一种采用液相色谱-质谱检测血液中泊沙康唑药物浓度的检测方法与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种采用液相色谱-质谱检测血液中泊沙康唑药物浓度的检测方法。


背景技术：

2.泊沙康唑（posaconazole）预防侵袭性曲霉菌和念珠菌感染，适用于预防13岁及以上因重度免疫缺陷而导致侵袭性曲霉菌和念珠菌感染风险增加的患者。这些患者包括接受造血干细胞移植（hsct）后发生移植物抗宿主病（gvhd）的患者或化疗导致长时间中性粒细胞减少症的血液系统恶性肿瘤患者。泊沙康唑的代谢效率随个体的生理情况不同而不同。泊沙康唑血药浓度的检测结果可以作为个性化治疗方案的制定依据。
3.治疗药物监测（therapeutic drug monitoring, tdm）是在药物动力学原理的指导下，应用现代先进的分析技术，测定血液中或其他体液中药物浓度，用于设计或调整给药方案，同时也有助于解释为什么某种药物在常用量时不能产生疗效或发生意外中毒，从而把经验式临床用药提高到科学性较高的水平，以提高药物的疗效和减少不良反应的发生。tdm既是保证治疗充分的重要手段，又是避免过度药物暴露、减少药物相关不良反应的重要措施。液相色谱串联质谱（lc-ms/ms）方法具有特异性强、准确度高、快速测定的特点，常被用来进行药物浓度测定。
4.现有的血药浓度监测试剂盒中的标准品和质控品基质都为同源基质（即人血来源的全血、血清或血浆样本）。但人血的采集在世界范围内都是严格受控的，要经过严格的前期志愿者的招募、体检筛选；要符合伦理要求；要进行血液传染性病毒安全性检测。而且， 《中华人民共和国献血法》第十一条规定，“无偿献血的血液必须用于临床，不得买卖。”以上原因造成无论tdm试剂盒生产或实验室自建方法tdm检测，获得国内人源基质都比较困难。而若从国外进口标准品、质控品成品，成本高、周期长，限制了tdm在国内的开展。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明所要解决的问题在于提供一种基于液相色谱串联质谱（lc-ms/ms）方法对于人体血液中药物浓度的监测，能够准确快速的对血药浓度进行有效监测，实现临床对于药物用药的合理性。
6.本发明的技术方案如下：一种采用液相色谱-质谱检测血液中泊沙康唑药物浓度的检测方法，包括如下步骤：使用采集管采集血液样本并离心处理后，取上层血浆；将所述血浆、泊沙康唑混及甲醇混合后，制得标准品和质控品工作液；采用移液管依次往离心管中加入内标准品工作液、标准品和质控品工作液，以及沉淀剂，混合后涡旋处理；
涡旋结束后，离心管离心处理，移取上清液至进样瓶，获得待测样本溶液，备用；其中，离心处理时，4℃的条件、离心力13000rpm，离心处理15min；分别对液相色谱仪和质谱仪进行工艺参数设置和优化后，使用进样瓶的插管吸取待测样本溶液至液相色谱仪-质谱仪中，进行检测分析；采用标准曲线法，根据待测样本中的泊沙康唑峰面积/内标峰面积比值，计算出血液中泊沙康唑的药物浓度。
7.一实施例，所述检测方法中，所述标准品和质控品工作液制备步骤中还包括如下处理过程：将泊沙康唑与甲醇混匀，配制成泊沙康唑的标准品储备液；取所述泊沙康唑的标准品储备液，加入甲醇混匀，配置成泊沙康唑的质控品储备液；分别量取标准品储备液、质控品储备液以及血浆，混匀，制得标准品和质控品工作液。
8.一实施例，所述检测方法中，所述标准品储备液的制备步骤中，所述标准品储备液中，泊沙康唑的浓度为0.5-2 mg/ml；所述质控品储备液的配制步骤中，所述质控品储备液中，泊沙康唑的浓度为100-500μg/ml；所述标准品和质控品工作液的制备步骤中，泊沙康唑的浓度为35-45μg/ml；其中，所述标准品储备液及质控品储备液之和与血浆的体积比为1:19-1:20；标准品储备液量取10-50μl；质控品储备液量取10-50μl。
