INPP5F用于制备肝癌组织肿瘤预后、诊断或防治的药物的用途

inpp5f用于制备肝癌组织肿瘤预后、诊断或防治的药物的用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及inpp5f用于制备肝癌组织肿瘤预后、诊断或防治的药物的用途。


背景技术：

2.肝细胞癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，近年来患病率迅速上升。当前肝细胞癌的治疗效果有限，远未达到令人满意的程度。同时肝细胞癌的复发转移率高，肝细胞癌切除术后5年有60-70％的患者会出现复发与转移。因此，探究影响肿瘤生长、复发转移的因素及其涉及的调控机制可为肝细胞癌的治疗提供新的思路，改善患者生存状况。
3.肌醇多磷酸5-磷酸酶f(inositol polyphosphate 5-phosphatase f，inpp5f)，也称为sac2蛋白，是肌醇多磷酸酶5-磷酸酶多种同工酶和剪接变体中的一个。肌醇多磷酸5-磷酸酶磷酸化作用的底物为磷酸肌醇，有特异性5-磷酸酶活性，这类磷酸酶已被报道证实在多种疾病的发病过程中有重要作用，如lowe综合征，joubert-morm综合征等。关于inpp5f的研究主要集中于其在心肌和脑组织中的作用，发现在心肌中inpp5f可通过调节心肌细胞大小和心脏对应激的反应进而抑制心肌肥大，在脑组织中inpp5f可以通过抑制pi3k/akt/gsk-3β信号通路从而改善神经性疼痛大鼠的病情和认知障碍。随着肿瘤测序数据的增多，研究发现，在多形性胶质母细胞瘤中共定位于染色体10q的一组包括inpp5f在内的磷酸肌醇信号基因的拷贝数减少，机制研究显示inpp5f通过与stat3相互作用抑制stat3信号通路进而抑制细胞自我更新和增殖能力。但在慢性淋巴细胞性白血病中，其与健康b细胞的蛋白质组学分析显示inpp5f表达显著上调，且在使用氟达拉滨行化学治疗的患者中inpp5f高表达与化疗耐药有关、提示预后差。这些结果说明在不同肿瘤中inpp5f作用有差异。
4.越来越多的研究证实磷酸酶的异常表达可影响调控肿瘤发生发展，近期研究发现肌醇多磷酸5-磷酸酶家族在肿瘤进展过程中也可表现出促癌作用，但单就其成员inpp5f而言，其在恶性肿瘤的发生发展中研究仍较少。inpp5f在肝细胞癌中的作用及涉及的机制尚未见报道。


技术实现要素：

5.经过发明人深入研究和创造性劳动惊奇地发现，inpp5f在肝细胞癌组织中异常高表达，其表达水平与肿瘤大小、肿瘤分化程度以及是否伴有肝硬化密切相关，具有促进肝癌细胞的增殖、有氧糖酵解及体内成瘤能力，是一种新的核质穿梭蛋白。inpp5f基因或inpp5f蛋白能够作为肝癌的预后或诊断的标志物，具有应用于制备肝癌预后、诊断、治疗和/或预防的药物或者试剂的潜力。由此提供下述发明：
6.本发明第一方面涉及inpp5f基因或者检测inpp5f基因的试剂在制备用于肝癌的预后的试剂中的用途。
7.在本发明第一方面的一些实施方式中，所述预后是指预测患者的存活期。
8.在本发明第一方面的一些实施方式中，所述用途中，检测inpp5f在肝癌组织中mrna表达量a，以及inpp5f在对象自身的正常肝组织中的表达量b：
9.如果a＞b且a和b存在显著差异p＜0.05，则肿瘤分化程度低，预后较差；和/或
10.如果a和b不存在显著差异p＞0.05，则该基因对该对象的预后无显著意义。
11.优选地，所述检测至少重复1次，例如重复1、2、3或4次。
12.在本发明第一方面的一些实施方式中，所述用途中，通过实时荧光定量pcr检测所述表达量a和表达量b，并按照如下公式计算：表达量a或表达量b＝2-(inpp5f的
△
ct减去gapdh的
△
ct)
。
13.本发明利用实时荧光定量pcr、免疫组化分析等方法证明了inpp5f在肝细胞癌组织中异常高表达，其表达水平与肿瘤大小、肿瘤分化程度以及是否伴有肝硬化密切相关，并与病人的预后有明确的相关性(请参见实施例1)。
14.本发明第二方面涉及一种判读肝癌患者预后的方法，包括如下步骤：
15.检测inpp5f在肝癌组织中mrna表达量a，以及inpp5f在对象自身的正常肝组织中的表达量b：
16.如果a＞b且a和b存在显著差异p＜0.05，则肿瘤分化程度低，预后较差；和/或
17.如果a和b不存在显著差异p＞0.05，则肿瘤分化程度高，预后较好。
18.优选地，所述检测至少重复1次，例如重复1、2、3或4次。
19.本发明第二方面的一些实施方式中，所述方法通过实时荧光定量pcr检测所述表达量a和表达量b，并按照如下公式计算：表达量a或表达量b＝2-(inpp5f的
△
ct减去gapdh的
△
ct)
。
20.本发明第三方面涉及inpp5f基因或者检测inpp5f基因的试剂在制备用于肝癌的诊断的试剂中的用途。
21.本发明中依据inpp5f这一新的诊断和治疗靶点设计的基因检测引物，抗体等可能成为肿瘤的诊断试剂。
22.在本发明第三方面的一些实施方式中，所述用途中，
23.检测inpp5f在肝癌组织中mrna表达量a，以及inpp5f在对象自身的正常肝组织中的mrna表达量b：
24.如果a＞b且a和b存在显著差异p＜0.05，则诊断为阳性；和/或
25.如果a和b不存在显著差异p＞0.05，则诊断为阴性。
26.优选地，所述检测至少重复1次，例如重复1、2、3或4次。
27.在本发明第三方面的一些实施方式中，所述用途中，通过实时荧光定量pcr检测所述表达量a和表达量b，并按照如下公式计算：表达量a或表达量b＝2-(inpp5f的
△
ct减去gapdh的
△
ct)
。
28.本发明第四方面涉及一种诊断肝癌的方法，包括如下步骤：
29.检测inpp5f在肝癌组织中mrna表达量a，以及inpp5f在对象自身的正常肝组织中的mrna表达量b：
30.如果a＞b且a和b存在显著差异p＜0.05，则诊断为阳性；和/或
31.如果a和b不存在显著差异p＞0.05，则诊断为阴性。
32.优选地，所述检测至少重复1次，例如重复1、2、3或4次。
33.在本发明第四方面的一些实施方式中，所述诊断方法通过实时荧光定量pcr检测所述表达量a和表达量b，并按照如下公式计算：表达量a或表达量b＝2-(inpp5f的
△
ct减去gapdh的
△
ct)
。
34.本发明第五方面涉及inpp5f基因在制备用于肝癌的治疗和/或预防的药物或者抑制肝癌细胞增殖的药物中的用途。
35.实施例2的数据表明，提高或者增加inpp5f基因的表达能够促进肝癌细胞增殖，表面inpp5f是一个促进肝癌细胞增殖的基因。降低或者减少inpp5f基因的表达水平，则能够抑制肝癌细胞增殖，能够应用于肝癌的治疗和/或预防。
36.在本发明第五方面的一些实施方式中，所述用途中，所述药物为降低inpp5f基因的表达水平的药物。
37.在本发明上述任一方面的用途中，所述inpp5f基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
38.inpp5f基因的核苷酸序列：
39.atggagctcttccaagccaaggaccactacatcctgcagcagggcgagcgcgcgctgtggtgcagccgccgcgacggcggcctccagctccgacccgctactgatctacttcttgcctggaatcccatttgtttggggttggtagaaggtgttattgggaaaattcaacttcattcagatcttccatggtggcttattctaattcggcagaaagcattggtgggcaaactcccaggagaccatgaggtctgtaaagttaccaaaattgctgtgctctcactttctgaaatggaacctcaggatcttgagctagagctctgtaagaagcatcattttggtattaacaaaccagagaagatcataccatctcctgatgactcaaagtttctactgaagacctttacgcatattaaatccaatgtgtctgctcctaataaaaagaaagttaaggaaagtaaagagaaggagaagttggagaggagattacttgaagagttgctgaagatgttcatggactcagaatccttttattatagcttgacctatgacctgaccaattccgtgcagaggcagagcactggggagagggacggtcggcccctctggcagaaggttgatgaccgatttttttggaataaatacatgatacaagatcttactgagattggtactccagatgtggacttttggattatccccatgatccaaggttttgtgcagattgaagaacttgtggttaattataccgaatcatctgatgatgagaaaagcagcccagagaccccccctcaggagtccacctgtgtagatgatattcacccacgatttctagtggctctcatttcacgccgaagtaggcacagagcaggaatgcgctataaacgaagaggagtggataaaaatggaaatgttgccaattatgtggagactgagcagttgattcatgttcataatcataccctgtcatttgttcaaacacgaggctctgtgcctgtcttttggagccaggttgggtatcgatataacccaagaccgcggctggacagaagtgaaaaggaaactgttgcctatttctgtgcccatttcgaagaacaactgaacatttacaaaaaacaggttattattaacttggtagaccaggcaggaagagagaagattattggcgatgcttacctgaagcaagtgttgcttttcaacaactcacacctcacttacgtttcgtttgacttccatgagcactgccgaggaatgaagtttgagaatgttcagacactaacagatgccatttatgacattattcttgatatgaagtggtgttgggttgatgaagctggggtaatatgtaagcaggaagggatttttcgtgttaattgtatggactgcctggatcgcaccaacgtggtccaagctgccatcgcgagagtggtcatggaacagcagctgaaaaaattaggtgtgatgcccccggaacagccattacctgtgaaatgtaatcgcatctaccagataatgtgggccaataatggtgactccattagcagacagtatgctgggacagctgctctgaagggtgactttacaaggacaggagaaaggaagttagcaggagttatgaaagatggagtgaactcagcaaacagatattacctcaaccgatttaaggatgcttataggcaagctgttatagatttgatgcaaggcattccagtgacagaagatctttattccatatttaccaaggagaaagaacatgaagctttgcataaggaaaatcagagaagccaccaggaactaattagccagctcttacaaagttacatgaagttactactgcctgatgatgagaagttccatgggggctgggccctcattgactgtgaccctagcctcattgatgctactcacagagacgtggatgtgctgttactgctttctaactctgcctactacgtggcctattatgatgatgaagttgataaagtaaaccagtatcaacgactaagtctagaaaacctggaaaaaattgaaataggccctgaacccactctttttggtaagccaaagttctcctgcatgcgactgcactacagatacaaagaagcgagtggctatttccacacattgcgagctgtaatgcgtaatcctgaagaggatggaaaagatacccttcagtgcattgcagagatgctgcagatc
