊及住院的74例妊娠糖尿病（gdm）患者早孕期（8-12周）的清洁中段尿液标本，年龄为24岁～42岁。妊娠期糖尿病患者符合2011年美国糖尿病协会（ada）的糖尿病诊疗标准，自早孕期至产后42天的所有临床资料齐全，孕24～28周行75g 糖ogtt试验。不合并急慢性感染性、肿瘤、心血管疾病和严重肝肾功能障碍， 74位妊娠期糖尿病患者根据空腹血糖（fpg）和糖化血红蛋白（hba1c）水平分为：
gm1组（fpg＜4.50mmol/l）和gm2（fpg≥4.50 mmol/l）组；bm1组hba1c≤5.1%；bm2组hba1c》5.1%。尿液收集后，400
×
g离心5min，取上清，分装，-80℃冻存。同时，为了追踪相同gdm患者在妊娠中期和妊娠晚期的尿液多肽分泌差异，74位gdm患者中有30名患者同时留取了妊娠中期（gdm-m组，24～27周）和妊娠晚期（gdm-l组，28～41周）的尿液样本。研究对象的临床特征见表1-1所示。
20.表1-1 一般临床资料比较（x
±
s）注：alb/cr表示尿微量白蛋白与肌酐的比值《30
21.实施例2 磁珠纯化和尿液多肽的筛选利用弱阳离子交换磁珠富集尿液中的多肽，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（maldi-tof ms）分析尿液中的多肽谱。用标准品校正仪器后，将1μl洗脱液与10μl基质（0.3 %的α-氰基-4-羟基肉桂酸，hcca）混匀，取1μl点在 anchorchip（autoflex maldi tof，bruker-dalton）靶板上，室温干燥。通过氮激光器照射使标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱图。对于每一个maldi结晶点来说，共照射400次激光（每个结晶点的8个不同的位置各照射50次），平均值代表一个标本，从而得到所有样本的多肽图谱。每个样品进行三个生物学重复。应用bioexplorer分析软件对bm1组和bm2组的质谱图进行分析，筛选差异性多肽。质荷比（m/z）2164的多肽峰的在2组之间差异具有统计学差异（p《0.05）。对gm1组和gm2组的质谱图进行分析，筛选差异性多肽。质荷比（m/z）2164的多肽峰的在2组之间差异具有统计学差异（p《0.05）。
22.实施例3统计分析采用pearson相关性分析对gdm患者的fpg、hba1c和尿液多肽标记物进行相关性，以双侧相关p《0.05为统计学显著性相关。运用spss的fisher判别函数分析模块，建立gdm患者fpg、hba1c水平、尿肽生物标记物峰值以及新生儿血糖（nfpg）、新生儿身高（nh）和新生儿体重（nw）这几个自变量与gdm糖代谢状态的分类判别函数。对gm1和gm2、bm1和bm2组样本进行初次分类，以明确判别分析函数模型的诊断效能。如图1所示，质荷比（m/z）2164的多肽峰均与新生儿空腹血糖（nfpg）倒数、新生儿身高（nh）和新生儿体重（nw）变化趋势相同。
23.实施例4 差异多肽的鉴定及分析从样品管中取20ul用于lc-ms/ms分析。easy-nlc1000 hplc系统用于分离。液相a为0.1％甲酸乙腈溶液（2％乙腈），液相b为0.1％甲酸乙腈溶液（98％乙腈）。100％a溶液平
衡100
×
100mm的behnanoacquity柱，流速400nl/min。色谱喷雾针为pn：fs360-20-10-n-20-c12。通过毛细管高效液相色谱分离样品，q-exactive质谱仪（thermo）进行分析。离子源电压3.5kv，分析时间120min，母离子扫描范围为300-2000m/z。按照以下方法收集多肽和多肽片段的质荷比:每次完整扫描后收集20个片段（ms2scan，hcd）。在m/z 200下，ms1分辨率为70,000，ms2的分辨率17,500。使用数据分析软件pd（proteome discoverer 1.4，thermo）进行检索。检索数据库为mascot。母离子误差设定为20ppm，碎片离子误差设为1da，酶切方式为非酶切,可变修饰为oxidation（m）蛋氨酸的氧化。数据卡值，percolator算法，fdr≤1%。差异表达的质荷比（m/z）2164的多肽峰在数据库中检索鉴定为补体c3蛋白。
24.补体c3蛋白表达随着hba1c水平的升高而升高，如图2所示，bm1和bm2组间，该蛋白表达差异具有统计学差异(p《0.05)；补体c3蛋白表达随着fpg水平的升高而升高，如图3所示，gm1和gm2组间，该蛋白表达差异具有统计学差异(p《0.05)；
25.虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。