9.一实施例，所述检测方法中，所述涡旋处理步骤中，所述内标准品工作液采用如下步骤制得：往装有posaconazole-d5和voriconazole-d3的安瓿瓶中加入甲醇，制备成浓度为1mg/ml的内标准品储备液，并用移液器将所述内标准品储备液全部转移到棕色瓶中，存储，备用；量取所述内标准品储备液和甲醇溶液，配制成10 μg/ml的内标准品工作液。
10.一实施例，所述检测方法中，所述涡旋处理步骤中，所述沉淀剂为甲醇或含有甲醇的其他水溶液。
11.一实施例，所述检测方法中，采用标准曲线法时，还需要制作泊沙康唑的标准曲线，其步骤如下：将泊沙康唑加入甲醇溶剂中，混匀，配制成浓度为1 mg/ml的泊沙康唑标准品储备液；分别量取泊沙康唑标准品储备液加入甲醇溶剂中，混匀，配制成浓度为200μg/ml的泊沙康唑标准品储备液；将泊沙康唑标准品储备液通过进样操作加入到液相色谱-质谱中，绘制出泊沙康唑的标准曲线。
12.一实施例，所述检测方法中，使用液相色谱仪和质谱仪进行检测分析时,质谱仪中的工艺参数设置和优化如下：正离子模式工作，dp为90-95，ep为8-12，cep为32-40，ce为40-55，cxp为2-4；及液相色谱仪中的工艺参数设置和优化如下：色谱柱：kinetex
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, lc column（5
µ
m，150*4.6 mm），柱温：50-70
°
c。
13.一实施例，所述检测方法中，使用液相色谱仪和质谱仪进行检测分析时，在液相色谱仪中进行流动的流动相采用如下步骤制得：配制流动相a：2 mm乙酸铵水溶液含0.1%甲酸；配制流动相b：2 mm乙酸铵甲醇溶液含0.1%甲酸;将所述流动相a和流动相b混合，制得流动相。
14.一实施例，所述检测方法中，所述流动相的速度为0.6ml/min。
15.一实施例，所述检测方法中，使用液相色谱仪和质谱仪进行检测分析时，每次过渡的驻留时间为30-45ms。
16.与现有技术相比，本发明的检测方法具有如下优点：1、前处理方法简单，完成单个样本前处理只需20分钟，一天可以同时处理多批样本；2、液相色谱仪串联质谱仪的上机时间短，分析一针样本只需4分钟，一天可以分析上百个样本；3、可以满足大量样本的同时检测，时效性更短；4、检测范围在0.1-10 μg/ml，检测范围比较广，基本可以满足所有样本的检测；5、验证了稀释因子50倍以内结果准确，对于超过10 μg/ml的少量特殊样本，也可以准确定量。
附图说明
17.图1为本发明血液中泊沙康唑浓度检测方法的工艺流程图；图2是本发明实施例泊沙康唑标准曲线典型图谱。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明。
19.如图1所示，本发明提供的采用液相色谱-质谱检测血液中泊沙康唑药物浓度的检测方法，工艺步骤如下：s1、使用采集管采集血液样本并离心处理后，取上层血浆；s2、将所述血浆、泊沙康唑混及甲醇混合后，制得标准品和质控品工作液；s3、采用移液管依次往离心管中加入内标准品工作液、标准品和质控品工作液，以及沉淀剂，混合后涡旋处理；s4、涡旋结束后，将离心管进行离心处理，移取上清液至进样瓶，获得待测样本溶液，备用；s5、分别对液相色谱仪和质谱仪进行工艺参数设置和优化后，使用进样瓶的插管吸取待测样本溶液至液相色谱仪-质谱仪中，进行检测分析；s6、采用标准曲线法，根据待测样本中的泊沙康唑峰面积/内标峰面积比值，计算出血液中泊沙康唑的药物浓度。
20.具体实施例中，上述采用液相色谱串联质谱检测泊沙康唑血液药物浓度的方法，