accaagcaagccatgggatcggatttacccataattgagaagaaacttgagaggaagagcagtaaacctcacgaagacatcattggtatcaggtctcaaaaccaaggttctttggcccagggaaagaattttttaatgagcaaattttcatctctaaatcaaaaagtgaagcagaccaaatccaatgtaaatattggcaacctccgaaagctaggaaactttaccaaacctgaaatgaaagttaactttctaaaaccaaacttaaaagtaaatctttggaaatcagatagtagtcttgaaactatggaaaacacaggagtgatggataaggttcaggcagagtctgatggggacatgtcttcagataatgactcataccactctgatgaattccttacaaattctaagtctgatgaagacaggcagctagctaactcattagagagtgtagggccaatagattacgttcttcctagttgtggtattattgcctcagcgcctcgattgggcagtcggtcccagtctcttagcagcacagatagtagcgttcatgctccttcagagattactgttgctcatgggagtgggcttggaaaaggccaggagtctcctttgaagaaaagtccttctgctggcgacgtacacatattgactggctttgccaagcctatggatatttactgccacagatttgtgcaagatgcacagaacaaagtgacccacctatcagagaccagatctgtgtctcagcaggctagtcaggaaagaaatcaaatgaccaatcaagtttcaaatgaaacccaatcagaatcaacagaacagacaccttctcggccatcgcaattagatgtctctctttctgcaacaggcccacagtttttgtcagttgagccagcgcattcagttgcatctcaaaaaacccccacctccgcttccagcatgcttgaacttgagacagggcttcatgtaactccttctccttcagagagcagtagcagcagagcagtctctccctttgccaagattcgaagttccatggtccaggttgctagtattacccaagctggattaacccatgggataaactttgcagtgtcaaaagttcagaagagtcctccagaacctgaaatcattaatcaagtccagcaaaatgaacttaaaaag(seq id no:1)
40.本发明第六方面涉及inpp5f蛋白或其融合蛋白或者检测inpp5f蛋白的试剂在制备用于肝癌的预后的试剂中的用途。
41.在本发明第六方面的一些实施方式中，所述用途中，以对象自身的正常肝组织中inpp5f蛋白表达量为参照，判断该对象的肝癌组织或疑似肝癌组织中inpp5f蛋白的相对表达量。
42.优选地，inpp5f蛋白的相对表达量根据免疫组化结果来判读；评判方式为：显微镜下拍照，对200倍高倍镜下的免疫组化结果进行分析评分；评分规则为：
43.1)依据染色强度评0-3分，其中阴性为0分、浅棕色为1分、棕色为2分、深棕色3分；
44.2)依据染色阳性细胞所占比例评0-4分，其中0％-10％为0分、11％-25％为1分、26％-50％为2分、51％-75％为3分、75％-100％为4分；
45.3)总分＝染色强度积分
×
阳性细胞占比积分，总分≥7分定义为高表达，0-7分为低表达。
46.本发明第七方面涉及一种判断肝癌患者预后的方法，包括检测其inpp5f蛋白相对表达量的步骤。inpp5f蛋白相对表达量的检测或判断方法如上所述。
47.本发明第八方面涉及inpp5f蛋白或其融合蛋白或者检测inpp5f蛋白的试剂在制备用于肝癌的诊断的试剂中的用途。
48.在本发明第八方面的一些实施方式中，所述用途中，以对象自身的正常肝组织中inpp5f蛋白表达量为参照，判断该对象的肝癌组织或疑似肝癌组织中inpp5f蛋白的相对表达量。
49.优选地，inpp5f蛋白的相对表达量根据免疫组化结果来判读；评判方式为：显微镜下拍照，对200倍高倍镜下的免疫组化结果进行分析评分；评分规则为：
50.1)依据染色强度评0-3分，其中阴性为0分、浅棕色为1分、棕色为2分、深棕色3分；
51.2)依据染色阳性细胞所占比例评0-4分，其中0％-10％为0分、11％-25％为1分、
26％-50％为2分、51％-75％为3分、75％-100％为4分；
52.3)总分＝染色强度积分
×
阳性细胞占比积分，总分≥7分定义为高表达，0-7分为低表达。
53.本发明第九方面涉及一种诊断肝癌的方法，包括检测inpp5f蛋白相对表达量的步骤。inpp5f蛋白相对表达量的检测方法或判读方法如上所述。
54.本发明第十方面涉及inpp5f蛋白或其融合蛋白在制备用于肝癌的治疗和/或预防的药物或者抑制肝癌细胞增殖的药物中的用途。
55.实施例2的数据表明，提高或者增加inpp5f蛋白的表达能够促进肝癌细胞增殖，表明inpp5f是一个促进肝癌细胞增殖的基因。降低或者减少inpp5f蛋白的表达水平，则能够抑制肝癌细胞增殖，能够应用于肝癌的治疗和/或预防。
56.在本发明第十方面的一些实施方式中，所述用途中，所述药物为降低inpp5f蛋白的表达水平的药物。
57.在本发明上述任一方面所述的用途中，所述inpp5f蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
58.inpp5f蛋白的氨基酸序列：
59.melfqakdhyilqqgeralwcsrrdgglqlrpatdlllawnpiclglvegvigkiqlhsdlpwwlilirqkalvgklpgdhevckvtkiavlslsemepqdlelelckkhhfginkpekiipspddskfllktfthiksnvsapnkkkvkeskekeklerrlleellkmfmdsesfyysltydltnsvqrqstgerdgrplwqkvddrffwnkymiqdlteigtpdvdfwiipmiqgfvqieelvvnytessddeksspetppqestcvddihprflvalisrrsrhragmrykrrgvdkngnvanyveteqlihvhnhtlsfvqtrgsvpvfwsqvgyrynprprldrseketvayfcahfeeqlniykkqviinlvdqagrekiigdaylkqvllfnnshltyvsfdfhehcrgmkfenvqtltdaiydiildmkwcwvdeagvickqegifrvncmdcldrtnvvqaaiarvvmeqqlkklgvmppeqplpvkcnriyqimwanngdsisrqyagtaalkgdftrtgerklagvmkdgvnsanryylnrfkdayrqavidlmqgipvtedlysiftkekehealhkenqrshqelisqllqsymklllpddekfhggwalidcdpslidathrdvdvllllsnsayyvayyddevdkvnqyqrlslenlekieigpeptlfgkpkfscmrlhyrykeasgyfhtlravmrnpeedgkdtlqciaemlqitkqamgsdlpiiekklerksskphediigirsqnqgslaqgknflmskfsslnqkvkqtksnvnignlrklgnftkpemkvnflkpnlkvnlwksdssletmentgvmdkvqaesdgdmssdndsyhsdefltnsksdedrqlanslesvgpidyvlpscgiiasaprlgsrsqslsstdssvhapseitvahgsglgkgqesplkkspsagdvhiltgfakpmdiychrfvqdaqnkvthlsetrsvsqqasqernqmtnqvsnetqsesteqtpsrpsqldvslsatgpqflsvepahsvasqktptsassmleletglhvtpspsessssravspfakirssmvqvasitqaglthginfavskvqksppepeiinqvqqnelkkmfiqcqtriiqi(seq id no:2)
60.本发明不仅发现并证实了inpp5f可作为判断肝细胞癌预后的独立危险因子，而且证实了asph是inpp5f的相互作用蛋白，inpp5f通过asph激活notch-c-myc/cyclin e1信号通路促进肝癌细胞增殖及有氧糖酵解；此外，发明人还发现inpp5f在肝细胞癌中从细胞核转运至细胞质的过程对发挥促癌功能至关重要。
61.本发明的另一个重要发现是inpp5f在肝细胞癌组织与癌旁正常肝组织之间的亚细胞定位不同，在肝癌组织中inpp5f主要分布在细胞核，而癌旁肝组织则主要分布在细胞质。正常细胞中核质穿梭机制可使许多分子定位于特定的亚细胞空间中从而调节分子活性。分子的错误定位则可能改变其活性、破坏细胞内平衡并导致包括肿瘤在内的各种疾病。
越来越多的证据表明，核质穿梭蛋白从细胞核转运出核对于调节细胞内信号传导至关重要，与肿瘤形成，进展和肿瘤的耐药性密切相关，故研究开发针对出核转录的肿瘤治疗策略有重要意义。xpo1也被称为carm1，是许多细胞中出核转录过程的主要介质，可以将数百种不同的蛋白质及小部分rna从细胞核输出到细胞质，其在恶性肿瘤中的主要功能之一是调控含ness和nlss的肿瘤蛋白的出核转录过程。xpo1是肿瘤治疗的合适靶点，最近xpo1抑制剂selinexor被fda批准用于多发性难治性骨髓瘤患者。在本发明的研究中，发明人发现xop1的小分子抑制剂lmb可以抑制inpp5f的核出核转运，进而抑制了notch信号通路激活和肝癌细胞的增殖，这说明在肝细胞癌中xpo1抑制剂也有可以通过的inpp5f发挥其抗肿瘤作用的潜质。此外，发明人鉴定了inpp5f的ness和nlss，发现inpp5f的ness突变可抑制出核转运，使inpp5f在细胞核中累积；同时nlss缺失导致inpp5f定位于细胞质中，增加了与细胞质中asph蛋白结合的机会，从而激活notch信号通路以发挥其促癌功能。这说明在肝细胞癌中xpo1可通过调控inpp5f的ness和nlss而发挥作用。因此，在肝细胞癌中针对inpp5f，使其ness突变和/或保留nlss可能成为一种新肿瘤治疗方式。由此提出下述发明：
62.本发明第十一方面涉及inpp5f在制备用于肝癌的治疗和/或预防的药物或者抑制肝癌细胞增殖的药物中的用途。
63.在本发明第十一方面的一些实施方式中，所述药物为抑制inpp5f出核转运的药物。
64.优选地，所述药物通过调控inpp5f的ness和/或nlss抑制inpp5f出核转运，使inpp5f的ness突变和/或保留nlss。
65.本发明与现有技术相比较有如下有益效果：
66.1.inpp5f在肝细胞癌组织中异常高表达；inpp5f的表达水平与肿瘤大小、肿瘤分化程度，以及是否伴有肝硬化密切相关；inpp5f高表达患者预后差，是影响肝细胞癌患者预后的独立危险因素。
67.2.inpp5f促进肝癌细胞的增殖、有氧糖酵解及体内成瘤能力。
68.3.inpp5f经过出核转运进入细胞质与apsh相互结合后，激活notch信号通路及其下游的cyclin e1和c-myc，进而影响肝细胞癌的发生及发展。
69.4.在肝细胞癌中inpp5f具有促癌作用，是一种新的核质穿梭蛋白，可能成为肝细胞癌的潜在治疗靶点。
附图说明
70.图1：肝细胞癌组织中inpp5f表达上调。其中，1a-1d：oncomine数据库的mas_hcc，wurmbach_hcc，roessler_hcc1和roessler_hcc2数据集中inpp5f在肝癌组织和正常组织中的表达情况；1e：gepia数据库中inpp5f在肝癌组织和正常组织中的表达情况；1f：孙逸仙纪念医院88例肝细胞癌患者inpp5f mrna在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况；1g：孙逸仙纪念医院232例肝细胞癌患者inpp5f蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的免疫组化染色代表图。
71.图2：inpp5f高表达的肝细胞癌患者总生存期较差。其中，2a：gepia数据库中inpp5f不同表达组肝细胞癌患者生存分析；2b：孙逸仙纪念医院肝细胞癌患者inpp5f蛋白高表达与低表达组免疫组化染色代表图；2c：孙逸仙纪念医院肝细胞癌患者inpp5f蛋白高表达与低表达组患者生存分析。
72.图3：构建敲低和过表达inpp5f的肝癌细胞株。其中，3a：肝癌细胞系中inpp5f的mrna相对表达量；3b：肝癌细胞系中inpp5f的蛋白相对表达量；3c-3d：sirna转染sk-hep-1肝癌细胞后inpp5f敲低效果的验证；3e-3f：inpp5f在sk-hep1和mhcc-97h肝癌细胞中敲低效果的验证；3g-3h：inpp5f在huh7肝癌细胞中过表达效果的验证。
73.图4：inpp5f促进肝癌细胞增殖。其中，4a-4c：edu细胞增殖实验检测不同inpp5f表达量肝癌细胞的增殖能力；4d-4e：克隆形成实验检测不同inpp5f表达量肝癌细胞的增殖能力；4f：流式细胞术检测不同inpp5f表达量的肝癌细胞所处细胞周期g1期、s期和g2期的细胞百分率。
