一种利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用与流程

1.本发明涉及微生物学及生物纳米硒制备技术领域，尤其是涉及一种利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的有机液体肥料制作方法及其应用。


背景技术：

2.硒（selenium）元素是动物和人类所必须的一种微量元素，与人体内多种代谢途径相关。人体缺硒会造成多种疾病，如肌肉萎缩、心血管、骨骼或免疫系统疾病，并增加患癌风险，而硒过量也会对人体造成严重毒害。人体对硒有比较窄的适应范围，中国营养学会及fao/who/iaea联合专家委员会确定人体摄入量适宜范围为60-250μg/d，安全剂量为400μg/d，中毒剂量为800μg/d。由于我国版图存在一条天然的缺硒带，硒分布极不均衡，缺硒地区人群每日硒摄入量严重不足，安全高效补硒对我国缺硒地区人群来说已刻不容缓。
3.自然界中硒具有多种形态，负二价的硒化物包括硒化氢(h2se)、金属硒化物、甲基硒和硒代氨基酸等；四价硒主要有seo2、h2seo3和seo
32-几种形态；六价硒主要有h2seo4和seo
42-。在工业生产中，灰色单质硒可通过氧化负二价形态的硒和还原四价、六价形态的硒制得。近年来，人们通过化学、物理的方法制备出红色纳米硒，也发现多种微生物(真菌、细菌、放线菌)可以转化六价及四价无机硒盐为红色纳米硒。
4.研究发现，大鼠口服亚硒酸钠的半致死量约为7mg/kg，硒甲基半胱氨酸的半致死量约为15mg/kg，硒代蛋氨酸的半致死量约为26mg/kg，而化学合成的纳米硒的半致死量约为105mg/kg。由于纳米硒与硒代蛋氨酸在血液、肝脏、肾脏等器官中的生物活性无明显差异，且纳米硒在抑制肿瘤方面效果显著且优于硒代蛋氨酸，因此，纳米硒具有相对于无机及有机硒更为安全有效的补硒优势。
5.生物纳米硒是通过微生物转化还原无机硒并经过分离纯化得到的单质态纳米硒。生物纳米硒自身无毒、生物活性高、比表面积大、安全高效等特点，更优于其他硒源。由于生物纳米硒在人体补硒方面的优势显著，以及微生物转化具有安全高效环保等特点，现已有许多关于微生物转化纳米硒的研究报导。但是已有报道都未进行后期工厂化生产及应用的研究。