具体步骤如下：(1)、泊沙康唑的标准曲线制作溶液配制：首先，称量5 mg泊沙康唑加入5 ml的甲醇，混匀，配制成浓度为1 mg/ml的泊沙康唑标准品储备液；其次，量取100μl 1mg/ml的泊沙康唑标准品储备液加入300μl的甲醇中，混匀，制备成浓度为200μg/ml的泊沙康唑标准品储备液。
21.(2)、使用采集管采集正常人血液样本，离心处理后，取上层血浆作为空白基质；其中，离心处理时，4℃的条件、离心力13000rpm，离心处理15min。
22.(3)、标准品储备液的制备：分别称取泊沙康唑和甲醇，配制浓度为0.5-2 mg/ml泊沙康唑的标准品储备液的。
23.优选地，用天平称量5 mg泊沙康唑，加入5 ml的甲醇，混匀，配制成浓度为1 mg/ml泊沙康唑的标准品储备液。
24.(4)、质控品储备液的制备：分别量取泊沙康唑标准品储备液和甲醇，配制浓度为100-500μg/m泊沙康唑的质控品储备液。
25.优选地，量取100μl 1mg/ml的泊沙康唑标准品储备液，加入300μl的甲醇，混匀，制备成浓度200 μg/ml泊沙康唑的质控品储备液。
26.(5)、标准品和质控品工作液的配制：分别量取步骤(3)和(4)制得的泊沙康唑标准品储备液和质控品储备液，加入适量步骤（2）得到的空白血浆，混匀，制得浓度为35-45μg/ml泊沙康唑的标准品和质控品工作液；其中，标准品储备液及质控品储备液之和与血浆的体积比为1:19-1：20，且标准品储备液量取10-50μl；质控品储备液量取10-50μl。
27.(6)、内标工作液的配制：首先，打开装有1.0 mg posaconazole-d5与voriconazole-d3的安瓿瓶，加入1ml甲醇，制备成1mg/ml的内标准品储备液，并用200 μl移液器全部转移到1.5 ml棕色瓶中，存储，备用；其次，移取20 μl内标准品存储液加入1960 μl甲醇溶液，配制成浓度为10 μg/ml的内标准品工作液。
28.(7)、沉淀剂的配制：移取90ml甲醇或含有甲醇的其他水溶液于玻璃瓶中，置于常温保存12个月，配置成沉淀剂。
29.(8)、液相色谱仪中流动相的配制：流动相a：2 mm乙酸铵的水溶液含0.1%的甲酸。
30.称取0.154 g乙酸铵置于标配的流动相试剂瓶a中，用1000 ml超纯水溶解，加入1 ml甲酸，上下颠倒10次，混合均匀，超声脱气5 min，制得流动相a，室温下可保存15天。
31.流动相b：2 mm乙酸铵的甲醇溶液含0.1%的甲酸。
32.称取0.154 g乙酸铵置于标配的流动相试剂瓶b中，用1000 ml甲醇溶解，加入1 ml甲酸，上下颠倒10次，混合均匀，超声脱气5 min，制得流动相b，室温下可保存30天。
33.(9)、样本前处理：
a.用移液器移取15-25μl步骤（6）制得的内标准品工作液到离心管底部；b，往离心管中加入80-120μl步骤（5）制得标准品和质控品工作液，涡旋10 s；c.再往离心管中加入800-1000μl步骤(7)的沉淀剂，涡旋处理1 min；d.将离心管放入冷冻离心机，4℃、13000rpm的条件下继续离心，离心力15min；e.离心完成后，将上清液移取到装有内插管的进样瓶中，获得泊沙康唑的待测样本溶液，备用。
34.(10)、液相色谱-质谱检测分析：首先，按照液相色谱条件和质谱条件，进行液相色谱串联质谱参数的设置和优化；其中：质谱仪中的工艺参数：正离子模式工作，dp为90-95，ep为8-12，cep为32-40，ce为40-55，cxp为2-4；液相色谱仪中的工艺参数：色谱柱：kinetex
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, lc column（5