74.图5：inpp5f增强肝癌细胞有氧糖酵解。其中，5a：稳转敲低inpp5f的sk-hep1和mhcc-97h细胞培养基颜色代表图；5b：不同inpp5f表达量的肝癌细胞的乳酸生成量；5c：不同inpp5f表达量的肝癌细胞的葡萄糖消耗量。
75.图6：inpp5f对肝癌细胞侵袭转移的影响。其中，6a-6d：transwell迁移实验检测不同inpp5f表达量肝癌细胞的迁移能力；6e-6h：transwell侵袭实验检测不同inpp5f表达量肝癌细胞的侵袭能力；6i-6k：划痕实验检测不同inpp5f表达量肝癌细胞的迁移侵袭能力。
76.图7：inpp5f表达水平影响小鼠体内肿瘤生长能力。其中，7a-7c：inpp5f敲低及其对照细胞组皮下异种移植模型的生物发光图(7a)、肿瘤组织图(7b)及两组肿瘤重量的比较图(7c)；7d：每周测量两组小鼠肿瘤体积绘制的肿瘤生长曲线；7e：两组肿瘤连续切片上的h&e染色，inpp5f和ki67蛋白免疫组化染色代表图；7f：inpp5f敲低及其对照细胞组肝原位异种移植模型的生物发光图。
77.图8：rna-测序的差异表达基因(degs)。其中，8a-8b：rna-测序所得degs的火山图(8a)及数目(8b)；8c：细胞生长和有氧糖酵解相关degs热图；8d：不同inpp5f表达量的肝癌细胞中有氧糖酵解相关基因的mrna表达情况。
78.图9：inpp5f调控肝癌中c-myc和cyclin e1的表达。其中，9a-9c：不同inpp5f表达量的肝癌细胞中c-myc和cyclin e1的mrna表达情况；9d：不同inpp5f表达量的肝癌细胞中c-myc和cyclin e1的蛋白表达情况；9e-9f：克隆形成实验检测在inpp5f过表达的肝癌细胞中敲低c-myc和cycline1对inpp5f介导的细胞增殖的影响。
79.图10：inpp5f与asph相互作用。其中，10a：不同inpp5f表达量肝癌细胞中akt、mtor和stat3信号激活情况；10b：含有flag标签的inpp5f过表达的huh7细胞中，用抗flag抗体行免疫共沉淀，其蛋白复合物的蛋白质谱分析的基峰图和与asph结合肽段示意图；10c-10d：免疫共沉淀结合western blot技术检测过表达flag-inpp5f的huh7细胞的免疫共沉淀复合物中asph表达量(10c)和过表达ha-asph的huh7细胞的免疫共沉淀复合物中inpp5f表达量(10d)以证实inpp5f与asph之间相互作用；10e-10h：不同inpp5f表达量的肝癌细胞中asph的在mrna水平(10e-10g)和蛋白水平(10h)的表达情况。
80.图11：inpp5f通过与asph相互作用激活notch信号通路。其中，11a：不同inpp5f表达量的肝癌细胞中notch信号通路激活情况；11b：敲低asph在mrna水平显著抑制inpp5f过表达介导的hes1、hey1、cyclin e1和c-myc表达上调；11c：敲低asph在蛋白水平显著抑制inpp5f过表达介导的nicd、hes1、hey1、cyclin e1和c-myc表达上调；11d-11h：在inpp5f过表达的huh7细胞中敲低asph，可显着减弱inpp5f过表达介导的细胞增殖(11d-11e)，削弱inpp5f过表达对g1/s期转变的促进作用(11f)，并降低inpp5f过表达所致的乳酸生成量
(11g)和葡萄糖消耗量增多(11h)。
81.图12：孙逸仙纪念医院肝癌患者细胞质和细胞核中inpp5f分布情况。其中，12a：孙逸仙纪念医院232例肝细胞癌患者inpp5f在肝癌组织(tumor)和癌旁肝组织(non-tumor)的细胞核染色情况及4种模式代表图；12b：各模式中肝细胞癌患者的数量和所占百分比；12c：癌旁组织的细胞核中inpp5f蛋白不同表达组肝细胞癌患者生存分析。
82.图13：lmb抑制inpp5f的出核转录。其中，13a：免疫荧光检测inpp5f在肝癌细胞中的定位；13b：免疫荧光检测lmb处理后肝癌细胞中inpp5f的亚细胞定位；13c：western blot检测lmb处理后肝癌细胞的细胞核中inpp5f表达量；13d：肝癌细胞中lmb可抑制inpp5f下游信号通路的激活；13e-13f：克隆形成实验证实抑制出核转录影响肝癌细胞的增殖能力。
83.图14：inpp5f的ness和nlss对其出核转录、信号转导及功能的影响。其中，14a：inpp5f的ness突变体mut和三个nlss截短体trunc1、trunc2和trunc3的模式图；14b-14c：野生型(wt)、ness突变体和nlss截短体质粒转染肝癌细胞后免疫荧光检测inpp5f的亚细胞定位(14b)，western blot检测细胞核中inpp5f的表达量(14c)；14d-14e：野生型(wt)、ness突变体和nlss截短体质粒转染肝癌细胞后对inpp5f下游分子在mrna水平(14d)和蛋白水平(14e)的影响；14f-14h：inpp5f的nlss和ness改变对inpp5f介导的增殖能力(14f)、乳酸生成量(14g)和葡萄糖消耗量(14h)的影响。
具体实施方式
84.下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。对于本领域技术人员来说，实施例中某些具体技术或条件可能省略是可以理解的，可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1(inpp5f在肝癌中的表达及其临床意义研究)
85.本实施例通过对公共数据库gepia和oncomine检索分析发现在肝癌中inpp5f表达异常上调，通过rt-pcr、免疫组化等实验方法检测inpp5f在肝细胞癌中的表达情况，并将其表达情况与临床病理、预后信息结合，分析inpp5f的临床意义。具体操作如下：
86.1材料
87.1.1临床组织标本
88.实时荧光定量pcr:人肝癌组织标本来自中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科，手术时间为2015年4月至2016年2月，共88例；获得标本后即刻装入冻存管中，管壁做好标记，立即放入液氮罐中冷冻保存直至进一步分析。
89.免疫组化染色:人肝癌组织标本来自中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科，手术时间为2010年1月至2013年12月，共232例；
90.患者在手术之前未经历任何局部或者系统的治疗，共计96例；包括肝癌组织和配对的癌旁组织，癌组织取自肿瘤病灶的中央非坏死区域，癌旁组织取自距离肿瘤病灶外至少1cm的正常肝组织，当距离不够时，可选择取离肿瘤组织最远部分的肝组织；手术标本离体后，分别取肿瘤与正常组织，并分开放入不同的换药碗中，生理盐水冲洗两遍，保存在福尔马林中，然后由中山大学孙逸仙纪念医院病理科进行石蜡包埋并制成组织芯片。所有病
例均术后病理证实为肝细胞肝癌。96例组织芯片患者有完整的临床病理资料信息和随访信息。本研究收集的临床组织标本经过中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会审核批准，所有患者均已签署知情同意书。
91.1.2公共数据库临床标本
92.所用公共数据库为gepia和oncomine。
93.1.3主要试剂及耗材
94.人抗兔inpp5f抗体购于abcam公司。
95.实时荧光定量pcr、免疫组化所需试剂与耗材免疫组化所需试剂与耗材
96.1.4主要仪器设备
97.2方法
98.2.1实时荧光定量pcr
99.细胞总rna提取：
100.1)将1mltrizol加入处于对数生长期，生长状态良好的细胞中，用移液枪反复充分吹打后转移到1.5ml的ep管中，室温静置15min；
101.2)加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；
102.3)在4℃，12000rpm条件下离心15min后，可观察到液体分层；
103.4)小心吸取无色上清液转移至新的ep管中，加入等体积预冷后的异丙醇，上下颠倒摇匀，室温静置10min；
104.5)在4℃，12000rpm条件下离心10min后，可见ep管底部出现白色沉淀；
105.6)吸弃上清也，加入1ml 75％乙醇吹打洗涤沉淀；
106.7)4℃，7500rpm条件下离心5min；弃上清吸弃乙醇，打开ep管盖，室温静置15min使rna沉淀干燥；
107.8)每个ep管加入适量depc水，用移液枪吹打使rna溶解；
108.9)用分光光度计测定rna浓度后，放入-80℃冰箱中保存备用或进行逆转录。
109.组织rna提取：从液氮罐中取出肝细胞癌标本放入1.5ml无rna酶的ep管中，加入
1ml trizol，用研磨棒将组织充分研磨，反复吹打使其混匀，室温静置5min。余步骤同细胞总rna提取。
110.rna逆转录成cdna：应用takara公司的primescript逆转录试剂盒实施逆转录，全程冰上操作。
111.1)在0.2ml ep管上标记样本名称后，配置10ul的除基因组dna反应体系，包括1ug rna，2ul 5
×
gdna erase buffer，1ul gdna eraser，其余用depc水补足逆转录试剂体积＝20μl)；
112.2)混匀离心后放入pcr仪中，在42℃下孵育2min完成基因组dna去除；
113.3)每个ep管加入1ul primescript rt enzyme mix i，1ul rt enzyme mix，4ul 5
×
primescript buffer 2和4ul depc水，得到20ul逆转录体系；
114.4)混匀离心后，将ep管放入pcr仪中，设置反应条件为37℃15min
→
85℃5sec
→
4℃进行逆转录；
115.5)反应结束后去除ep管，加入50ul depc水以稀释cdna，cdna可放入-80℃冰箱保存或直接进行后续实验。
116.实时荧光定量pcr：
117.1)引物设计合成：我们应用primer3 input(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)设计引物，随后由华大基因公司合成引物。涉及引物序列如下：
118.2)使用takara公司的sybr premix ex taq试剂盒，配置10ul反应体系，包括5ulpremix ex taq ii，上下游引物个0.2ul(10umol/l)，3.6ul depc水和1ul cdna，在96孔板中加好上述液体后贴膜封口；
119.3)使用罗氏lightcycler480进行实时荧光定量pcr，检测不同基因表达水平，pcr反应条件为95℃15sec预变性后；进行45个循环的95℃15sec，60℃45sec；总共进行40个循环；
120.4)对每个样品均设计了3个复孔，结果分析以gapdh作为内参基因，用2-δct法计算prl-3mrna相对于gapdh的表达量。
121.2.2免疫组织化学染色
122.人抗兔inpp5f抗体在免疫组化中稀释比例1:200
123.免疫组织化学染色是将荧光或可呈色的化学物质结合于抗体上，用抗原与抗体之间特异性的结合反应，检测细胞或组织中目标抗原是否存在，此方式可以用来测定抗原的表达量及观察抗原所表达的位置。具体实验步骤如下：
124.1)烘片，将组织芯片的切片放入切片架中，在烘箱中烘片，温度70℃条件下烘片约45min；
125.2)脱蜡，从烘箱中迅速取出切片，将其浸泡于二甲苯i、二甲苯ii、二甲苯iii中，各15min；
126.3)水化，切片依次浸泡于无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇和75％乙醇中，各5min；
127.4)冲洗，将切片置于配置好的1
×
pbst溶液中，3min/次，共3次；
128.5)抗原修复，切片浸入有1
×
枸橼酸盐抗原修复液的高压锅中，组织需被修复液完全覆盖，加热至高压锅上汽后继续煮5min；
129.6)冷却，切片在修复液中自然冷却或水浴冷却至室温(切片一定要在修复液中，不能取出，否则易脱片)；
130.7)冲洗，1
×
pbst溶液中浸泡3min，共3次；
131.8)阻断内源性过氧化物酶，将切片摆放于免疫组化孵育盒内中，滴加内源性过氧化物酶阻断剂至覆盖全部组织，室温避光孵育15min；
132.9)冲洗，甩去内源性过氧化物酶阻断剂后，于1
×
pbst溶液中浸泡3min，共3次；
133.10)封闭，将切片置于孵育盒中并在组织上滴加免疫组化封闭液至完全覆盖整个组织，室温孵育30min；