技术实现要素：

6.本发明设计了一种利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用，其解决的技术问题是现有技术中没有通过微生物转化还原无机硒并经过分离纯化得到的单质态纳米硒的应用。
7.为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：一种利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法，其包括以下步骤：步骤1、用培养基对菌种活化培养；步骤2、将步骤1所得活化培养液制备成种子液；步骤3、将步骤2所得种子液发酵；
步骤4、从步骤3发酵产物中分离纯化纳米硒。
8.优选地，步骤1中，将菌株bs8900接种于nsb培养基斜面上，37℃使用zfm培养基对菌株进行活化培养16小时以上。
9.优选地，步骤1中，zfm培养基的配方为：葡萄糖5g/l，酵母浸出物5g/l，蛋白胨10g/lkh2po40.9g/l，k2hpo40.9g/l，琼脂15g/l，ph 7.0-7.2。
10.优选地，步骤2中，将活化好的bs8900菌株用无菌pbs7.0缓冲液配制成108cfu/ml的菌悬液，以1％的接种量接种于fm液体培养基中，37℃摇床震荡培养，转速为225rpm，培养时间为12h。
11.优选地，步骤2中，fm液体培养基配方为：葡萄糖5g/l，酵母浸出物5g/l，蛋白胨10g/lkh2po40.9g/l，k2hpo40.9g/l，na2seo
3 20mm，ph 7.0-7.2。
12.优选地，步骤3中，控制hr发酵培养基体积为发酵罐体积的80％，将步骤2所得种子液按照3.3％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为37℃，搅拌速度为120rpm，发酵液体积：每分钟通气量体积为1：0.2，罐压0.05mp，发酵48-60小时。
13.优选地，步骤3中，hr发酵培养基配方为：葡萄糖15g/l，酵母浸出物5g/l，蛋白胨10g/lkh2po40.9g/l，k2hpo40.9g/l，na2seo38mm，ph 7.0-7.2。
14.优选地，步骤4中，发酵液下罐，将收集的红色沉淀用pbs7.0缓冲液悬浮，经100kd中空纤维膜超滤循环2-3遍，并用发酵液1/10体积的水重悬沉淀，浓缩纳米硒浓度为发酵浓度的10倍，达到50mm；所得菌悬液放置回发酵罐，蒸汽加热至90摄氏度，搅拌速度为250rpm，保持1小时；然后快速冷却至25摄氏度，搅拌速度为250rpm；即得菌体裂解液及纳米硒溶液，经过7kd中空纤维膜超滤所得纳米硒溶液。
15.一种纳米硒溶液，其特征在于：使用上述方法合成。
16.一种富硒有机液体肥料，其特征在于：包括纳米硒溶液，生物纳米硒所占含量为2000μg/ l。
17.该利用枯草芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用具有以下有益效果：1、本发明方法能够高产的纳米硒菌种属于益生菌，可应用于医药行业，食品行业，饲料行业，肥料行业，化妆品行业等相关领域。
18.2本发明方法菌种生物合成纳米硒的产量高于目前文献报道的800ug/l。
附图说明
19.图1：本发明使用的生物合成纳米硒菌种bs8900照片；该菌种属于枯草芽孢杆菌；图2：本发明使用的菌种bs8900的电子显微镜图片；菌体在电镜中形态为杆状；图3：本发明不同浓度亚硒酸钠下的菌种图。
具体实施方式
20.下面结合图1至图2，对本发明做进一步说明：本发明从陕西省安康市绞股蓝富硒茶种植基地土壤中分离得到一株可耐受较高浓度亚硒酸钠的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)bs8900，菌株bs8900 经过发酵培养基
中六价和/或四价无机硒盐的浓度为0.001-70mm，优选1-20mm梯度结合紫外诱变试验，生物合成纳米硒的方法，所述方法是从发酵产物中分离纯化纳米硒。所述发酵产物包括发酵液经100kd中空纤维膜超滤所得菌体浓缩物，菌悬液以及经过7kd中空纤维膜超滤所得菌体裂解液。
21.如图3所示，亚硒酸钠（摩尔浓度mmol）为50，紫外诱变，40，30，20，5的筛选图，以及紫外诱变得到的菌种图，从左至右，从上至下。
22.本发明提供的利用枯草芽孢杆菌bs8900生物合成纳米硒的方法，包括以下步骤：s1、菌种活化：用zfm培养基对菌株进行活化培养，zfm培养基配方为：葡萄糖5g/l，酵母浸出物5g/l，蛋白胨10g/l，kh2po40.9g/l，k2hpo40.9g/l，琼脂15g/l，ph 7.0-7.2；将菌株bs8900接种于nsb培养基斜面上，37℃培养16小时。
23.s2、种子液的制备：种子培养用fm液体培养基，fm液体培养基配方为：葡萄糖5g/l，酵母浸出物5g/l，蛋白胨10g/l ，kh2po40.9g/l，k2hpo40.9g/l，na2seo
3 20mm ，ph 7.0-7.2；将活化好的bs8900菌株用无菌pbs7.0缓冲液配制成108cfu/ml的菌悬液，以1％的接种量接种于fm液体培养基中，37℃摇床震荡培养，转速为225rpm，培养时间为12h。
24.s3、发酵罐发酵：发酵培养采用hr发酵培养基，hr发酵培养基配方为：葡萄糖15g/l，酵母浸出物5g/l，蛋白胨10g/lkh2po40.9g/l，k2hpo40.9g/l，na2seo38mm ph 7.0-7.2；控制培养基体积为发酵罐体积的80％，将种子液按照3.3％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为37℃，搅拌速度为120rpm，通气量为1：0.2 (发酵液体积：每分钟通气量体积)，罐压0.05mp，发酵48-60小时。纳米硒产量可达5mm。
25.s4、从发酵产物中分离纯化纳米硒：从发酵产物中分离纯化生物纳米硒的方法如下：发酵液下罐，经100kd中空纤维膜超滤收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用pbs7.0缓冲液悬浮，经100kd中空纤维膜超滤循环2-3遍，并用发酵液1/10体积的水(优选纯净水)重悬沉淀，浓缩纳米硒浓度为发酵浓度的10倍，达到50mm。所得菌悬液放置回发酵罐，蒸汽加热至90度，搅拌速度为250rpm，保持1小时。然后快速冷却至25度，搅拌速度为250rpm。即得菌体裂解液及纳米硒溶液，经过7kd中空纤维膜超滤所得纳米硒溶液。
26.本发明提供由所述生物纳米硒溶液制备的富硒有机肥料，生物纳米硒所占含量为2000μg/ l。
27.在本发明的一个具体实施方式中，将生物纳米硒含硒量为0.1g/l溶液100l，配制成2000μg/ l的5吨富硒有机液体肥料，表1显示亚硒酸钠对应的含量时，获得不同产量的纳米硒。
28.步骤2和步骤3中都使用到亚硒酸钠，亚硒酸钠中的硒属于无机硒，作为培养基中的一种底物，通过菌种bs8900的培养，将无机硒生物转化为纳米硒。含量达到亚硒酸钠50mmol时，bs8900停止生长，属于转化能力为0，得不到纳米硒。
29.上面结合附图对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。