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m，150*4.6 mm），柱温：50-70
°
c；流动相采用步骤（8）配制的混合流动相; 流动相的速度为0.6ml/min；每次过渡的驻留时间为30-45ms；其次，使用进样瓶的插管吸取待测样本溶液至液相色谱仪-质谱仪中，进行检测分析。
35.(11)计算待测样本中泊沙康唑血药浓度：采用标准曲线法，根据待测样本中的泊沙康唑峰面积/内标峰面积比值即可计算出全血中泊沙康唑的药物浓度；其中，标准曲线制作如下：首选，按照步骤（1）配制浓度为200μg/ml的泊沙康唑标准品储备液；其次，将泊沙康唑标准品储备液进样加入液相色谱-质谱中，绘制出泊沙康唑的标准曲线。
36.本方案前处理方法简单，完成单个样本前处理只需20分钟，一天可以同时处理多批样本。仪器上机时间短，分析一针样本只需4分钟，一天可以分析上百个样本。所以本方案可以满足大量样本的同时检测，时效性更短。同时本方案的检测范围在0.1-10 μg/ml，检测范围比较广，基本可以满足所有样本的检测。同时验证了稀释因子50倍以内结果准确，所以对于超过10 μg/ml的少量特殊样本，也可以准确定量。
37.下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
38.人类血浆样本中泊沙康唑血药浓度的测定方法：1.药品和试剂：待测物对照品泊沙康唑（批号：p125008-50mg，含量：100%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；内标物对照品泊沙康唑-d5（批号：med29605-1mg）购自上海脉铂医药科技有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯）和异丙醇（色谱纯）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；人类血液样本由医院自行采集。
39.2.仪器和条件：液质联用系统由岛津lc-30a液相系统与ab sciex triplequadtm 6500三重四级杆串联质谱组成；冷冻离心机采用eppendorf 5910r。
40.2.1、液相条件：色谱柱采用kinetex
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m，150*4.6 mm）；流动相a相
为2 mm乙酸铵水溶液含0.1%甲酸；流动相b相为2 mm乙酸铵甲醇溶液含0.1%甲酸；进样体积为10
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l；梯度洗脱程序，如表1所示：表1 梯度洗脱程序2.2、质谱条件：使用带有esi源的triplequad 6500质谱，采用正离子mrm模式进行扫描。源参数及化合物参数如下表2所示：表2 泊沙康唑质谱参数3.标准品储备液、质控品储备液的配制：3.1、标准品储备液的配制：用天平称量5 mg泊沙康唑，加入5 ml的甲醇，混匀，配制成浓度为1 mg/ml的泊沙康唑标准品储备液。
41.3.2、质控品储备液的配制：量取100μl 1mg/ml的泊沙康唑标准品储备液，加入300μl的甲醇混匀，制备成浓度为200 μg/ml的泊沙康唑质控品储备液。
42.4.标准品和质控品工作液的配制：量取泊沙康唑的准品储备液及质控品储备液共7 μl加入133 μl空白血浆，混匀，制得泊沙康唑的标准品和质控品工作液。
43.5.内标工作液配制：5.1、打开装有1.0 mg posaconazole-d5与voriconazole-d3的安瓿瓶，加入1ml甲醇，制备成1mg/ml的内标准品储备液，用200 μl移液器全部转移到1.5 ml棕色瓶中，存储，备用；5.2、取20 μl内标准品储备液加入1960 μl甲醇溶液，配制成浓度10 μg/ml的内标准品工作液。