134.11)画圈，甩去封闭液后，用滤纸将切片周围的封闭液吸干，再用免疫组化笔将组织所在区域圈起来，以防一抗渗漏。将切片置于孵育盒内，孵育盒底部加入水浸泡过的棉球，以防干片；
135.12)一抗孵育，按照1:100的比例稀释prl-3抗体后，将抗体滴加至富孵育盒中的切片上，使其均匀分布在组织上，每张约100ul抗体，4℃冰箱中孵育过夜；
136.13)复温，第二天从冰箱拿出切片后室温放置30min，复温后用pbst浸洗切片3次，每次5min；
137.14)二抗孵育，甩去pbst后置于孵育盒中，滴加抗兔二抗(酶标山羊抗兔igg聚合物)，室温孵育1h；
138.15)冲洗，1
×
pbst溶液中浸泡3min，共3次；
139.16)dab显色，甩去并用滤纸吸干切片上pbst后将切片放于孵育盒内，滴加1
×
dab显色液，每张切片约100ul，使其均匀覆盖在组织上。在显微镜下观察组织着色情况，至出现明显的棕色时终止；
140.17)终止显色，甩去dab显色液，1
×
pbst冲洗，每次5min，共3次；
141.18)复染，切片甩干后放入孵育盒中，滴加苏木素染液，每张切片100-150ul苏木素，2min后取出，1
×
pbst冲洗，每次5min，共3次；
142.19)返蓝，盐酸酒精分化1s后1
×
pbst冲洗，每次5min，共3次；
143.20)脱水，将切片依次浸入75％乙醇、80％乙醇、95％乙醇和无水乙醇中，每个浓度的酒精中浸泡5min；
144.21)透明，将切片依次浸入二甲苯iii、二甲苯ii、二甲苯i中，每次10min；
145.22)切片置于通风橱内晾干，约1h后用中性树脂封片。
146.染色结果评判：显微镜下拍照，对200倍高倍镜下的免疫组化结果进行分析评分；评分规则为：
147.1)依据染色强度评0-3分，其中阴性为0分、浅棕色为1分、棕色为2分、深棕色3分；
148.2)依据染色阳性细胞所占比例评0-4分，其中0％-10％为0分、11％-25％为1分、26％-50％为2分、51％-75％为3分、75％-100％为4分；
149.3)总分＝染色强度积分
×
阳性细胞占比积分。
150.免疫组化染色的结果评分由两位不了解患者临床资料的病理科医生独立完成。我们将总分≥7分定义为高表达，0-7分为低表达。
151.2.3统计学分析
152.本研究使用graph pad prism 6.0和spss 25.0生成图片和统计分析。运用配对t检验(student’s paired t-test)对两组间的差异表达进行统计分析。采用卡方检验(chi-square test)分析prl-3表达与肝细胞癌患者临床病理特征的关系。应用kaplan-meier法和log-rank检验进行生存分析。用cox单因素和多因素回归分析探求prl-3和收集到的临床病理特征是否为预测肝细胞癌不良预后的独立危险因素。在本研究中p《0.05被认为差异具有统计学意义。
153.3结果
154.3.1inpp5f在肝癌组织与正常组织中的表达情况
155.为了研究inpp5f在人肝细胞癌中的潜在作用，首先通过oncomine数据库初步检索分析inpp5f在肝癌和正常肝组织中的mrna表达差异，结果显示在mas_hcc，wurmbach_hcc，roessler_hcc1和roessler_hcc2此4个数据集中inpp5f在肝癌组织中的表达较正常肝组织显著增高，差异均具有统计学意义(图1a-1d)。接着又用gepia数据库中的tcga-lihc数据集进一步验证这一结果，统计分析结果再次表明inpp5f在肝癌组织中表达量显著增高(图1e)。为了验证数据库的可靠性，本实施例收集了中山大学孙逸仙纪念医院术后病理证实的肝细胞癌标本88例用于rt-pcr检测，结果显示：与相对应的癌旁组织相比，inpp5f在肝癌组织中mrna表达量显著增高(p《0.05)，肿瘤分化程度低(图1f)。为验证inpp5f在肝细胞癌蛋白水平表达的差异，本实施例进一步利用本中心另外232例肝细胞癌患者的组织芯片进行免疫组化分析，检测肝细胞癌组织与配对的癌旁正常肝组织中inpp5f蛋白的表达情况，结果证明与数据库及mrna结果一致，inpp5f蛋白在肝细胞癌组织中的表达量也明显高于其在癌旁组织中的表达量(图1g)。这些结果证明相较于正常肝组织，肝癌组织中inpp5f表达上调。
156.3.2inpp5f与肝癌患者临床病理特征间的关系
157.为了研究inpp5f表达水平与肝细胞癌患者临床病理因素间的关系，把前述232例患者的组织芯片的免疫组化分组，得分为0-4的归为inpp5f低表达组，共108例；得分为8-12分的归为inpp5f高表达组，共124例。统计归纳这232例患者的相关临床病理特征，对于连续变量资料，依据文献常用的临界值(cutoff值)，将其转换成二分类变量。采用卡方检验进行数据分析，结果显示，inpp5f表达与患者的年龄(p＝0.8981)、性别(p＝0.0.5744)、hbv感染状态(p＝0.8973)、afp(p＝0.7579)、肿瘤数量(p＝0.8881)、血管侵犯(p＝0.8973)、淋巴结转移(p＝0.3458)、肿瘤包膜完整性(p＝0.8767)、tnm分期(p＝0.4478)腹水(p＝0.9358)门脉高压(p＝0.7321)均无相关性(表1)。而inpp5f的表达与患者是否伴有肝硬化、肿瘤大小、肿瘤分化程度相关，差异具有统计学意义。伴有肝硬化的患者inpp5f的表达量比无肝纤维化患者高(p＝0.0338)；肿瘤≥5cm的患者inpp5f的表达量较肿瘤＜5cm者高(p＝0.0400)；肿瘤分化差者inpp5f的表达量较分化好者高(p＝0.0414)。表1 inpp5f表达与肝细胞癌患者临床病理特征的关系
158.3.3inpp5f表达情况与肝癌患者预后的关系
159.在明确了inpp5f表达水平与肝硬化、肿瘤大小、肿瘤分化程度相关的基础上，进一步研究inpp5f对于肝细胞癌患者生存时间的影响。应用kaplan-meier法对肝细胞癌患者进行生存分析，用log-rank检验进行统计学检验，分析差异是否有统计学意义。gepia数据库中tcga-lihc数据集统计分析结果显示，inpp5f高表达组的患者总生存期较差(hr＝1.9，p《0.05)(图2a)。对本中心232例肝细胞癌患者依据inpp5f表达量分组后进行生存分析，结果同样显示inpp5f表达量较高的患者预后较差(hr＝1.458，p＝0.0355)，其中inpp5f高表达组生存时间1067天，明显低于inpp5f低表达组1701天(图2b-2c)。接下来通过cox比例风险回归模型研究肝细胞癌患者不良预后的危险因素。将表1中的临床病理资料以及inpp5f表达水平逐一进行单因素分析，结果显示肝细胞癌患者的预后与afp高表达、肿瘤大小、肿瘤多发性、肿瘤分化程度、血管侵犯情况、肿瘤包膜完整性、tnm分期、腹水、门脉高压和inpp5f的表达水平密切相关，而年龄、性别、hbv感染状态、是否伴有肝硬化则与患者预后无关(表2)。在此基础上进一步对有统计学差异的指标进行多因素分析，结果表明afp(hr＝3.107，p《0.001)、tnm(hr＝2.352，p《0.001)和inpp5f(hr＝1.666，p《0.010)是肝细胞癌预后的独立危险因素(表2)。这些数据表明inpp5f是肝细胞癌的独立危险因素之一，对预测患者预后具有一定价值。表2 cox单因素及多因素回归分析影响肝细胞癌患者预后的危险因素
实施例2(inpp5f促进肝癌细胞增殖与有氧糖酵解)
160.实施例1在组织学水平验证了inpp5f在肝癌组织中的表达量要明显高于正常肝组织，通过与患者的临床病理及预后特征统计分析，认为inpp5f的表达水平与患者的肿瘤大小、肿瘤分化程度、生存时间是密切相关的。本实施例将对inpp5f在肝细胞癌细胞中具体有怎样的生物学功能展开讨论。首先，在肝癌细胞中敲低和过表达inpp5f；其次，探究肝细胞癌中inpp5f表达水平的变化对细胞增殖、侵袭转移和有氧糖酵解的影响；最后，通过小鼠皮下及原位成瘤模型验证inpp5f对肝癌细胞成瘤能力的影响。
161.1材料
162.1.1肝癌细胞株
163.本实验采用的人永生化肝细胞株l02和人肝癌细胞株sk-hep1，mhcc-97，plc/prf/5，smmc-7721，huh7和hepg2均购买于中国科学院上海生命科学院细胞库。
164.1.2nod/scid小鼠
165.本实验所用的3-4周龄的雄性非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(non-obese diabetic/server combined immune-deficiency,nod/scid)小鼠采购于北京维通利华实验动物技术有限公司，购入后饲养于中山大学东校区动物实验中心spf动物房。适应性饲养一周后开始实验。所有涉及动物的实验程序均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的规定，并经中山大学动物伦理与福利委员会批准后进行。
166.1.3主要试剂及耗材要试剂及耗材
167.1.5主要溶液的配置
168.1)50um的edu溶液：用完全培养基按照1:1000稀释cell-light edu apollo643体外试剂盒中的的试剂a，即edu溶液，得到50um的edu溶液。
169.2)0.5％tritonx-100：将50ul tritonx-100加入10ml的pbs中，得到含0.5％tritonx-100的pbs，用于渗透细胞。
170.3)1
×
染色反应液：计算所需染色反应液量，50ul反应缓冲液(试剂b)，10ul催化剂溶液(试剂c)，3ul荧光染料溶液(试剂d)，缓冲添加剂(试剂e)与938ul双蒸水可配置1ml 1
×
染色反应液。
171.4)1
×
hoechst33342：cell-light edu apollo643体外试剂盒中的的试剂f为100
×
hoechst33342，将其用双蒸水按1:100稀释后得到1
×
hoechst33342。
172.2方法
173.2.1细胞培养
174.肝癌细胞株sk-hep1，mhcc-97h，plc/prf/5，hepg2和huh7用含有10％胎牛血清和1％抗生素的dmem培养基培养，永生化肝细胞l02和肝癌细胞株smmc-7721用含有10％胎牛血清和1％抗生素的rpmi-1640培养基培养，其余细胞培养操作方法如下：
175.细胞复苏：
176.1)将新鲜的完全培养基放入37℃水浴回温后，喷以75％酒精消毒，移入无菌操作台内备用；
177.2)自液氮罐中取出细胞冷冻管，注意佩戴手套，防止液氮冻伤双手，由于热胀冷缩，此时冻存管盖易松脱，注意检查管盖是否处于旋紧状态；
178.3)将取出的细胞冷冻管迅速放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动冷冻管使其在最短的时间内全部融化，避免冻存细胞冻存过程中产生的冰晶融化时进入细胞再次形成结晶损伤细胞，细胞解冻后，喷以酒精消毒，移入无菌操作台内；
179.4)在无菌工作台内将细胞冷冻管内液体全部移入离心管，向离心管内加入约2ml完全培养基，700rpm离心5min，移除上清液，向离心管中加入约1ml完全培养基重悬细胞，必要时取解冻细胞悬液作活性测试；
180.5)将细胞加入细胞培养瓶，盖紧瓶盖，光镜下观察细胞密度适当，放入恒温孵育箱培养。
181.细胞换液：
182.1)当细胞培养基由桃红色变为黄色，将培养瓶移出孵育箱，置于光镜下观察细胞生长情况；
183.2)培养瓶外壁以75％酒精消毒，移入超净工作台，弃去旧的培养液，加入2ml pbs漂洗两次；
184.3)向细胞培养瓶内加入与原培养基等量的完全培养基，然后将细胞培养瓶移入培养箱中继续培养。
185.细胞传代：
186.1)拧紧瓶盖，将培养瓶移出恒温孵育箱，光镜下观察贴壁细胞汇合至80％左右进行传代；
187.2)75％酒精消毒培养瓶外壁后将其移入超净工作台，弃去旧的培养液；
188.3)每培养瓶内加入2mlpbs约漂洗两次；
189.4)每培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1.0ml消化细胞，将培养瓶在水平方向轻轻摇动，使消化液铺满所有细胞表面，二者充分接触，待细胞层略有松动，肉眼可观察到薄膜现象，拧紧瓶盖，光镜下观察细胞变圆，细胞间连接消失，出现空隙，以酒精消毒培养瓶外壁，移入无菌操作台；
190.5)立即往细胞培养瓶内加入完全培养基2ml，终止胰酶消化，同时反复轻轻吹打细胞，注意操作轻柔，避免对细胞造成机械损伤，光镜下观察可见癌细胞重悬；
191.6)根据细胞量的多少，将细胞悬液等量分配至2-3个细胞培养瓶内，每瓶加入完全
培养基至5ml左右，移入培养箱中继续常规培养。
192.细胞冻存：
193.1)选取生长状态处于指数生长期的细胞，冻存前24小时更换培养基或传代，保证冻存之细胞状态良好；
