一种非程序细胞冻存液及其应用方法与流程

1.本发明涉及细胞及生物工程学技术领域，具体为一种非程序细胞冻存液及其应用方法。


背景技术：

2.细胞冻存是生物研究中的重要环节之一，它对人工培养细胞的冻存、防止由于细胞传代培养所导致的细胞退化、防止传代培养中的细菌污染、解决维持传代培养过程中的一系列问题具有重要作用。
3.传统细胞冻存液是培养基、血清和dmso按照一定比例混合而成，因其中的血清成分复杂、批次差异大等缺点，其应用具有局限性，且需采用程序性降温的冻存方法，费时费力。


技术实现要素：

4.针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种非程序细胞冻存液及其应用方法，该非程序细胞冻存液无需配制，即取即用，批次差异极小，无动物来源病毒、霉菌和支原体等污染风险，化学成分明确，无蛋白，可以适用于临床，冻存细胞复苏后的存活率也有明显提高；且该无蛋白非程序细胞冻存液不需要程序性降温的冻存液，用于各种常规哺乳动物细胞的冻存，尤其适合于无血清培养的干细胞、免疫细胞、蛋白表达细胞的冻存。
5.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种非程序细胞冻存液，每100ml所述细胞冻存液中包括l抗坏血酸钠0.01g、d-生物素0.0001g、氯化胆碱0.001g、叶酸0.001-0.01g、肌醇1-20g、烟酰胺0.0005-0.005g、维生素b120.0001-0.005g、d-泛酸钙0.0005-0.005g、盐酸吡哆醛0.0005-0.005g、盐酸吡哆醇0.00001-0.0001g、核黄素0.00005-0.0005g、盐酸硫铵0.0005-0.005g、次黄嘌呤0.0001-0.005g、蔗糖10-100g、丙二醇20-200g、羧甲基纤维素钠0.5-5g和余量的水。
6.本发明一种非程序细胞冻存液的应用方法，具体包括下列步骤：
7.步骤一、细胞冻存：冻存前，请确保细胞处于对数生长期；
8.步骤二、细胞复苏。
9.进一步地，所述细胞冻存包括贴壁细胞冻存和悬浮细胞冻存。
10.进一步地，所述贴壁细胞冻存具体包括下列步骤：
11.(1)贴壁细胞制备细胞悬液：
12.(a)将旧培养基吸除，用pbs清洗两遍；
13.(b)在培养瓶中加入胰酶，以能覆满瓶底为限；平置于培养箱中消化1～2分钟，期间在显微镜下观察，若发现细胞间隙增大、细胞变圆、比较松动后，立即终止消化，个别难消化细胞需延长消化时间，但要避免消化过度；
14.(c)加入适量温浴好的完全培养基终止消化，轻轻吹打均匀细胞，使贴壁细胞成为悬浮细胞；
15.(2)贴壁细胞的冻存：
16.(a)取少量细胞悬液细胞计数，算出细胞总数和所需细胞冻存液的量，细胞的冻存密度以1
×
106～2
×
107个细胞/ml为宜；
17.(b)将所需量的细胞悬液在200～500xg的离心速度下离心3-5分钟，弃上清收集细胞，离心速度和时间取决于细胞类型；
18.(c)向步骤(b)得到的细胞沉淀中加入适量非程序细胞冻存液，轻轻吹打以重悬细胞，分装于无菌细胞冻存管中，严密封口后，注明细胞名称、代数、日期；
19.(d)直接置于-80℃冰箱中储存，细胞可至少保存一年；或-80℃过夜后，将细胞投入液氮中长期储存。
20.进一步地，所述悬浮细胞冻存具体包括下列步骤：
21.(a)取少量细胞悬液细胞计数，算出细胞总数和所需细胞冻存液的量，细胞的冻存密度以1
×
106～2
×
107个细胞/ml为宜；
22.(b)将所需量的细胞悬液在200～500xg的离心速度下离心3-5分钟，弃上清收集细胞，离心速度和时间取决于细胞类型；
23.(c)向步骤(b)得到的细胞沉淀中加入适量非程序细胞冻存液，轻轻吹打以重悬细胞，分装于无菌细胞冻存管中，严密封口后，注明细胞名称、代数、日期；
24.(d)直接置于-80℃冰箱中储存，细胞可至少保存一年；或-80℃过夜后，将细胞投入液氮中长期储存。
25.进一步地，步骤二所述细胞复苏具体包括下列步骤：
26.(1)自液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管，检查盖子是否旋紧，立即放入37℃水浴中快速解冻(避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡)，轻摇冷冻管使其在1～2分钟内全部融化，以75％酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内；
27.(2)将解冻的细胞悬液移至15ml无菌离心管中，再加入5～10ml预热好的完全培养基，轻轻混合均匀，200～500xg，离心3-5分钟，弃上清收集细胞，离心速度和时间取决于细胞类型；
28.(3)加入预热好的完全培养基，混合均匀，转移到细胞培养皿或培养瓶中，置于细胞培养箱培养。