44.6.方法学验证：6.1 线性：
配制8个浓度（100ng/ml，200 ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml，2500ng/ml，5000ng/ml，7500ng/ml，10000ng/ml）的标准曲线，制备3份，分3个批次进样。
45.结果：标准曲线采用最小二乘法线性拟合，得到线性方程y=0.00437x 0.000715，r=0.9954，线性良好；其中，典型标准曲线图如图2所示。
46.6.2残留：配制双空白样品及标准曲线样品，在标准曲线最高点进样后，再进双空白样品。
47.结果：泊沙康唑残留为lloq面积的1.10%，内标响应的0.03%，符合残留要求，如表3所示。
48.表3 泊沙康唑残留结果6.3 lloq确定：配制标准曲线最低点样本，10个平行进行分析。
49.结果：泊沙康唑lloq样本的准确度都在92.9%-120%，精密度cv为7.84%，所以将泊沙康唑的lloq确定为100 ng/ml，如表4所示。
50.表4 泊沙康唑lloq确定结果
6.4准确度及精密度：使用空白基质配制低、中、高质控样本，每个浓度6个平行，3个分析批次，分3天进行。
51.结果：泊沙康唑qcl,qcm,qch的批内批间准确度都在91.42%-109.72%，批内批间精密度cv都小于8%。准确度及精密度良好，如表5所示。
52.表5泊沙康唑准确度及精密度结果
6.5 稀释可靠性：使用空白基质配制120%线性最高点，用空白基质按照不同的稀释因子稀释高浓度样品（稀释因子为2，5，10，50），每个稀释因子的样本，5次平行。
53.结果：在泊沙康唑稀释因子为2，5，10，50时，样本的平均准确度都在88%-110%，精密度cv都小于5%。所以样本在稀释因子小于等于50时，稀释可靠，如表6所示。
54.表6 泊沙康唑稀释可靠性结果
6.6 提取回收率：空白血浆添加待测药物配制成低、中、高浓度样本，加入内标进行处理，采集数据，计算其峰面积a1；空白血浆提取后添加待测药物与内标配制成与上述样本浓度一致的样本，采集数据，计算峰面积a2，提取回收率=a1/a2*100%；每个浓度样本平行6份。
55.结果：泊沙康唑分析物和内标的回收率分别为86.97%和80.88%，回收率一致，精密度cv都小于5%，说明内标适用，如表7所示。
56.表7 泊沙康唑提取回收率结果
6.7 基质效应：使用六批不同供体的空白基质配制低、高浓度样品，低浓度和高浓度样品比较分析物及内标的基质因子。
57.结果：经过内标归一化的泊沙康唑六批基质因子的cv小于14%，如表8所示。
58.表8 泊沙康唑基质效应结果
6.8稳定性：6.8.1 处理后样品稳定性（自动进样器10℃）将一批线性样本及精密度及准确度样本在当天处理完之后，放置在自动进样器（10℃）中24h、48h、72h后进样。
59.结果：添加浓度在300 ng/ml,2000 ng/ml,7500 ng/ml的泊沙康唑样本，处理后放置在自动进样器（10℃）中24h,48h,72h的结果偏差小于
±
10%，且精密度cv小于9%。所以处理后的样本在自动进样器（10℃）中可以放置3天，结果稳定，如表9所示。
60.表9 泊沙康唑处理后样品稳定性（自动进样器10℃）
高浓度血浆放置在在-20℃冻融3次6705.03.71%6.8.3 血浆样本25℃储存稳定性：配制低、高浓度血浆样本，将样本放置在25℃环境下，考查放置0天，3天，7天，14天的样本稳定性。
63.结果：泊沙康唑血浆样本放置在25℃环境下14天后，测定浓度与第0天测定值偏差小于