194.2)使用前临时配制细胞冻存液：dmso在37℃解冻后逐滴加入胎牛血清中至终浓度为10％，避光待用；
195.3)将细胞培养液倒弃，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，消化良好后适时去掉胰蛋白酶，加入少量新鲜培养基终止消化，反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为细胞悬液，将细胞移入离心管中，离心(700rpm，5min)后弃去上清液；
196.4)缓慢逐滴加入细胞冻存液，并轻轻晃动离心管，混合均勾，制成细胞冻存悬液，储存与细胞冻存管中，严密封口后，注明细胞名称、日期、代数等信息，必要时取少许细胞悬液作污染检测；
197.5)将细胞冻存管置于常温的程序降温盒中，放置于-80℃的冰箱，直至温度降至-80℃后，将保种细胞从程序降温盒内取出，移入液氮罐，同时做好冻存记录。
198.2.2细胞sirna或质粒的瞬时转染
199.inpp5f的sirna序列为
200.实验步骤如下：
201.1)将待转染的细胞接种到6孔板中，观察细胞密度，在约60％-70％左右时进行转染；
202.2)转染前1h左右进行细胞换液，用无血清无双抗的培养基继续培养；
203.3)在无菌1.5ml的ep管中按每个孔4ul lipo3000与300ul opti-mem无血清培养液的量混合二者，混匀后静置10min；
204.4)将sirna或质粒与上述培养液混合(sirna每个孔加4ul，质粒每个孔加3ng)，质粒每个孔还需要另外加入4ul p3000，混匀后静置20min；
205.5)将4中所得含有sirna或质粒的培养液均匀滴入细胞后继续培养；
206.6)6-8h后，吸弃孔中培养液，更换新的完全培养液后继续培养；
207.7)考虑到瞬转效果持续约24-72h，取后转染后48小时的细胞进行后续实验。
208.2.3慢病毒感染及构建稳转细胞株
209.1)将待转染的细胞接种到6孔板中，观察细胞密度，在约60％-70％左右时进行转染；
210.2)将浓缩的慢病毒冰上溶化后，按推荐病毒滴度计算量加入到新鲜的完全培养液中，再加入5ug/ml polybrene，轻轻混匀后滴加到6孔板中继续培养；
211.3)培养24h后，观察细胞形态，若观察到细胞变圆、漂动等生存状态较差的情况，提示加入病毒浓度过高；观察细胞荧光表达情况，若可观察到荧光证明病毒感染成功；同时进
行细胞换液，更换不含病毒液的完全培养基后继续培养；
212.4)感染48小时后，加入2ug/ml嘌呤霉素筛选出稳定过表达inpp5f的肝癌细胞；
213.5)依据细胞状态，及时进行细胞换液及细胞传染，嘌呤霉素筛选1周后，检测inpp5f的表达水平。
214.2.4western blot
215.人抗兔inpp5f抗体western blot实验中稀释比例1:500。
216.细胞总蛋白提取
217.1)将生长状态良好的细胞置于冰上，吸干上清后，pbs漂洗3遍，加入含添加了蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂的裂解液，冰上裂解30min；
218.2)用清洗并预冷过的细胞刮取棒将细胞刮下，转移至标记好的1.5ml ep管中；
219.3)4℃、12000rpm离心15min，取上清分装于新的ep管中并置于－70℃保存或进行蛋白定量；
220.bca法蛋白定量
221.按照thermo fisher scientific公司的bca蛋白定量试剂盒的使用说明操作，稀释标准蛋白后，将待测样本、空白对照、不同浓度标准蛋白稀释液与工作液混合，混匀后37℃恒温孵育30min，用酶标仪检测各组在570nm波长处的吸光度，计算蛋白浓度。
222.western blot
223.1)sds－page电泳
224.a.选择合适的配胶浓度，配置下层胶，可用无水乙醇或水进行封胶；
225.b.观察下层胶是否充分凝固(此过程约15-20min)，倒去封胶的无水乙醇或水后，用吸水纸将其吸干；
226.c.配置上层浓缩胶，灌满剩余空间迅速将插入梳子，等浓缩胶凝固后拔出梳子；
227.d.准备蛋白样品，将已提取好的蛋白样品加入ep管中，与载缓冲液按4：1比例混匀，煮5-10min使蛋白变性，放入冰盒中；
228.e.加样，加入电泳缓冲液至其充满内侧小玻璃板，吸取蛋白缓慢加入样孔中；
229.f.电泳，设置上层浓缩胶电泳的电压100-120v，下层分离胶电泳的电压120-150v，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳；
230.2)转膜
231.a.准备4张与胶同样大小的滤纸和1张pvdf膜，放入转膜缓冲液中，pvdf膜需先在甲醇中浸湿以激活；
232.b.按照2张滤纸、膜、胶、另2张滤纸的顺序依次放好，中间需没有气泡；
233.c.将其放入转移槽中，冰浴下进行转膜，设置恒定电流320ma，150min；
234.d.转膜完成后，取出pvdf膜；必要时可用丽春红染液检测转膜成功与否(丽春红染液浸泡，洗净丽春红染液，如能看到pvdf膜上有清晰的蛋白条带，则说明转膜成功)。
235.3)免疫反应
236.a.封闭，将5g脱脂奶粉加入100ml tbst中，充分混匀后将pvdf膜浸入，脱色摇床上以60r/min速度室温孵育1h；
237.b.孵育一抗：用一抗稀释液按照说明书inpp5f，将稀释后抗体滴加与pvdf膜上，4℃孵育过夜；
238.c.孵育完后，复温至常温并吸去一抗，将pvdf膜置于脱色摇床130r/min条件下tbst中漂洗2次,tbs漂洗1次，每次10min，共3次；
239.d.孵育二抗:按1:10,000的比例将二抗加入tbst配制的5％脱脂奶粉中，将pvdf膜浸入后，摇床上室温孵育1h；
240.e.孵育完后tbst漂洗2次,tbs漂洗1次，每次10min，共3次。
241.4)显色曝光
242.pvdf膜平铺至x光片夹中，将配置好的ecl化学发光液滴加至pvdf膜，随后把塑料膜覆盖于pvdf膜上，用吸水纸吸尽多于液体。x光胶片放入x光片夹后曝光数秒至数分钟后显影冲洗。
243.2.5edu细胞增殖实验
244.edu(5-ethynyl-2
’‑
deoxyuridine)作为胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖过程中，可渗入正在复制的dna分子并代替胸腺嘧啶(t)，通过荧光染料与edu的特异性反应可得知细胞dna复制情况，从而检测细胞增殖活性。我们使用锐博生物的cell-light edu apollo643体外试剂盒检测inpp5f表达水平对细胞增殖的影响，具体操作如下：
245.1)取对数生长期不同inpp5f表达水平肝癌细胞接种于96孔板中，每孔5
×
104；
246.2)24小时后，每孔加入100ul 50um edu溶液，孵育2h；
247.3)吸弃edu溶液，pbs清洗细胞5min，共2次；
248.4)每孔加入50ul 4％多聚甲醛，室温固定细胞30min；
249.5)吸弃多聚甲醛，每孔加入50ul 2mg/ml甘氨酸，脱色摇床上孵育5min；
250.6)吸除甘氨酸溶液后，滴加pbs，脱色摇床上孵育5min以清洗细胞；
251.7)吸弃pbs，每孔加入100ul 0.5％tritonx-100渗透细胞，脱色摇床孵育10min；
252.8)吸弃孔中溶液，每孔加入100ul 1
×
染色反应液，脱色摇床上室温避光孵育30min；
253.9)弃染色反应液；加入100ul 0.5％tritonx-100，脱色摇床清洗10min，共3次；
254.10)弃渗透剂，每孔加入100ul 1
×
hoechst33342反应液，室温于摇床上避光孵育30min；
255.11)吸弃染色反应液，pbs清洗2次；
256.12)用高内涵成像分析系统观察拍照，计算edu阳性细胞占总细胞数的比例。
257.2.6平板细胞克隆形成实验
258.当单个细胞在体外增殖数代后，其后代所组成的细胞群体成为集落或克隆。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，形成克隆的细胞必然为贴壁和有增殖活力的细胞。故可测定细胞增殖能力，其具体实验步骤如下：
259.1)取处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，每孔2000个细胞；
260.2)轻缓摇晃6孔板，使细胞分布均匀，必要时可显微镜下观察其分布情况；
261.3)观察细胞生长状态，2-3天细胞换液一次；
262.4)约2周后，显微镜下观察到细胞数＞50个的细胞集落或肉眼见细胞克隆集落，终止培养。
263.5)吸弃上清液，pbs浸泡清洗5min，共3次；
264.6)每孔加入1ml 4％多聚甲醛进行细胞固定，孵育20min；
265.7)吸弃多聚甲醛，加入1ml结晶紫染液染色，孵育20min；
266.8)吸弃结晶紫染液，pbs浸泡清洗5min，共3次；
267.9)待6孔板干燥后，拍照并计算形成的细胞克隆集落数目。
268.2.7流式细胞术检测细胞周期
269.碘化丙锭(pi)具有结合细胞内dna和rna能力，用rna抑制剂消化rna后，pi与仅与dna结合，此时用流式细胞术检测到的pi荧光强度可直接反映细胞内dna含量，细胞周期各时相的dna含量不同，进而反应了细胞所处细胞周期。具体实验操作步骤如下：
270.1)去生长状态良好的肝癌细胞，消化重悬细胞后，pbs清洗细胞；
271.2)70％乙醇于-20℃环境预冷后，重悬细胞，-20℃固定过夜；
272.3)1000rpm 5min离心固定后的细胞，吸弃乙醇；
273.4)加入1ml pbs清洗细胞，1000rpm 5min离心后吸弃pbs；
274.5)加入200ul pbs重悬细胞后，加入5ul rnase a，室温避光孵育30min；
275.6)加入300ul pi染色液，室温避光孵育30min；
276.7)上机分析，使用流式细胞仪beckman cytoflex检测细胞周期。
277.2.8乳酸浓度测定
278.使用南京建成生物的乳酸测定试剂盒检测培养基中乳酸含量：
279.1)将不同inpp5f表达水平的肝癌细胞接种至6孔板中，细胞培养至融汇度约40％；
280.2)细胞换液，更换1.5ml新鲜的完全培养基，继续培养；
281.3)培养24h后，收集培养基；
282.4)按说明书所述步骤加入待测培养基、酶工作液、显色剂至96孔板中，漩涡混匀，37℃孵育30min；
283.5)加入终止剂终止反应；
284.6)使用酶标仪测量各孔在530nm波长处的吸光度，统计分析。
285.2.9葡萄糖浓度测定
286.使用南京建成生物的葡萄糖测定试剂盒检测培养基中葡萄糖含量，细胞培养及收集培养基操作同乳酸浓度测定，随后依据试剂盒的说明使用检测葡萄糖含量。
287.2.10transwell细胞迁移与侵袭实验
288.transwell细胞迁移实验：transwell小室是一种用于检测细胞运动能力的膜滤器，小室底层是带有微孔的膜，不同孔径有不同用途。通常选用孔径8um小室检测细胞运动能力。待测细胞以无血清培养基培养，接种至transwell小室内，在小室外的孔中加入高浓度血清的完全培养基，利用血清作为趋化因子，观察穿过小室的细胞数目，具体实验步骤如下：
289.1)将处于对数生长期、生长状态良好的细胞消化、离心后，用无血清培养基重悬细胞；
290.2)细胞计数后，调整细胞浓度；
291.3)24孔板中加入500ul含有20％胎牛血清的dmem培养基后，小心将transwell小室放入24孔板，避免接触面产生气泡影响实验结果；
292.4)将100ul的细胞悬浮液接种于transwell小室中，培养24h；
293.5)取出小室，用pbs浸泡清洗5min，共两次；
294.6)将transwell小室放入4％多聚甲醛进行固定细胞，室温浸泡30min；
295.7)再次用pbs浸泡清洗两次后，用棉签擦拭掉transwell小室内部未穿过膜的细胞；
296.8)将transwell小室放入结晶紫染液进行细胞染色，室温浸泡30min；
297.9)再次用pbs浸泡清洗两次后将小室倒置，待其干燥；
298.10)倒置显微镜下观察，随机挑选5个视野，拍照、计数后统计作图。
299.transwell细胞侵袭实验需先进行铺胶，具体步骤如下：
300.1)细胞铺板前一天将matrigel胶放入4℃冰箱，提前解冻；
301.2)同时将枪头及离心管置于4℃预冷；
302.3)用无血清的培养基稀释matrigel胶至1mg/ml，每个transwell小室加入100ul matrigel胶于小室底部，注意使其分布均匀；
303.4)小室放入24孔板内，37℃孵育4-5h，使matrigel胶凝固。