29.采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的一种非程序细胞冻存液及其应用方法，与传统细胞冻存液相比本发明具有明显优势，本发明提供的无蛋白非程序细胞冻存液采用渗透性保护剂、非渗透性保护剂、细胞沉降稳定剂、细胞膜保护剂组合的方案对细胞进行全方位低温保护，可使冻存过程中溶液冰点降低，提高细胞膜对水的通透性，使细胞内水分在冻结前透出细胞，防止或减少冰晶对细胞的损伤，同时降低冰冻时细胞周围电解质浓度，避免电解质损伤，还可以延缓冻存过程中细胞的互相挤压，保护细胞膜，从而有效提高细胞复苏率和活力。
30.本发明提供的非程序细胞冻存液具有以下优点：
31.(1)安全——无血清，无动物源成分，无蛋白，化学成分明确；
32.(2)高效——有效提高细胞复苏存活率，大部分细胞(包括间充质干细胞)复苏率可达90％以上；
33.(3)稳定——不影响干细胞表型和生长状态，且可维持干细胞的多分化性；
34.(4)便捷——即用型产品，且无需程序性降温，可直接-80℃过夜后转移至液氮中长期保存；
35.(5)质优——严格的质量控制，产品性能媲美进口；原料均选用自产或者经过严格检测和纯化的低内毒素高纯药用级别原料；注射用水配置，符合cgmp规定生产，工艺稳定，批差异小。原装包装瓶，优秀的密闭性及内部涂层保护，极大的保证了产品的稳定性；
36.(6)可靠——已有干细胞、免疫细胞、肿瘤和转化细胞系等多种细胞的冻存应用。
附图说明
37.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
38.图1为本发明提出的一种非程序细胞冻存液及其应用方法的细胞冻存步骤的流程图；
39.图2为本发明提出的一种非程序细胞冻存液及其应用方法的细胞复苏步骤的流程图。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
42.一种非程序细胞冻存液，每100ml所述细胞冻存液中包括l抗坏血酸钠0.01g、d-生物素0.0001g、氯化胆碱0.001g、叶酸0.001-0.01g、肌醇1-20g、烟酰胺0.0005-0.005g、维生素b120.0001-0.005g、d-泛酸钙0.0005-0.005g、盐酸吡哆醛0.0005-0.005g、盐酸吡哆醇0.00001-0.0001g、核黄素0.00005-0.0005g、盐酸硫铵0.0005-0.005g、次黄嘌呤0.0001-0.005g、蔗糖10-100g、丙二醇20-200g、羧甲基纤维素钠0.5-5g和余量的水。
43.本发明一种非程序细胞冻存液的应用方法，具体包括下列步骤：
44.步骤一、细胞冻存(见图1)：冻存前，请确保细胞处于对数生长期；
45.(1)贴壁细胞制备细胞悬液(悬浮细胞请忽略此步骤)：
46.(a)将旧培养基吸除，用pbs清洗两遍；
47.(b)在培养瓶中加入胰酶，以能覆满瓶底为限；平置于培养箱中消化1～2分钟，期间在显微镜下观察，若发现细胞间隙增大、细胞变圆、比较松动后，立即终止消化，个别难消化细胞需延长消化时间，但要避免消化过度；
48.(c)加入适量温浴好的完全培养基终止消化，轻轻吹打均匀细胞，使贴壁细胞成为悬浮细胞；
49.(2)贴壁细胞和悬浮细胞的冻存：
50.(a)取少量细胞悬液细胞计数，算出细胞总数和所需细胞冻存液的量，细胞的冻存密度以1
×
106～2
×
107个细胞/ml为宜；
51.(b)将所需量的细胞悬液在200～500xg的离心速度下离心3-5分钟，弃上清收集细胞，离心速度和时间取决于细胞类型；
52.(c)向步骤(b)得到的细胞沉淀中加入适量非程序细胞冻存液，轻轻吹打以重悬细胞，分装于无菌细胞冻存管中，严密封口后，注明细胞名称、代数、日期；
53.(d)直接置于-80℃冰箱中储存，细胞可至少保存一年；或-80℃过夜后，将细胞投入液氮中长期储存；
54.步骤二、细胞复苏(见图2)：
55.(1)自液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管，检查盖子是否旋紧，立即放入37℃水浴中快速解冻(避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡)，轻摇冷冻管使其在1～2分钟内全部融化，以75％酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内；
56.(2)将解冻的细胞悬液移至15ml无菌离心管中，再加入5～10ml预热好的完全培养基，轻轻混合均匀，200～500xg，离心3-5分钟，弃上清收集细胞，离心速度和时间取决于细胞类型；
57.(3)加入预热好的完全培养基，混合均匀，转移到细胞培养皿或培养瓶中，置于细胞培养箱培养。
58.要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固有的要素。
59.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。