±
8%，所以泊沙康唑血浆样本放置在25℃环境下14天稳定，如表11所示。
64.表11泊沙康唑血浆样本25℃储存稳定性储存条件测定浓度(ng/ml)与第0天值偏差低浓度血浆放置在25℃放置0天304.5-低浓度血浆放置在25℃放置3天324.06.40%低浓度血浆放置在25℃放置7天297.0-2.46%低浓度血浆放置在25℃放置0天352.5-低浓度血浆放置在25℃放置14天326.0-7.52%高浓度血浆放置在25℃放置0天7035.0-高浓度血浆放置在25℃放置3天6750.0-4.05%高浓度血浆放置在25℃放置7天7185.02.23%高浓度血浆放置在25℃放置0天7630.0-高浓度血浆放置在25℃放置14天7795.02.16%6.8.4 血浆样本2-8℃储存稳定性：配制低、高浓度血浆样本，将样本放置在2-8℃环境下，考查放置0天，3天，7天，14天的样本稳定性。
65.结果：泊沙康唑血浆样本放置在2-8℃环境下14天，测定浓度与第0天测定值偏差小于
±
10%，所以血浆样本放置在2-8℃环境下14天稳定，如表12所示。
66.表12 泊沙康唑血浆样本2-8℃储存稳定性结果储存条件测定浓度(ng/ml)与第0天值偏差低浓度血浆放置在2-8℃放置0天290.0-低浓度血浆放置在2-8℃放置3天287.0-1.03%低浓度血浆放置在2-8℃放置7天319.010.00%低浓度血浆放置在2-8℃放置0天320.0-低浓度血浆放置在2-8℃放置14天333.54.22%高浓度血浆放置在2-8℃放置0天6785.0-高浓度血浆放置在2-8℃放置3天7105.04.72%高浓度血浆放置在2-8℃放置7天6945.02.36%高浓度血浆放置在2-8℃放置0天7450.0-高浓度血浆放置在2-8℃放置14天7340.0-1.48%6.8.5 血浆样本-20℃储存稳定性：配制低、高浓度血浆样本，将样本放置在-20℃环境下，考查放置0天，3天，7天，14天的样本稳定性。
67.结果：泊沙康唑血浆样本放置在-20℃环境下14天，测定浓度与第0天测定值偏差
小于
±
14%，所以血浆样本放置在-20℃环境下14天稳定，如表13所示。
68.表13 泊沙康唑血浆样本-20℃储存稳定性结果储存条件测定浓度(ng/ml)与第0天值偏差低浓度血浆放置在-20℃放置0天292.0-低浓度血浆放置在-20℃放置3天291.5-0.17%低浓度血浆放置在-20℃放置7天292.00.00%低浓度血浆放置在-20℃放置0天353.0-低浓度血浆放置在-20℃放置14天306.0-13.31%高浓度血浆放置在-20℃放置0天6585.0-高浓度血浆放置在-20℃放置3天6560.0-0.38%高浓度血浆放置在-20℃放置7天6805.03.34%高浓度血浆放置在-20℃放置0天7475.0-高浓度血浆放置在-20℃放置14天7570.01.27%7.临床样本验证：应用本发明开发的lc-ms-ms法对7名血浆泊沙康唑浓度进行检测。
69.结果表明：同一剂量下不同患者的泊沙康唑血药浓度差别较大，但其平均血药浓度为1470.43 ng/ml，与其药代动力学结论一致，如表14所示。
70.表14 泊沙康唑临床样本验证结果样本序号本发明lc-ms-ms体系测定泊沙康唑浓度（ng/ml）13392231032550624407942811209592本发明开发了一种血浆中泊沙康唑药物浓度的方法。该方法操作简单，采血量小，对受试个体友好，测量结果准确度高，重现性好且与血浆样品测量结果相关性好。适用于临床前药代动力学研究和药物安全性评价。
71.应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。