304.其余步骤与transwell细胞迁移实验相同。
305.2.11细胞划痕实验
306.1)取处于对数生长期，生长状态良好的肝癌细胞接种于六孔板中；
307.2)待细胞融汇度接近100％时，用中枪头和六孔板板盖在每个孔中划3道平行的纵痕；
308.3)pbs浸泡清洗两次，洗去脱落细胞后，更换无血清培养基，继续培养；
309.4)48h后显微镜下观察细胞向划痕位置细胞情况并拍照；
310.5)划痕愈合比例＝(0h划痕宽度
–
48h划痕宽度)/0h划痕宽度，反应细胞迁移速度及能力。
311.2.12小鼠皮下成瘤实验
312.1)取处于对数生长期的细胞，消化、离心并用pbs清洗后，用pbs重悬细胞；
313.2)细胞计数调整细胞浓度至5
×
106个/100ul，将细胞悬液分装至ep，每管100ul，并加入100ul基质胶使细胞更易成瘤；
314.3)将裸鼠随机分为两组，每组4只，剪刀剪耳朵进行标；
315.4)用胰岛素针吸取200ul细胞与基质胶混合液，选择裸鼠左侧腋下接种，酒精棉球擦拭进针部位后进针；
316.5)定期观察小鼠情况，包括一般活动、营养状态、体重、成瘤情况等，若裸鼠形成肿瘤直径超过1.5cm或观察到小鼠体重骤减、精神萎靡，应及时处死小鼠；
317.6)四周后颈椎脱臼法处死裸鼠，完整取出皮下肿瘤组织，拍照并测量肿瘤长径和短径；
318.7)计算肿瘤，肿瘤体积＝长
×
宽2
×
0.5，统计分析数据。
319.2.13小鼠肝原位成瘤实验
320.1)取处于对数生长期的有荧光素酶标记mhcc-97h细胞(mhcc-97h-shinpp5f、mhcc-97h-nc),消化、离心后，pbs清洗并重悬细胞；
321.2)细胞计数后调整细胞浓度，将细胞悬液分装至ep管，每管100ul，含2
×
106个细胞；
322.3)将nod/scid小鼠随机分为两组，每组3只，分组剪耳标记；
323.4)用胰岛素针吸取细胞悬液注射到nod/scid小鼠的肝包膜下；
324.5)观察小鼠营精神、营养状态，若出现萎靡、消瘦，提前处理小鼠；
325.6)6周后使用小动物活体成像系监测小鼠肝脏部位荧光状态并拍照。
326.3结果
327.3.1inpp5f敲低和过表达转染肝癌细胞后转染效率鉴定
328.为研究inpp5f在肝癌中的生物学功能，首先构建inpp5f敲低和过表达的肝癌细胞株。通过rt-pcr和western blot方法，以正常永生化肝细胞l02作为阴性对照，检测肝癌细胞系中inpp5f的相对表达量。实验结果显示与l02细胞相比，inpp5f在肝癌细胞中mrna和蛋白相对表达量均是显著升高的；并且其在sk-hep1和mhcc-97h中表达量最高，在huh7和hepg2中表达量较低(图3a-3b)。选择表达量最高sk-hep1和mhcc-97h对其inpp5f基因进行敲低。将方法学所述的两条针对inpp5f的sirna和其阴性对照nc通过lipofectamin 3000转染sk-hep1细胞。用rt-pcr和western blot实验评估sirna的转染效率。结果显示转染sirna1与sirna2的肝癌细胞中inpp5f的表达量均明显低于转染sinc的肝癌细胞(图3c-3d)。进一步将sirna序列设计包装成shrna慢病毒，其感染sk-hep1和mhcc-97h细胞后，使用嘌呤霉素筛选得到inpp5f稳定敲低的细胞，rt-pcr和western blot实验结果显示inpp5f sh1和inpp5f sh2能抑制肝癌细胞inpp5f的表达(图3e-3f)。选择表达量相对最较低的huh7和hepg2细胞系对其inpp5f基因进行过表达。将inpp5f开放阅读框克隆到pcdna3.1后，用其与阴性对照pcdna3.1-control转染肝癌细胞，同样用rt-pcr和wesrtern blot检测转染效率，结果显示pcdna3.1-inpp5f转染后的细胞中inpp5f表达量显著增高(图3g-3h)。
329.3.2inpp5f促进肝癌细胞增殖
330.实施例1中inpp5f与临床病理特征关系的分析结果显示，inpp5f在肿瘤直径≥5cm的肝细胞癌中显着高表达，这提示inpp5f与肝癌细胞增殖能力之间可能存在联系。因此，首先通过edu细胞增殖检测探究inpp5f表达量对肝癌细胞增殖的影响。实验结果显示当肝癌细胞敲低inpp5f后，其edu阳性细胞所占百分比显著降低；反之当肝癌细胞过表达inpp5f后，其edu阳性细胞所占百分比显著升高，差异有统计学意义(图4a-4c)。接着应用平板细胞克隆形成实验验证该结果，发现inpp5f表达水平较低的肝癌细胞形成的细胞克隆集落数目也明显较少(图4d-4e)。进一步通过体外流式细胞周期检测方法研究敲低或过表达inpp5f后对于肝癌细胞周期的影响。结果表明inpp5f表达下调使肝癌细胞停滞在细胞周期g1期，处于s期和g2期的肝癌细胞数目明显减少；而inpp5f的过表达则使g1期肝细细胞减少，处于s期和g2期的肝癌细胞数目明显增多(图4f)。这些发现表明inpp5f促进肝癌细胞增殖，并且该作用可能通过影响细胞周期的g1/s期转变而实现。
331.3.3inpp5f增强肝癌细胞有氧糖酵解
332.在构建inpp5f敲低的稳转细胞时，观察到阴性对照肝癌细胞的培养基与inpp5f敲低的肝癌细胞培养基相比更容易变黄(图5a)，这提示inpp5f敲低的肝癌细胞培养基中的乳酸浓度可能较低，因此推测inpp5f与肝细胞癌的有氧糖酵解有关。首先用乳酸测定试剂盒检测inpp5f敲低或过表达的肝癌细胞中乳酸生成量，结果显示敲低inpp5f使乳酸产量降低，而inpp5f过表达乳酸产量增加(图5b)。有氧糖酵解过程中需要消耗葡萄糖来生成乳酸，故用葡萄糖测定试剂盒进一步检测了inpp5f敲低和过表达细胞的葡萄糖消耗情况。实验结果与乳酸生成一致，inpp5f敲低的肝癌细胞葡萄糖消耗降低，而inpp5f过表达的肝癌细胞
葡萄糖消耗增加(图5c)。这些数据表明inpp5f增强肝癌细胞的有氧糖酵解。
333.3.4inpp5f对肝癌细胞侵袭转移的影响
334.首先用transwell迁移实验研究敲低或过表达inpp5f后对于肝癌细胞迁移能力的影响。实验结果显示inpp5f表达水平的变化不会影响肝癌细胞迁移能力(图6a-6d)。用matrigel胶处理transwell小室后进行transwell侵袭实验研究inpp5f对侵袭能力的影响。实验发现inpp5f敲低或过表达后，穿过matrigel胶的肝癌细胞数目无明显差异，即inpp5f表达水平的变化不影响肝癌细胞侵袭能力(图6e-6h)。最后，用细胞划痕实验做进一步验证，实验结果表明肝癌细胞inpp5f表达下调或上调对其划痕48小时后的愈合率无显著异常，再次证实了inpp5f对肝癌细胞迁移和侵袭没有显著影响(图6i-6k)。
335.3.5inpp5f表达改变影响小鼠体内肿瘤生长
336.在体外实验发现的inpp5f为癌基因的基础上，建立小鼠皮下异种移植模型和肝原位异种移植模型，以探究inpp5f在动物体内是否也具有促癌作用。用处于对数生长期的mhcc-97h细胞(mhcc-97h-sh、mhcc-97h-ctrl)行小鼠皮下注射成瘤实验，观察并记录肿瘤生长情况。注射四周后用ivis成像系统对小鼠进行生物发光监测。结果显示在inpp5f敲低组中形成的肿瘤明显较对照组小(图7a)。随后处死裸鼠并取出肿瘤组织，肉眼观察发现inpp5f敲低组小鼠的肿瘤明显小于对照组小鼠(图7b)。分别称量两组小鼠肿瘤组织的重量，发现inpp5f敲低组裸鼠的肿瘤较对照组轻，其差异有统计学意义(图7c)。皮下注射后依据实验方法所描述观察记录小鼠皮下肿瘤体积，发现inpp5f敲低组中形成的肿瘤体积增长明显缓慢且小于对照组(图7d)。接下来对肿瘤组织进行了h&e染色，显微镜下可见细胞核出现明显的异型性、核质比过大，伴有坏死，从而在病理上证实了这些组织为肿瘤组织。且h&e染色结果显示inpp5f敲低组中坏死较少，核异型性弱(图7e)。再通过免疫组化染色，检测两组inpp5f及ki67蛋白的表达情况。结果显示inpp5f-sh组肿瘤的inpp5f表达量低于inpp5f-ctrl组，表明肿瘤组织中inpp5f的表结果达与接种细胞中inpp5f的表达量一致(图7e)。此外，inpp5f敲低组ki67表达量较对照组低，表明inpp5f与肿瘤组织的增殖呈正相关(图7e)。最后，通过在nod/scid小鼠肝包膜下原位注射处于对数生长期的mhcc-97h细胞(mhcc-97h-sh和mhcc-97h-ctrl)来建立肝原位异种移植模型。注射六周后用ivis成像系统对小鼠进行生物发光监测。与皮下异种移植模型结果一致，inpp5f下调有效的抑制了小鼠肝脏中原位异种移植肿瘤的生长(图7f)。综上所述，inpp5f在动物体内也可以促进肝癌细胞的增殖。实施例3(inpp5f促进肝癌细胞增殖的机制研究)
337.实施例2通过体内细胞实验验证了inpp5f蛋白在肝细胞癌中可促进细胞增殖与有氧糖酵解，小鼠皮下异种移植模型和肝原位异种移植模型则表明inpp5f在体内也可以促进肝癌细胞的增殖。本实施例通过转录组测序技术以明确inpp5f下游基因的表达变化；同时，通过蛋白质谱分析鉴定inpp5f的相互作用蛋白，并进一步探究该靶基因是否参与inpp5f促进肝癌细胞增殖过程。
338.1材料
339.1.1主要试剂及耗材
340.涉及引物序列如下：
341.涉及western blot所用抗体及浓度如下：
342.1.2主要仪器设备
343.实验所需的仪器设备
344.1.3主要溶液的配置
345.(1)电泳液：配置10
×
电泳液，称量tris base 30.3g，甘氨酸144.1g，sds 10g，加入双蒸水定容至1l，搅拌混匀；使用前稀释成1
×
电泳液。
346.(2)转膜液：配置10
×
转膜液，称量甘氨酸144.14g，tris base 30.28g，加入双蒸水定容至1l，搅拌混匀；使用前稀释成1
×
转膜液，再将800ml 1
×
转膜液与200ml甲醇混匀。
347.(3)tbs溶液：配置10
×
tbs溶液，称量氯化钠88g，tris base 24g，盐酸调整ph到7.5，加入双蒸水定容至1l，搅拌混匀；使用前稀释成1
×
tbs溶液。
348.(4)tbst溶液：1l 1
×
tbs溶液中加入1ml tween-20，振荡使其充分混匀。
349.(5)5％脱脂牛奶：称量5g脱脂奶粉，加至100ml 1
×
tbst溶液中，摇床上充分混匀。
350.2方法
351.2.1rna测序
352.rna测序(rna sequencing，rna-seq)又称转录组高通量测序或全转录组鸟枪法测序，其通过测定稳定状态下的rna样品的序列来对rna样品进行研究，以了解rna的表达水平。具体操作如下：
353.1)将肝癌细胞sk-hep1均匀铺板于六孔板中，每组3个复孔；
354.2)次日转染sirna得到，敲低inpp5f的sk-hep1-shinpp5f细胞与其对照组sk-hep1-ctrl；
355.3)转染后约36h，细胞融汇度达到80％-90％，吸弃培养液，并用pbs浸洗细胞2次；
356.4)提取细胞总rna，操作如前所述；
357.5)后续rna质检、转录组文库制备、测序及数据分均交由上广州基迪奥有限公司完成。
358.2.2免疫共沉淀与蛋白质谱
359.免疫共沉淀用于检测蛋白-蛋白相互作用，其原理为细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内的许多蛋白－蛋白相互作用可被保留。用已知蛋白的抗体免疫沉淀该蛋白时，与其在细胞内结合的蛋白也同时被沉淀下来。蛋白质谱技术可通过质谱仪分析蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物来鉴定蛋白质，二者结合可以明确与已知蛋白的相互作用的靶蛋白。
360.本实施例用thermo fisher公司的pierce
tm
免疫共沉淀试剂盒行免疫共沉淀实验，具体操作如下：
361.1)抗体固定化：
362.a.在pierce离心柱中，用截短枪头加入20ul aminolink偶联树脂，置于离心管内，1000
×
g离心1min，弃掉流穿液；
363.b.将200ul 1
×
交联缓冲液加入离心柱中洗涤树脂，1000
×
g离心1min，弃掉流穿液，插入底盖；
364.c.将182ul超纯水、10ul 20
×
交联缓冲液和8ul flag抗体加入离心柱中，并在通风橱内加入3ul氰基硼氢化钠，盖上螺旋盖，室温下于旋转器上孵育90min；
365.d.1000
×
g离心1min后弃流穿液，再次将200ul 1
×
交联缓冲液加入离心管中洗涤树脂，共2次；
366.e.加200ul淬灭缓冲液至离心柱，离心后弃掉流穿液，插入底盖；再次加入200ul淬灭缓冲液至离心柱，并在通风橱内加入3ul氰基硼氢化钠，盖上螺旋盖，室温下于旋转器上孵育15min；
367.f.1000
×
g离心1min后弃流穿液，再次将200ul 1
×
交联缓冲液加入离心管中洗涤树脂两次；将150ul洗涤缓冲液加入离心管中洗涤树脂，共6次。
368.2)制备细胞裂解液：
369.a.取生长状态良好细胞接种于10cm皿中，用flag-inpp5f或ha-asph质粒转染到huh7细胞；
370.b.转染48-72h后，观察细胞融汇度，约80％-90％时可吸弃完全培养基，随后将2ml改良型杜氏pbs加入皿中，清洗细胞5min；
371.c.将培养皿置于冰上并将1ml预冷处理后的ip裂解/洗涤缓冲液加入其中，孵育5min；
372.d.用清洗并预冷过的细胞刮取棒将细胞刮下并转移到标记好的1.5ml ep管中，13000
×
g离心20min；
373.e.取上清装于新的ep管中测定蛋白浓度；
374.f.在新离心柱中加入80ul对照琼脂糖树脂，置于离心管内，1000
×
g离心1min，弃掉流穿液；
375.g.加入100ul 1
×
交联缓冲液洗涤树脂；
376.h.将测完蛋白浓度的细胞裂解液加入离心柱中，盖上底盖，4℃条件下旋转器上孵育1h，离心后保留流穿液体。
377.3)免疫共沉淀，所有操作在4℃下进行：
378.a.将200ul ip裂解/洗涤缓冲液加入1中所制备有抗体固定化树脂的离心柱中洗涤树脂，共2次，插入底盖；
379.b.将2中预处理后的细胞裂解液加入离心柱中，盖上螺旋盖，旋转器上4℃孵育过夜；
380.c.离心后弃掉流穿液，将离心柱放入到新的收集管中，加入200ul ip裂解/洗涤缓冲液洗样品3次。
381.4)免疫共沉淀洗脱
382.a.将离心柱置于一个新的收集管中，加入10ul洗脱缓冲液并离心；
383.b.加入50ul洗脱缓冲液，室温下静置5min。不需要盖上离心柱或混匀。
384.c.离心并收集流穿液，送蛋白质谱检测，或行western blot验证。
385.蛋白质谱分析由中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心实施。
386.2.3免疫荧光
387.人抗兔inpp5f抗体免疫组化中稀释比例为1:100。
388.免疫荧光实验方法：
389.1)将生长状态良好的肝癌细胞接种于共聚焦皿中，接种细胞不宜过密；
390.2)24h后取出共聚焦皿，吸弃培养基，用1
×
pbs浸泡清洗3min，共3次；
391.3)滴加500ul 4％多聚甲醛至共聚焦皿中固定细胞，室温20min；
392.4)吸出全部4％多聚甲醛，加入500ul 0.3％triton x-100通透细胞，室温10min；
393.5)再次用1
×
pbs浸泡清洗共聚焦皿3min 3次后，滴加2％bsa，室温封闭1h；
394.6)用一抗稀释液按照说明书推荐浓度稀释相关抗体；
395.7)吸弃共聚焦皿中封闭液，滴加200ul稀释好的一抗抗体，4℃孵育过夜；
396.8)将共聚焦皿置于脱色摇床上，1
×
pbs清洗5min，共3次；
397.9)吸弃pbs，滴加按1：800稀释后的荧光二抗，室温避光孵育1h；
398.10)再次将共聚焦皿置于脱色摇床上，1
×
室温避光孵育5min；
399.11)再次1
×
pbs清洗后，吸出pbs，滴加抗荧光淬灭剂进行封片；
400.12)在共聚焦显微镜下观察并采集图像。
401.2.4构建inpp5f突变体与截短体
402.通过生物信息学工具预测了inpp5f氨基酸序列中的核定位信号(nuclear localization signals,nlss)和核输出信号(nuclear export signals,ness)(nls：http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/nls_mapper_form.cgi，nes：http://www.cbs.dtu.dk/services/netnes)。在构建ness突变时，将预测的ness中的亮氨酸更改为丙氨酸，以使inpp5f失去核输出能力。在构建nlss截短时，通过在预测的nlss中截去不同长度的氨基酸序列，使inpp5f核定位能力被抑制，以促进inpp5f出核专员。截短体1截去0-83；截短体2截去0-113；截短体3截去0-154。将突变和截短序列克隆到质粒pcdna3.1中。
403.ness突变(llkmfm突变为aakmfm)的inpp5f氨基酸序列：
404.melfqakdhyilqqgeralwcsrrdgglqlrpatdlllawnpiclglvegvigkiqlhsdlpwwlilirqkalvgklpgdhevckvtkiavlslsemepqdlelelckkhhfginkpekiipspddskfllktfthiksnvsapnkkkvkeskekeklerrlleeaakmfmdsesfyysltydltnsvqrqstgerdgrplwqkvddrffwnkymiqdlteigtpdvdfwiipmiqgfvqieelvvnytessddeksspetppqestcvddihprflvalisrrsrhragmrykrrgvdkngnvanyveteqlihvhnhtlsfvqtrgsvpvfwsqvgyrynprprldrseketvayfcahfeeqlniykkqviinlvdqagrekiigdaylkqvllfnnshltyvsfdfhehcrgmkfenvqtltdaiydiildmkwcwvdeagvickqegifrvncmdcldrtnvvqaaiarvvmeqqlkklgvmppeqplpvkcnriyqimwanngdsisrqyagtaalkgdftrtgerklagvmkdgvnsanryylnrfkdayrqavidlmqgipvtedlysiftkekehealhkenqrshqelisqllqsymklllpddekfhggwalidcdpslidathrdvdvllllsnsayyvayyddevdkvnqyqrlslenlekieigpeptlfgkpkfscmrlhyrykeasgyfhtlravmrnpeedgkdtlqciaemlqitkqamgsdlpiiekklerksskphediigirsqnqgslaqgknflmskfsslnqkvkqtksnvnignlrklgnftkpemkvnflkpnlkvnlwksdssletmentgvmdkvqaesdgdmssdndsyhsdefltnsksdedrqlanslesvgpidyvlpscgiiasaprlgsrsqslsstdssvhapseitvahgsglgkgqesplkkspsagdvhiltgfakpmdiychrfvqdaqnkvthlsetrsvsqqasqernqmtnqvsnetqsesteqtpsrpsqldvslsatgpqflsvepahsvasqktptsassmleletglhvtpspsessssravspfakirssmvqvasitqaglthginfavskvqksppepeiinqvqqnelkkmfiqcqtriiqi(seq id no:3)
405.nlss截短的inpp5f氨基酸序列1：(去除elfqakdhyilqqgeralwcsrrdgglqlrpatdlllawnpiclglvegvigkiqlhsdlpwwlilirqkalvgklpgdhev)
406.mkvtkiavlslsemepqdlelelckkhhfginkpekiipspddskfllktfthiksnvsapnkkkvkeskekeklerrlleellkmfmdsesfyysltydltnsvqrqstgerdgrplwqkvddrffwnkymiqdlteigtpdvdfwiipmiqgfvqieelvvnytessddeksspetppqestcvddihprflvalisrrsrhragmrykrrgvdkngnvanyveteqlihvhnhtlsfvqtrgsvpvfwsqvgyrynprprldrseketvayfcahfeeqlniykkqviinlvdqagrekiigdaylkqvllfnnshltyvsfdfhehcrgmkfenvqtltdaiydiildmkwcwvdeagvickqegifrvncmdcldrtnvvqaaiarvvmeqqlkklgvmppeqplpvkcnriyqimwanngdsisrqyagtaalkgdftrtgerklagvmkdgvnsanryylnrfkdayrqavidlmqgipvtedlysiftkekehealhkenqrshqelisqllqsymklllpddekfhggwalidcdpslidathrdvdvllllsnsayyvayyddevdkvnqyqrlslenlekieigpeptlfgkpkfscmrlhyrykeasgyfhtlravmrnpeedgkdtlqciaemlqitkqamgsdlpiiekklerksskphediigirsqnqgslaqgknflmskfsslnqkvkqtksnvnignlrklgnftkpemkvnflkpnlkvnlwksdssletmentgvmdkvqaesdgdmssdndsyhsdefltnsksdedrqlanslesvgpidyvlpscgiiasaprlgsrsqslsstdssvhapseitvahgsglgkgqesplkkspsagdvhiltgfakpmdiychrfvqdaqnkvthlsetrsvsqqasqernqmtnqvsnetqsesteqtpsrpsqldvslsatgpqflsvepahsvasqktptsassmleletglhvtpspsessssravspfakirssmvqvasitqaglthginfavskvqksppepeiinqvqqnelkkmfiqcqtriiqi(seq id no:4)
407.nlss截短的inpp5f氨基酸序列2：(去除elfqakdhyilqqgeralwcsrrdgglqlrpatdlllawnpiclglvegvigkiqlhsdlpwwlilirqkalvgklpgdhevckvtkiavlslsemepqdlelelckkhhfgi)
408.mnkpekiipspddskfllktfthiksnvsapnkkkvkeskekeklerrlleellkmfmdsesfyysltydltnsvqrqstgerdgrplwqkvddrffwnkymiqdlteigtpdvdfwiipmiqgfvqieelvvnytessddeksspetppqestcvddihprflvalisrrsrhragmrykrrgvdkngnvanyveteqlihvhnhtlsfvqtrgsvpvfwsqvgyrynprprldrseketvayfcahfeeqlniykkqviinlvdqagrekiigdaylkqvllfnnshltyvsfdfhehcrgmkfenvqtltdaiydiildmkwcwvdeagvickqegifrvncmdcldrtnvvqaaiarvvmeqqlkklgvmppeqplpvkcnriyqimwanngdsisrqyagtaalkgdftrtgerklagvmkdgvnsanryylnrfkdayrqavidlmqgipvtedlysiftkekehealhkenqrshqelisqllqsymklllpddekfhggwalidcdpslidathrdvdvllllsnsayyvayyddevdkvnqyqrlslenlekieigpeptlfgkpkfscmrlhyrykeasgyfhtlravmrnpeedgkdtlqciaemlqitkqamgsdlpiiekklerksskphediigirsqnqgslaqgknflmskfsslnqkvkqtksnvnignlrklgnftkpemkvnflkpnlkvnlwksdssletmentgvmdkvqaesdgdmssdndsyhsdefltnsksdedrqlanslesvgpidyvlpscgiiasaprlgsrsqslsstdssvhapseitvahgsglgkgqesplkkspsagdvhiltgfakpmdiychrfvqdaqnkvthlsetrsvsqqasqernqmtnqvsnetqsesteqtpsrpsqldvslsatgpqflsvepahsvasqktptsassmleletglhvtpspsessssravspfakirssmvqvasitqaglthginfavskvqksppepeiinqvqqnelkkmfiqcqtriiqi(seq id no:5)
409.nlss截短的inpp5f氨基酸序列3：(去除elfqakdhyilqqgeralwcsrrdgglqlrpatdlllawnpiclglvegvigkiqlhsdlpwwlilirqkalvgklpgdhevckvtkiavlslsemepqdlelelckkhhfginkpekiipspddskfllktfthiksnvsapnkkkvkeskek)
410.meklerrlleellkmfmdsesfyysltydltnsvqrqstgerdgrplwqkvddrffwnkymiqdlteigtpdvdfwiipmiqgfvqieelvvnytessddeksspetppqestcvddihprflvalisrrsrhragmrykrrgvdkngnvanyveteqlihvhnhtlsfvqtrgsvpvfwsqvgyrynprprldrseketvayfcahfeeqlniykkqviinlvdqagrekiigdaylkqvllfnnshltyvsfdfhehcrgmkfenvqtltdaiydiildmkwcwvdeagvickq
egifrvncmdcldrtnvvqaaiarvvmeqqlkklgvmppeqplpvkcnriyqimwanngdsisrqyagtaalkgdftrtgerklagvmkdgvnsanryylnrfkdayrqavidlmqgipvtedlysiftkekehealhkenqrshqelisqllqsymklllpddekfhggwalidcdpslidathrdvdvllllsnsayyvayyddevdkvnqyqrlslenlekieigpeptlfgkpkfscmrlhyrykeasgyfhtlravmrnpeedgkdtlqciaemlqitkqamgsdlpiiekklerksskphediigirsqnqgslaqgknflmskfsslnqkvkqtksnvnignlrklgnftkpemkvnflkpnlkvnlwksdssletmentgvmdkvqaesdgdmssdndsyhsdefltnsksdedrqlanslesvgpidyvlpscgiiasaprlgsrsqslsstdssvhapseitvahgsglgkgqesplkkspsagdvhiltgfakpmdiychrfvqdaqnkvthlsetrsvsqqasqernqmtnqvsnetqsesteqtpsrpsqldvslsatgpqflsvepahsvasqktptsassmleletglhvtpspsessssravspfakirssmvqvasitqaglthginfavskvqksppepeiinqvqqnelkkmfiqcqtriiqi(seq id no:6)
411.3结果
412.3.1inpp5f上调肝癌中c-myc和细胞周期蛋白e1的表达
413.为了探求inpp5f在肝细胞癌中的具体作用机制，通过rna-seq比较了sk-hep1-ctrl和sk-hep1-shinpp5f之间的全基因组转录组，并通过统计分析获得了差异表达基因(differentially expressed genes，degs)。以1.5倍变化作为临界值，发现了200个上调的degs和218个下调的degs(图8a-8b)。go富集分析显示，在被发现的degs中有59个与细胞生长相关，其中29个与细胞周期相关；除此之外，在degs中也发现了许多已被报道的与有氧糖酵解相关的基因(图8c)。在与有氧糖酵解相关的degs中，选择hk2，hif1a，glut1以及glut3进行进一步验证，以探究inpp5f影响有氧糖酵解的可能下游基因。rt-pcr结果显示inpp5f敲低可以减少这些基因的表达；相反，inpp5f的过表达可以上调这些基因的表达(图8d)。由于实施例2中发现inpp5f可能通过调节细胞周期g1/s转换过程来影响细胞增殖，因此重点研究g1/s期相关degs；其中c-myc和cyclin e1研究报道多，故用这两个基因做进一步验证。首先用rt-pcr和western blot实验确认在inpp5f敲低和过表达的肝癌细胞中c-myc和cyclin e1表达水平与rna-seq结果一致。实验结果表明inpp5f敲低显著减少了sk-hep1和mhcc-97h中c-myc和cyclin e1的表达，而inpp5f过表达增加了huh7细胞中的这两个基因表达(图9a-9d)。为验证c-myc和cyclin e1是否参与inpp5f促进肝癌细胞调控过程，本实施例设计了c-myc和cyclin e1的sirna，转染inpp5f过表达的huh7和hepg2细胞后，应用平板细胞克隆形成实验检测c-myc和cyclin e1敲低对inpp5f过表达所促进的肝癌细胞增殖的影响。克隆形成实验结果显示c-myc和cyclin e1敲低显著抑制了inpp5f促进细胞增殖(图9e-9f)。以上数据表明inpp5f可通过c-myc和cyclin e1调控细胞周期g1/s转换和细胞增殖。
414.3.2inpp5f通过与asph相互作用激活notch信号通路
415.接下来探究inpp5f在肝细胞癌中是如何调控其下游分子的表达。已有文献报道细胞质中的akt、mtor、stat3信号转导通路是inpp5f的下游，故先用western blot检测这些通路的激活情况，实验结果提示在肝细胞癌中inpp5f不能激活akt、mtor和stat3信号(图10a)。随后，本实施例在huh7细胞中用免疫共沉淀结合蛋白质谱技术来探索与inpp5f相互作用的蛋白，这些蛋白可能介导inpp5f在肝细胞癌中的生物学功能。本实施例构建了含有flag标签的inpp5f过表达的huh7细胞，分析出天冬氨酸-β-羟化酶(aspartate-β-hydroxylase，asph)是inpp5f潜在的相互作用蛋白(图10b)。既往报道表明asph在肝细胞癌发生发展过程中发挥重要作用。为进一步明确inpp5f与asph之间存在相互作用，本实施例
构建了含有ha标签的asph过表达的huh7细胞，利用免疫共沉淀结合western blot技术在ha-asph与flag-inpp5f的huh7细胞中验证inpp5f与asph的相互作用，实验结果证实了二者的直接结合(图10c-10d)。通过rt-pcr、western blot实验我们发现inpp5f表达水平的改变无论在mrna水平或蛋白质水平上均不影响asph的表达情况(图10e-10h)，这提示inpp5f在肝细胞癌中可能是通过影响asph的功能而非其表达水平来发挥作用。
416.既往研究显示，notch通路是asph下游的信号传导通路。与此同时，既往研究也发现c-myc和cyclin e1是notch信号通路的作用靶点。因此本实施例探究inpp5f是否通过结合asph激活notch信号传导通路发挥作用。用western blot检测inpp5f敲低和过表达的肝癌细胞中notch信号通路中经典蛋白的表达情况。结果显示在inpp5f敲低的肝癌细胞中，notch1细胞内结构域(notch 1intracellular domain，nicd)及其下游hes1和hey1的表达降低；而其在inpp5f过表达的肝癌细胞中升高(图11a)。为增强说服力，本实施例设计构建了两条sirna敲低asph进行补救实验，以证实在肝细胞癌中inpp5f需要与asph结合才可激活notch信号通路来促发挥其促癌作用。用asph sirna转染inpp5f过表达的huh7细胞后，先用rt-pcr和western blot检测下游分子在mrna和蛋白水平的表达变化。实验结果提示在mrna和蛋白水平上，inpp5f介导的notch信号通路激活以及c-myc和cyclin e1的表达上调都因asph表达下调而被显着抑制(图11b-11c)。进而探究该通路在生物学功能上的影响。edu实验结果表明asph敲低显着减弱inpp5f上调引起的细胞增殖(图11d-11e)。流式细胞学检测结果进一步证实asph敲低使因inpp5f过表达而促进的细胞周期g1/s转变减少，更多细胞滞留在g1期(图11f)。乳酸生成量和葡萄糖消耗量测定结果发现，asph表达下调抑制有氧糖酵解，缓解inpp5f依赖的乳腺产量和葡萄糖消耗的增加(图11g-11h)。综上所述，inpp5f通过与asph相互作用激活了肝癌细胞中的notch信号传导途径，从而增强细胞增殖和有氧糖酵解。
417.3.3inpp5f易位进入细胞质以显示其致癌活性
418.在评估inpp5f的免疫组化染色过程中发现在癌旁正常肝组织中inpp5f多位于细胞核中，而肝细胞癌组织中inpp5f多位于细胞质中。根据inpp5f在组织芯片中癌旁正常肝组织(non-tumor)和肿瘤组织(tumor)中细胞核染色情况，将患者分为4种模式：模式1为癌旁正常肝组织核阳性而肿瘤组织核阴性(n t-)，共70例，占30.17％；模式2为癌旁正常肝组织与肿瘤组织核染色均为阳性(n t )，共16例，占6.90％；模式3为癌旁正常肝组织与肿瘤组织核染色均为阴性(n-t-)，共136例，占58.62％；模式4为癌旁正常肝组织核阴性而肿瘤组织核阳性(n-t )，共10例，占4.31％(图12a-12b)。依据肝细胞癌患者的癌旁肝组织中inpp5f的核阳性染色情况将其分为两组，核阳性组(模式1 模式2)与核阴性组(模式3 模式4)，应用kaplan-meier法对两组患者进行生存分析，以明确inpp5f的亚细胞定位是否影响其总体生存时间。分析结果表明核阳性组肝癌患者的预后更好，其差异有统计学意义(p＝0.0253)(图12c)。基于以上结果推测inpp5f从细胞核转运到细胞质对其发挥致癌作用有较大影响。
419.为了证明上述推测，首先应用免疫荧光检测inpp5f在肝癌细胞中的定位，发现在肝癌细胞的细胞核与细胞质中均有inpp5f表达，但其主要位于细胞质内(图13a)。接下来用蛋白出核转运抑制剂来普霉素b(leptomycin b，lmb)处理肝癌细胞，探究肝癌细胞中inpp5f是否存在出核转运。免疫荧光检测lmb处理后inpp5f在肝癌细胞的定位，发现lmb使
肝癌细胞中的inpp5f被限制在细胞核中(图13b)。用western blot检测lmb处理后inpp5f在细胞核的表达量，发现lmb处理组细胞核表达量升高，进一步验证了肝癌细胞中inpp5f存在出核转运，且lmb可以抑制该过程(图13c)。随后用western blot检测出核转录被抑制后，inpp5f下游信号通路及相关分子是否受影响，发现lmb将inpp5f限制于细胞核中可抑制notch信号传导(图13d)。最后用平板细胞克隆形成实验来鉴定lmb抑制inpp5f出核转运对肝癌细胞增殖能力的影响，结果表明lmb处理细胞后肝癌细胞形成的克隆集落显著减少(图13e-13f)。这些结果说明抑制inpp5f从细胞核转运细胞质可影响其下游信号通路的转导进而影响其生物学功能。
420.为进一步确认inpp5f从细胞核转运到细胞质可促进肝细胞癌生长，通过生物信息学网站对inpp5f氨基酸序列中的核定位信号nlss和核输出信号ness进行预测，并根据预测构建了一个保留潜在nlss但对ness序列进行突变的突变体和三个保留ness但截短了nlss序列的截短体(图14a)。用免疫荧光检测突变体和截短体质粒处理后的肝癌细胞的中inpp5f的亚细胞定位，其结果显示ness序列突变体将inpp5f蛋白限制在了细胞核中，而截短序列2和3(不包括截短1)使inpp5f蛋白出核转运增强，细胞核中的inpp5f蛋白减少，细胞质中的inpp5f蛋白增多(图14b)。用western blot检测细胞核中inpp5f蛋白表达量，结果与免疫荧光一致，突变体的细胞核中inpp5f蛋白减少，而截短体2、3的细胞核中inpp5f蛋白增加(图14c)，这说明ness序列促进inpp5f的出核转录，nlss序列则与inpp5f转运入核相关，且nlss序列可能位于inpp5f氨基酸序列的83至113位置。然后用western blot和rt-pcr法检测inpp5f下游分子表达情况。结果表明相较于野生型inpp5f，ness突变抑制下游nicd，hes1，hey1，c-myc和cyclin e1的表达，nlss截短体2和3则显着上调这些分子的表达(图14d-14e)。最后鉴定inpp5f的ness与nlss对其生物功能的影响。平板细胞克隆形成实验发现，与ness突变体组相比，nlss截短体(特别是截短体2和3)质粒处理的肝癌细胞克隆集落形成数目显著增多(图14f)。同样，乳酸生成量和葡萄糖消耗量测定结果显示与ness突变体组相比，ness突变体组的乳酸产生和葡萄糖消耗显著增加，即有氧糖酵解增强(图14g-14h)。综上所述，数据表明在肝癌细胞中存在inpp5f从细胞核转运到细胞质的过程，是inpp5f在肝细胞癌中发挥促癌功能的关键步骤之一。
421.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。